Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" project) en door INRAE HOLOFLUX ("Holopig" project). De auteurs zijn de Genotoul core facilities (TRI) dankbaar. We danken Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) voor het zorgvuldig proeflezen.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een methode die wordt gebruikt om epitheliale crypten uit de darm van de big te cryopreserveren voor de langdurige opslag en daaropvolgende kweek van 3D-organoïden. Dit protocol maakt gebruik van een vriesoplossing die DMSO, FBS, de Y27632 ROCK-remmer, DMEM en antibiotica bevat. Een andere studie bij varkens verkregen organoïden uit crypten gecryopreserveerd in een vergelijkbare vriesoplossing, maar zonder de ROCK-remmer15. De Y27632 ROCK-remmer werd opgenomen om apoptose te voorkomen en de stamcelpool te behouden, omdat na het ontdooien epitheelcryptecellen worden gedissocieerd, wat kan leiden tot celdood ('anoikis')27,28. Interessant is dat paardenenteroïden zijn verkregen uit epitheliale crypten die zijn bevroren in een kweekmedium dat alleen DMEM en DMSO16 bevat; Deze eenvoudige methode is nog niet getest voor varkensepitheelcrypten. Andere methoden zijn gepubliceerd om menselijke en varkensorganoïden te kweken uit bevroren weefsels of biopsieën in plaats van epitheliale crypten 4,17. Het voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de darmweefsels direct te cryopreserveren zonder de crypte-isolatieprocedure uit te voeren, wat tijd en laboratoriumapparatuur vereist. Dit kan handig zijn wanneer de weefsels ver van het laboratorium moeten worden verzameld. Bij het isoleren van de crypten onmiddellijk na het slachten kunnen echter grote delen van de darm worden verwerkt om een zeer groot aantal crypten te verkrijgen, wat niet het geval is wanneer wordt uitgegaan van kleine bevroren weefselfragmenten. Na het ontdooien van epitheliale crypten werden organoïden waargenomen van 3-4 dagen na het zaaien en na 10 dagen gesplitst. Dit is een langzamere groeisnelheid dan bij het starten van de kweek uit verse epitheelcrypten, waarvoor de organoïden werden verkregen vanaf dag 1 na het zaaien, en kunnen meestal worden gesplitst rond dag 511. Khalil et al. rapporteerden ook een vertraagde groei van varkensenteroïden bij het starten van bevroren crypten15, wat suggereert dat stamcellen tijd nodig hebben om hun proliferatieve capaciteit te herstellen. We verkregen ook een lager aantal organoïden bij het starten van bevroren crypten in vergelijking met verse crypten, wat te wijten kan zijn aan de dood van stamcellen tijdens het vriesproces. In sommige pogingen om crypten te ontdooien (<20%), verkregen we geen organoïden uit bevroren crypten, waarschijnlijk als gevolg van een suboptimale cryopreservatieprocedure (bijv. Vertraagde bevriezing na crypte-isolatie van waarschijnlijk meer dan 1 uur). Daarom raden we aan om de crypten op ijs te houden totdat ze worden geteld en ze zo snel mogelijk in te vriezen.
Voor 3D-organoïden hebben we ervoor gekozen om een commercieel organoïde kweekmedium te gebruiken dat voor mensen is geformuleerd. Inderdaad, eerdere rapporten hebben aangetoond dat varkensdarmorganoïden efficiënt groeien met dit medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Het is van belang dat dit kweekmedium gebruiksklaar is en een gestandaardiseerde concentratie van groeifactoren binnen een batch heeft. Dit kweekmedium is echter duur, de samenstelling ervan is niet bekendgemaakt en het is dus niet mogelijk om de samenstelling ervan te moduleren. Andere studies hebben daarentegen varkensdarmorganoïden gekweekt in aangepaste media die farmacologische remmers, recombinante groeifactor en / of geconditioneerde mediabevatten 5,6,7,21. Hoewel zeer flexibel en goedkoper, is deze methode tijdrovend voor de productie van geconditioneerde media en kan deze niet reproduceerbaar zijn vanwege mogelijke variabiliteit in de concentratie van groeifactoren in geconditioneerde media. De kwaliteit van elke partij geconditioneerde media moet dus worden gevalideerd door organoïdegroei of markergenexpressiete meten 31.
