Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" -projektet) og af INRAE HOLOFLUX ("Holopig" -projektet). Forfatterne er taknemmelige for Genotoul kernefaciliteter (TRI). Vi anerkender Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) for omhyggelig korrekturlæsning.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol beskriver en metode, der anvendes til at kryopræservere epitelkrypter fra smågrisetarmen til langtidsopbevaring og efterfølgende dyrkning af 3D-organoider. Denne protokol bruger en fryseopløsning, der indeholder DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hæmmeren, DMEM og antibiotika. En anden undersøgelse hos svin opnåede organoider fra krypter, der var kryopræserveret i en lignende fryseopløsning, men uden ROCK-hæmmeren15. Y27632 ROCK-hæmmeren blev inkluderet for at forhindre apoptose og opretholde stamcellepuljen, da epitelkryptceller efter optøning dissocieres, hvilket kan føre til celledød ('anoikis')27,28. Interessant nok er hesteenteroider opnået fra epitelkrypter frosset i et dyrkningsmedium, der kun indeholder DMEM og DMSO16; Denne enkle metode er endnu ikke testet for svineepitelkrypter. Andre metoder er blevet offentliggjort til dyrkning af humane og svineorganoider fra frosne væv eller biopsier i stedet for epitelkrypter 4,17. Fordelen ved denne metode er evnen til direkte at kryopræservere tarmvævene uden at udføre kryptisoleringsproceduren, hvilket kræver tid og laboratorieudstyr. Dette kan være praktisk, når vævene skal indsamles langt fra laboratoriet. Ved isolering af krypterne umiddelbart efter slagtning kan store dele af tarmen imidlertid behandles for at opnå et meget højt antal krypter, hvilket ikke er tilfældet, når man starter fra små frosne vævsfragmenter. Efter optøning af epitelkrypter blev organoider observeret fra 3-4 dage efter såning og opdelt efter 10 dage. Dette er en langsommere væksthastighed end ved start af kulturen fra friske epitelkrypter, for hvilke organoiderne blev opnået fra dag 1 efter såning og kan normalt opdeles omkring dag 511. Khalil et al. rapporterede også en forsinket vækst af svineenteroider, når de startede fra frosne krypter15, hvilket tyder på, at stamceller kan kræve tid til at genvinde deres proliferative kapacitet. Vi opnåede også et lavere antal organoider, når vi startede fra frosne krypter sammenlignet med friske krypter, hvilket kan skyldes stamcellernes død under fryseprocessen. I nogle forsøg på optøning af krypter (<20%) fik vi ikke organoider fra frosne krypter, sandsynligvis på grund af en suboptimal kryopræserveringsprocedure (f.eks. forsinket frysning efter kryptisolering på sandsynligvis mere end 1 time). Derfor anbefaler vi at holde krypterne på is, indtil de tæller, og fryse dem så hurtigt som muligt.
Til 3D-organoider valgte vi at bruge et kommercielt organoidkulturmedium formuleret til mennesker. Faktisk har tidligere rapporter vist, at svins tarmorganoider vokser effektivt med dette medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Det er af interesse for dette dyrkningsmedium at være klar til brug og have en standardiseret koncentration af vækstfaktorer inden for en batch. Dette kulturmedium er imidlertid dyrt, dets sammensætning er ikke afsløret, og det er således ikke muligt at modulere dets sammensætning. I modsætning hertil har andre undersøgelser dyrket svinetarmorganoider i tilpassede medier indeholdende farmakologiske hæmmere, rekombinant vækstfaktor og / eller konditionerede medier 5,6,7,21. Selv om denne metode er meget fleksibel og billigere, er den tidskrævende til fremstilling af konditionerede medier og kan mangle reproducerbarhed på grund af potentiel variation i koncentrationen af vækstfaktorer i konditionerede medier. Kvaliteten af hver batch af konditionerede medier bør således valideres ved måling af organoidvækst eller markørgenekspression31.
En undersøgelse har vist, at svinejejunalorganoider dyrket i det samme kommercielle organoidkulturmedium, der anvendes her, voksede hurtigere og syntes mindre differentieret sammenlignet med enteroider dyrket med medier, der indeholdt rekombinant vækstfaktor og / eller konditionerede medier23. En høj proliferativ tilstand letter kulturen af 3D-organoider, men kan kræve inducerende differentiering for at være mere repræsentativ for intestinale fysiologiske egenskaber. I denne protokol, for passage af 3D-organoider, er cellerne fuldt dissocieret til tælling, hvilket gør det muligt at kontrollere antallet af celler podet i ECM. Dette øger reproducerbarheden af fænotypen af organoider, som er stærkt påvirket af deres densitet. Desuden undgår man at tælle cellerne for at opnå for lav eller en overfyldt kultur, der kræver tilpasning af kulturplanen. De fleste andre undersøgelser forberedte organoidfragmenter, der ikke var fuldt dissocieret til enkeltceller, og anvendte et fortyndingsforhold til passering. Denne metode er mere ligetil, men kan fremkalde variabilitet i henhold til kulturens organoidtæthed.
Til kulturen i monolag podes organoidceller i kulturindsatser, der er forbelagt med et tyndt lag ECM, der tillader fastgørelse af celler, men undgår vækst af organoider i 3D. Denne protokol anvendte kollagen type IV som et ECM-protein, som beskrevet tidligere hos svin23. Andre undersøgelser med svineorganoide monolag brugte den samme tumorafledte ECM, der blev brugt her, til dyrkning af 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fordelen ved at anvende kollagen er evnen til at standardisere proteinkoncentrationen med en fuldt defineret sammensætning, hvilket ikke er tilfældet i den tumorafledte ECM. Et kritisk skridt for succesen med kulturen af cellemonolag er at være opmærksom på det visuelle udseende af forløberen 3D-organoider, som skal have veldefinerede kanter og et tomt lumen uden sort affald. Faktisk er organoider med et højt modningsniveau og en lav proliferativ hastighed ikke en passende kilde til celler til 2D-kultur. Således er tidspunktet for dissociation af 3D-organoider i enkeltceller afgørende for succesen med dette trin.
Kulturen af 2D-monolag fra enkeltceller tillader standardisering af antallet af frøede celler, hvilket er vanskeligere, når man starter fra organoidfragmenter, som udført i nogle andre metoder. Vi såede 7,6 x 10 5 celler pr. cm 2, hvilket er højt sammenlignet med de fleste andre undersøgelser 21,22,23 hos svin, der brugte en lavere celletæthed, der spænder fra0,25 x 10 5 celler pr. cm 2 til 1,78 x 10 5 celler pr. cm 2. Kravet om et stort antal organoidceller udgør en begrænsning af denne protokol, men det tillod os hurtigt at opnå et sammenflydende monolag, der fuldt ud dækker kulturindsatsen efter 1 dag. I modsætning hertil opnåede Vermeire et al.23 sammenløb efter 4-7 dage med en lavere tæthed af celler podet (fra 0,25 x 10 5 celler / cm 2 til 0,4 x 105 celler /cm 2). Nogle undersøgelser har også brugt svineorganoidcellemonolag, der ikke fuldt ud dækkede dyrkningsoverfladen for infektioner med vira 8,30. Under disse forhold er den apikale side af epitelceller tilgængelig til behandlinger, men fuldt sammenflydende monolag er påkrævet, hvis målet er at studere næringsstofabsorption eller epitelpermeabilitet.
Til organoidcellemonolag blev der anvendt et kommercielt organoidkulturmedium suppleret med 20% FBS, baseret på en nylig undersøgelse af bovin enteroidafledte monolag32. I vores test var tilskuddet med 20% FBS nødvendigt for at opnå fuldt sammenflydende monolag, sandsynligvis på grund af et højt vækstfaktorkrav. Tværtimod har andre undersøgelser, der bruger det samme kommercielle medium, etableret monolag uden yderligere FBS 8,25,30, men uden at nå fuld sammenløb. Andre undersøgelser har også brugt tilskud med 20% FBS i et tilpasset medium til dyrkning af svineorganoidcellemonolag21,22. I vores eksperimenter er TEER høj 1 dag efter såning (ca. 700 Ω·cm 2) og forbliver høj indtil dag 3 (ca. 1.500 Ω·cm2; dette er i overensstemmelse med dannelsen af tætte kryds, som indikeret ved ekspressionen af okklusion. Van der Hee et al. opnåede lignende TEER-værdier over 72 timer for jejunum organoidcellemonolag21. De viste også, at monolag kan opretholdes indtil dag 12-15 med daglige medieændringer. I modsætning hertil har andre undersøgelser rapporteret meget lavere TEER-værdier (ca. 200 Ω·cm2) for svineorganoidcellemonolag 6,22. Disse forskelle mellem undersøgelser kan være relateret til det undersøgte tarmsegment eller til de anvendte medier, der påvirker epiteldifferentiering.