Een studie heeft aangetoond dat jejunale organoïden gekweekt in hetzelfde commerciële organoïde cultuurmedium dat hier wordt gebruikt, sneller groeiden en minder gedifferentieerd leken, vergeleken met enteroïden gekweekt met media die recombinante groeifactor en / of geconditioneerde media bevatten23. Een hoge proliferatieve toestand vergemakkelijkt de kweek van 3D-organoïden, maar kan differentiatie vereisen om meer representatief te zijn voor intestinale fysiologische kenmerken. In dit protocol, voor de passage van 3D-organoïden, zijn de cellen volledig gedissocieerd voor het tellen, waardoor het aantal cellen dat in ECM is gezaaid, kan worden geregeld. Dit verhoogt de reproduceerbaarheid van het fenotype van organoïden, dat sterk wordt beïnvloed door hun dichtheid. Bovendien voorkomt het tellen van de cellen dat er een te lage of overvolle cultuur ontstaat, wat een aanpassing van het kweekschema vereist. De meeste andere studies bereidden organoïde fragmenten voor die niet volledig gedissocieerd waren tot enkele cellen en gebruikten een verdunningsverhouding voor passaging. Deze methode is eenvoudiger, maar kan variabiliteit veroorzaken volgens de organoïde dichtheid van de cultuur.
Voor de cultuur in monolagen worden organoïde cellen gezaaid in kweekinzetstukken die zijn voorgecoat met een dunne laag ECM, die de aanhechting van cellen mogelijk maakt, maar de groei van organoïden in 3D vermijdt. Dit protocol gebruikte collageen type IV als een ECM-eiwit, zoals eerder beschreven bij varkens23. Andere studies met varkensorganoïde monolagen gebruikten dezelfde tumor-afgeleide ECM die hier wordt gebruikt om 3D-organoïdente kweken 6,8,9,21,25,30. Het voordeel van het gebruik van collageen is het vermogen om de eiwitconcentratie te standaardiseren met een volledig gedefinieerde samenstelling, wat niet het geval is in de tumor-afgeleide ECM. Een cruciale stap voor het succes van de cultuur van celmonolagen is om aandacht te besteden aan het visuele uiterlijk van de voorloper 3D-organoïden, die goed gedefinieerde randen en een leeg lumen zonder zwart puin moeten hebben. Inderdaad, organoïden met een hoog rijpingsniveau en een lage proliferatieve snelheid zijn geen geschikte bron van cellen voor 2D-cultuur. De timing van de dissociatie van 3D-organoïden in afzonderlijke cellen is dus cruciaal voor het succes van deze stap.
De cultuur van 2D-monolagen uit afzonderlijke cellen maakt het mogelijk om het aantal gezaaide cellen te standaardiseren, wat moeilijker is wanneer wordt gestart met organoïde fragmenten, zoals uitgevoerd in sommige andere methoden. We zaaiden 7,6 x 10 5 cellen per cm 2, wat hoog is in vergelijking met de meeste andere studies 21,22,23 bij varkens die een lagere celdichtheid gebruikten, variërend van 0,25 x 10 5 cellen per cm 2 tot 1,78 x 10 5 cellen per cm2. De vereiste van een groot aantal organoïde cellen vormt een beperking van dit protocol, maar het stelde ons in staat om snel een confluente monolaag te verkrijgen, die de kweekinzet na 1 dag volledig bedekte. Vermeire et al.23 daarentegen verkregen confluentie na 4-7 dagen met een lagere dichtheid van gezaaide cellen (van 0,25 x 10 5 cellen/cm 2 tot 0,4 x 105 cellen/cm2). Sommige studies hebben ook varkensorganoïde cel monolagen gebruikt die het kweekoppervlak niet volledig bedekten voor infecties met virussen 8,30. In deze omstandigheden is de apicale kant van epitheelcellen toegankelijk voor behandelingen, maar volledig confluente monolagen zijn vereist als het doel is om de opname van voedingsstoffen of epitheliale permeabiliteit te bestuderen.