Afslutningsvis letter ovennævnte protokol til dyrkning af svineintestinale 3D-organoider fra frosne epitelkrypter tilrettelæggelsen af kulturarbejdet. Det reducerer behovet for frisk væv, der skal opnås fra levende dyr. Vi forklarer også, hvordan man etablerer fuldt sammenflydende cellemonolag afledt af svineorganoider på mindre end 3 dage. Således kan vores protokoller være nyttige ressourcer for forskere, der studerer svinets tarmepitel til veterinær eller biomedicinsk forskning.

Tarmepitelet er dannet af et monolag af celler, der dækker fordøjelsesslimhinden ved grænsefladen med lysmiljøet. Denne position er forbundet med forskellige funktioner, såsom næringsstofabsorption og barrierefunktion, der understøttes af tilstedeværelsen af stamceller og flere differentierede epitelcelletyper (absorberende, enteroendokrine, Paneth og bægerceller)1. Udødeliggjorte cellelinjer, der traditionelt anvendes til at studere epitelceller, har store begrænsninger, da de ikke afspejler tarmepithelets cellulære kompleksitet og præsenterer genomiske abnormiteter2. Udviklingen af tredimensionelle (3D) organoider af Sato et al.3 gav en ny model til at studere tarmepitelet med en forbedret fysiologisk relevans. Faktisk er intestinale organoider afledt af ikke-transformerede stamceller, består af flere celletyper og rekapitulerer funktionaliteten af tarmepitelet. Intestinale organoider bruges i stigende grad til at forstå udviklingen og funktionerne i tarmepitelet og dets interaktioner med patogener, næringsstoffer, toksiner, lægemidler, mikrobiotaen og dets metabolitter2.
Oprindeligt udviklet til mennesker og mus, er de metoder, der anvendes til dyrkning af tarmorganoider, for nylig blevet tilpasset andre arter, herunder svin4. Gonzales et al.5 var de første til at dyrke svineorganoider fra jejunum ; Siden da er svineorganoider blevet beskrevet for andre tarmsegmenter (tolvfingertarmen, ileum og tyktarmen)6,7,8 og har vist sig at bevare en placeringsspecifik fænotype 9,10,11. Svinetarm 3D-organoider bruges nu almindeligvis til at studere effekten af næringsstoffer 12,13 eller enteriske infektioner 6,8,14.
De fleste af undersøgelserne har beskrevet kulturen af intestinale organoider startende fra frisk isolerede epitelkrypter. Dette er imidlertid ikke altid muligt af logistiske årsager, navnlig når man arbejder med store dyr som svin. Faktisk kan dyrefaciliteter til svin være placeret langt fra laboratoriet, hvor organoider dyrkes, hvilket komplicerer arbejdsorganisationen. Desuden er organoidkultur tidskrævende; Det er således ikke praktisk samtidig at dyrke flere organoide linjer, for eksempel fra forskellige tarmsegmenter eller flere dyr. For at omgå disse problemer har nogle få undersøgelser hos mennesker, heste og svin beskrevet metoder til dyrkning af organoider fra frosne tarmvæv (eller biopsier) eller fra isolerede epitelkrypter 4,15,16,17. Disse metoder tillader kryopræservering af intestinale epitelstamceller fra flere tarmsegmenter af et enkelt dyr, som derefter kan bruges til at dyrke organoider, når det er nødvendigt. Desuden giver dette mulighed for en kraftig reduktion i antallet af levende dyr, der anvendes som donorer af stamceller, da der kan oprettes store lagre af kryopræserverede krypter (principperne i 3R). En anden fordel ved denne metode er væksten af intestinale organoider kun fra dyr af interesse efter opnåelse af fænotypiske eller genotypiske resultater, hvilket er yderst omkostningseffektivt.
In vivo polariseres tarmepitelceller med den apikale side rettet mod lumen. In vitro, i 3D-organoider, vender den apikale side af epitelceller også mod lumen (dvs. inde i organoiderne)4. Denne organisation forhindrer adgang til den apikale side, hvilket er et problem, når man studerer virkningerne af luminale komponenter (fx næringsstoffer, mikrober, metabolitter) på epitelceller. For at omgå denne ulempe er der udviklet flere metoder, såsom dyrkning af organoidceller som 2D-monolag, mikroinjektion og polaritetsvending ("apikale organoider")18,19. Kulturen af organoide cellemonolag fremstår som det mest effektive og medgørlige system. Princippet er at adskille 3D-organoider i enkeltceller og frø dem på en cellekulturbeholder, der tidligere er belagt med et tyndt lag ekstracellulær matrix (ECM)20. Under disse dyrkningsforhold vender den apikale side af epitelcellerne opad og er således tilgængelig for eksperimentelle behandlinger20. Kulturen af organoidcellemonolag blev for nylig tilpasset svinetarmen21,22; cellemonolag afledt af svin 3D-organoider er blevet brugt til flere applikationer, herunder undersøgelse af enteriske infektioner 6,23,24,25, transport af næringsstoffer9 og modellering af fordøjelsessygdomme 26.
Her præsenterer denne undersøgelse først en detaljeret protokol for dyrkning og vedligeholdelse af svins intestinale 3D-organoider afledt af kryopræserverede epitelkrypter (figur 1). Derefter beskrives en protokol for at etablere cellemonolag fra svintarm 3D-organoider. De her beskrevne metoder giver eksperimentelle værktøjer, der kan bruges til at studere grisens tarmepitel for næringsstoftransport, barrierefunktion og værtsmikroorganismeinteraktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Intestinale organoider bruges i stigende grad til at studere tarmepitelet til modellering af fordøjelsessygdomme eller til at undersøge interaktioner med lægemidler, næringsstoffer, metabolitter, patogener og mikrobiotaen. Metoder til dyrkning af tarmorganoider er nu tilgængelige for flere arter, herunder svin, som er en art af stor interesse både som husdyr og som en translationel model for mennesker, for eksempel til at studere zoonotiske sygdomme. Her giver vi en dybdegående beskrivelse af en procedure, der anvendes til dyrkning af svins tarm 3D-organoider fra frosne epitelkrypter. Protokollen beskriver, hvordan man kryopræserverer epitelkrypter fra svinetarmen og de efterfølgende procedurer til dyrkning af 3D tarmorganoider. De vigtigste fordele ved denne metode er (i) den tidsmæssige dissociation af isoleringen af krypter fra kulturen af 3D-organoider, (ii) forberedelsen af store lagre af kryopræserverede krypter afledt af flere tarmsegmenter og fra flere dyr på én gang og dermed (iii) reduktionen i behovet for at prøve frisk væv fra levende dyr. Vi beskriver også en protokol til etablering af cellemonolag afledt af 3D-organoider for at give adgang til den apikale side af epitelceller, som er stedet for interaktioner med næringsstoffer, mikrober eller lægemidler. Samlet set er protokollerne beskrevet her en nyttig ressource til undersøgelse af svinets tarmepitel i veterinær og biomedicinsk forskning.

I henhold til protokollen beskrevet ovenfor opnås epitelkrypter fra svinetarmen og kryopræserveres til langtidsopbevaring i flydende nitrogen (figur 1 og figur 2A). Efter optøning podes kryptstamcellerne i ECM (figur 2B). Kryptstrukturen går normalt tabt efter dette trin på grund af opløsningen af kryptstrukturen i ECM. Organoiderne kan observeres inden for 3-4 dage og vokser derefter hurtigt og udvikler spirende strukturer (figur 2B). Vi opnåede med succes organoider efter optøning af frosne krypter i >80% af forsøgene. Ca. 10 dage efter optøning (ifølge organoidernes væksthastighed) udføres en passage af organoider for at udvide kulturen (figur 3). Organoiderne vokser hurtigere efter opdeling, og de præsenterer forskellige morfologier, med nogle cystiske og et flertal af spirende organoider. For optimal vedligeholdelse af kulturen skal organoiderne, der anvendes til passage, have et klart og tomt lumen og veldefinerede kanter (eksempler angivet med grønne pile) uden sort snavs i lumen (angivet med røde pile), som observeret hos modne organoider (figur 3). Vi fandt ud af, at sorte cellerester begynder at akkumulere omkring dag 6 efter passering. Således anbefales opdeling eller frysning af organoiderne på dag 4-5 efter passering.
Organoidernes modenhedsstadium er også et vigtigt punkt i opnåelsen af cellemonolag. Organoider med avanceret modenhed (indikeret ved tilstedeværelsen af sorte cellerester i lumen) er ikke optimale til frø monolag. Vi dissocierer normalt 3D-organoider 4 dage efter passage for at indsamle celler til 2D-kultur. Ca. en til tre brønde med 3D-organoider dyrket ved 3.000 celler pr. 50 μL kuppel på ECM er nødvendige til såning af en kulturindsats med 2,5 x 105 celler. Celler binder sig og danner et fuldt sammenflydende monolag inden for 1 dag (figur 4A), hvilket bekræftes af den høje TEER på ca. 700 Ω· cm2 (figur 4B). Imidlertid er cellekanterne vanskelige at visualisere ved brightfieldmikroskopi på dette tidlige tidspunkt, sandsynligvis på grund af et lavt differentieringsniveau. TEER forbliver høj i 3 dage (figur 4B).
Actinfarvning indikerer, at den apikale side af epitelcellerne er orienteret mod lumen i 3D-organoider (figur 5A). Organoidceller podet i kulturindsats danner et sammenflydende enkeltlag af epitelceller med den apikale side orienteret mod det øverste rum (figur 4B, C). Okklusionfarvning afslører tilstedeværelsen af tætte kryds på den apikale side af epitelcellerne i 3D-organoider og i cellemonolag (figur 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk gengivelse af de metoder, der anvendes til dyrkning af 3D-organoider og cellemonolag afledt af organoider. Epitelkrypter isoleres fra smågrisetarmen. Disse krypter kan i) bruges straks til dyrkning af 3D-organoider eller ii) fryses og opbevares i en biobank i flydende nitrogen. Kryopræserverede krypter kan optøs og bruges til dyrkning af 3D-organoider. 3D-organoidkulturen kan opretholdes med successiv opdeling eller fryses og opbevares i biobanken. Cellemonolag kan opnås fra 3D-organoidkulturen for at give adgang til den apikale side af cellerne og studere epitelbarrierefunktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figur 2: Dyrkning af svinetarm 3D-organoider fra kryopræserverede epitelkrypter. (A) Repræsentativt mikroskopisk billede af nyligt isolerede jejunale krypter. (B) Repræsentative mikroskopiske billeder af 3D-organoider opnået efter optøning af jejunalkrypterne. Organoiderne blev dyrket i en 25 μL kuppel af ECM i en 48-brønds plade. Figuren viser billeder af 3D-organoiderne 4, 7, 8, 9 og 10 dage efter såning. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figur 3: Morfologi af svinetarm 3D-organoider afledt af kryopræserverede epitelkrypter efter den første passage. Repræsentative mikroskopiske billeder, der viser udviklingen af organoider afledt af kryopræserverede jejunumkrypter efter den første passage fra dag 4 til dag 7. Grønne pile angiver klare organoider, der er egnede til passage eller såning af monolag. Røde pile angiver modne organoider, der ikke er egnede til opdeling eller såning af monolag; Således bør brønde anvendes før fremkomsten af denne morfologi. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figur 4: Karakteristik af cellemonolag afledt af svins intestinale 3D-organoider . (A) Repræsentative mikroskopiske billeder af monolagsmorfologien over 3 dage. Jejunum organoidceller blev podet ved 2,5 x 105 celler i 0,33 cm2 cellekulturindsatser belagt med kollagen IV ved 50 ng / ml. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. (B) Transepitelial elektrisk modstand (TEER) af organoidcellemonolag over 3 dage. Prikker forbundet med en linje svarer til den samme brønd på forskellige tidspunkter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figur 5: Billeddannelse af svinejejunumorganoider dyrket i 3D eller 2D. Konfokal mikroskopibilleddannelse af (A) 3D-organoider 5 dage efter opdeling og (B,C) organoidcellemonolag 3 dage efter såning (B: XZ-sektion; C: XY sektion). DNA (blå) blev farvet med DAPI. Actin (rød) blev farvet med phalloidin. Occludin (grøn) blev farvet med et polyklonalt antistof. Hvide pile angiver okklusion lokaliseret ved det stramme kryds. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Her beskriver vi en protokol til dyrkning af svins tarm 3D-organoider fra kryopræserverede epitelkrypter. Vi beskriver også en metode til at etablere cellemonolag afledt af 3D-organoider, hvilket giver adgang til den apikale side af epitelceller.

Kultur af pattegrise Intestinal 3D organoider fra kryopræserverede epitelkrypter og etablering af cellemonolag

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Vores protokol giver værktøjer til at studere svinets tarmepitel til veterinær og biomedicinsk forskning. Tarmorganoider fra svin kan bruges til at studere næringsstoftransport, barrierefunktion og værtsmikrobeinteraktioner. Gennem bevarelse af svin intestinal epitelkrypter giver mulighed for at skabe en stor bestand af stamceller, der senere kan bruges til at dyrke organoid i 3D eller 2D monolag.Denne protokol er detaljeret for jejunum, men den kan også bruges til andre tarmsegmenter såsom tolvfingertarmen, ileum og tyktarm. Til at begynde med skal du hurtigt optø et hætteglas indeholdende 900 frosne krypter i et vandbad ved 37 grader Celsius. Overfør kryptopløsningen til et 15 ml konisk rør.Der centrifugeres ved 300 x g i fem minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes. Tilsæt 150 mikroliter af den ekstracellulære matrix eller ECM med en afkølet spids for at opnå en endelig koncentration på 150 krypter pr. 25 mikroliter ECM. Pipet op og ned 10 gange for at opnå en homogen suspension af krypter i ECM.Frø seks brønde med et fald på 25 mikroliter pr. Brønd i en forvarmet 48-brøndplade. Inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid til polymerisering af ECM. Tilsæt en 250 mikroliter pr. Hul kultur af medium ved stuetemperatur og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Skift kulturmediet hver anden til tredje dag. For at passere 3D-organoider afledt af frosne krypter 10 dage efter såning skal du fjerne kulturmediet og tilføje 250 mikroliter forvarmet PBS ved 37 grader Celsius. Efter inkubation udskiftes PBS med 250 mikroliter forvarmet enzymdissociationsreagens suppleret med 10 mikromolær rockhæmmer ved 37 grader Celsius i hver brønd.Afmonter organoiderne i ECM ved at skrabe med en P-1000 pipette og homogeniseres forsigtigt ved pipettering fem gange. Inkuber i fem minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, før cellerne dissocieres ved pipettering op og ned 10 gange. Tilsæt 500 mikroliter DMEMc i hver brønd, der indeholder dissocierede celler, og træk op til 12 brønde i et 15 ml konisk rør indeholdende tre ml kold DMEMc.Der centrifugeres ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i en milliliter kold DMEMc. Tæl cellerne med en fortynding på en til to i trypanblå med en celletæller.Centrifuger det nødvendige volumen af celleopløsningen for at have 3000 levende celler pr. Kuppel. Resuspender pelleten med 17 mikroliter kold DMEMc pr. 3000 levende celler på is. Juster lydstyrken til det krævede antal brønde.Tilsæt langsomt 33 mikroliter kold ECM pr. 3000 levende celler. Juster lydstyrken til det krævede antal brønde og homogeniser uden at lave bobler. Derefter ses brøndene med 50 mikroliter ECM-cellesuspension pr. Brønd i en forvarmet 24-brøndplade og inkuberes i 30 minutter til polymerisation af ECM.Tilsæt 500 mikroliter af kulturmediet pr. Brønd. Derefter inkuberes og ændres kulturmediet hver anden til tre dage. For at belægge kulturindsatsen fremstilles belægningsopløsningen indeholdende kollagen IV fortyndet ved 50 mikrogram pr. milliliter i kold PBS.Tilsæt 150 mikroliter af den fortyndede belægningsopløsning til hver cellekulturindsats og inkuber natten over eller i tre timer. Fem dage efter opdeling løsnes organoiderne med ECM ved at skrabe dem med en P-1000-pipette. Homogeniseres omhyggeligt ved pipettering i dyrkningsmediet og overføres til et 15 ml konisk rør indeholdende fem ml kold DMEMc på is.Centrifuger de opsamlede organoider ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Supernatanten suges forsigtigt, og cellepelletsen resuspenderes i en milliliter forvarmet enzymdissociationsreagens suppleret med 10 mikromolær ROCK-hæmmer. Pipet op og ned 10 gange for at indlede dissociation af organoiderne.Inkuber i fem minutter i et 37 grader Celsius vandbad til enzymatisk fordøjelse. Forstyr organoiderne mekanisk ved pipettering 10 gange og tilsæt fire ml iskold DMEMc. Supernatanten centrifugeres og kasseres, før den organoide cellepellet resuspenderes i en milliliter DMEMc.Tæl cellerne i trypanblå med en celletæller og beregn det nødvendige volumen til frø 2,5 gange 10 til de femte celler pr. Kulturindsats. Det nødvendige volumen af cellesuspensionen centrifugeres svarende til 2,5 gange 10 af de femte celler pr. kulturindsats. Under centrifugering suges forsigtigt belægningsopløsningen fra kulturindsatserne og lad den tørre under emhætten uden låg i fem minutter.Efter centrifugering kasseres supernatanten, og pelletpen resuspenderes i det nødvendige volumen 2D-medium suppleret med 10 mikromolær ROCK-hæmmer. Frø 200 mikroliter af cellesuspensionen på den belagte permeable membran. Tilsæt 500 mikroliter af 2D-mediet suppleret med 10 mikromolær ROCK-hæmmer til det nederste rum og inkuber.En høj tæthed af celler skal observeres på membranen. En dag efter såning skal du udskifte de episke og basale medier med friske 2D-medier uden ROCK-hæmmeren. Skift medie hver dag.Monolaget bliver sammenflydende en dag efter såning og kan bruges til dets eksperimenter. I denne undersøgelse blev epitelkrypter opnået fra svinetarmen og kryopræserveret til langtidsopbevaring i flydende nitrogen. Efter optøning blev kryptstamcellerne podet i ECM.Organoiderne blev observeret inden for tre til fire dage og voksede hurtigt og udviklede spirende strukturer. Ca. 10 dage efter optøning blev passagen af organoider udført for at udvide kulturen. For optimal vedligeholdelse af kulturen skal organoiderne, der anvendes til emballering, have et klart og tomt lumen og veldefinerede kanter uden sort snavs i lumen, som observeret hos modne organoider.Celler fastgøres og danner et fuldt sammenflydende monolag inden for en dag, hvilket bekræftes af den høje transepitelielle elektriske modstand eller TEER på omkring 700 kupler kvadratcentimeter. TEER forbliver høj i tre dage. Actinfarvning indikerer, at den apikale side af epitelcellerne er orienteret mod lumen i 3D-organoider.Organoidceller podet i kulturindsatser danner et sammenflydende enkeltlag af epitelceller med den apikale side orienteret mod det øverste rum. Okklusionfarvning afslører tilstedeværelsen af tætte kryds på den apikale side af epitelcellerne i 3D-organoider og i cellemonolag. Det er vigtigt at huske, at organoid, der bruges til at frø cellemonolag, skal fremstå klart med et tomt lumen uden sort snavs svarende til en ophobning af døde celler.Monolag fra svinetarmorganoid kan bruges til at teste virkningerne af metabolitter eller mikrober på epitelbarrierefunktionen ved hjælp af funktionelle assays, billeddannelse og genekspressionsanalyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary Epithelial Organoids fra Xenopus embryonale celler: Generation, Kultur og høj opløsning Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Dyrkning af organoider fra Intestinal Villi Epithelium under dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generation af Murine Primary Colon Epitel Monolayers fra Tarmkrypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering og genmanipulation af Murine Hepatocyte organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablering af 3D endometrieorganoider fra musens livmoder

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrkning af organoider fra murinale krypter og en enkelt stamcelle til organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Undersøgelse af epitelvirkningerne af tarmbetændelse in vitro på etablerede murinkolonoider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...