Voor organoïde cel monolagen werd een commercieel organoïde kweekmedium aangevuld met 20% FBS gebruikt, gebaseerd op een recente studie over van runderen afgeleide monolagen van enteroïden32. In onze tests was de suppletie met 20% FBS nodig om volledig confluente monolagen te verkrijgen, waarschijnlijk vanwege een hoge groeifactorvereiste. Integendeel, andere studies die hetzelfde commerciële medium gebruiken, hebben monolagen vastgesteld zonder extra FBS 8,25,30, maar zonder volledige confluentie te bereiken. Andere studies hebben ook suppletie met 20% FBS gebruikt in een aangepast medium voor de kweek van varkensorganoïde cel monolagen21,22. In onze experimenten is TEER 1 dag na het zaaien hoog (ongeveer 700 Ω · cm 2) en blijft hoog tot dag 3 (ongeveer 1.500 Ω · cm2; dit komt overeen met de vorming van tight junctions, zoals aangegeven door de uitdrukking van occludine. Van der Hee et al. verkregen vergelijkbare TEER-waarden gedurende 72 uur voor jejunum organoïde cel monolagen21. Ze toonden ook aan dat monolagen kunnen worden gehandhaafd tot dag 12-15 met dagelijkse mediaveranderingen. Andere studies hebben daarentegen veel lagere TEER-waarden (ongeveer 200 Ω ·cm2) gemeld voor monolagen van varkensorganoïde cellen 6,22. Deze verschillen tussen studies kunnen verband houden met het bestudeerde darmsegment of met de gebruikte media die de epitheliale differentiatie beïnvloeden.
Kortom, het bovenstaande protocol om 3D-organoïden van varkensdarmen te laten groeien uit bevroren epitheelcrypten vergemakkelijkt de organisatie van het kweekwerk. Het vermindert de behoefte aan vers weefsel dat moet worden verkregen van levende dieren. We leggen ook uit hoe je in minder dan 3 dagen volledig confluente celmonolagen kunt vaststellen die zijn afgeleid van varkensorganoïden. Onze protocollen kunnen dus nuttige bronnen zijn voor wetenschappers die het darmepitheel van varkens bestuderen voor veterinair of biomedisch onderzoek.

Het darmepitheel wordt gevormd door een monolaag van cellen die het spijsverteringsslijmvlies bedekken op het grensvlak met de luminale omgeving. Deze positie wordt geassocieerd met diverse functies, zoals opname van voedingsstoffen en barrièrefunctie, die worden ondersteund door de aanwezigheid van stamcellen en meerdere gedifferentieerde epitheelceltypen (absorberende, entero-endocriene, Paneth- en bokaalcellen)1. Vereeuwigde cellijnen die traditioneel worden gebruikt om epitheelcellen te bestuderen, hebben grote beperkingen, omdat ze niet de cellulaire complexiteit van het darmepitheel weerspiegelen en genomische afwijkingen vertonen2. De ontwikkeling van driedimensionale (3D) organoïden door Sato et al.3 leverde een nieuw model op om het darmepitheel te bestuderen met een verbeterde fysiologische relevantie. Inderdaad, intestinale organoïden zijn afgeleid van niet-getransformeerde stamcellen, zijn samengesteld uit meerdere celtypen en recapituleren de functionaliteit van het darmepitheel. Intestinale organoïden worden steeds vaker gebruikt om de ontwikkeling en functies van het darmepitheel en zijn interacties met pathogenen, voedingsstoffen, toxines, geneesmiddelen, de microbiota en zijn metabolietente begrijpen 2.
Oorspronkelijk ontwikkeld voor mensen en muizen, zijn de methoden die worden gebruikt om darmorganoïden te kweken onlangs aangepast aan andere soorten, waaronder varkens4. Gonzales et al.5 waren de eersten die varkensorganoïden uit het jejunum kweekten; Sindsdien zijn varkensorganoïden beschreven voor andere darmsegmenten (twaalfvingerige darm, ileum en dikke darm)6,7,8 en is aangetoond dat ze een locatiespecifiek fenotype 9,10,11 behouden. Varkensdarm 3D-organoïden worden nu vaak gebruikt om het effect van voedingsstoffen 12,13 of enterische infecties 6,8,14 te bestuderen.
De meeste studies hebben de cultuur van intestinale organoïden beschreven vanaf vers geïsoleerde epitheelcrypten. Dit is echter niet altijd haalbaar om logistieke redenen, met name bij het werken met grote dieren zoals varkens. Inderdaad, dierlijke faciliteiten voor varkens kunnen zich ver van het laboratorium bevinden waar organoïden worden gekweekt, wat de werkorganisatie bemoeilijkt. Bovendien is organoïdecultuur tijdrovend; Het is dus niet praktisch om tegelijkertijd meerdere organoïde lijnen te laten groeien, bijvoorbeeld uit verschillende darmsegmenten of meerdere dieren. Om deze problemen te omzeilen, hebben enkele studies bij mensen, paarden en varkens methoden beschreven om organoïden te kweken uit bevroren darmweefsels (of biopsieën) of uit geïsoleerde epitheliale crypten 4,15,16,17. Deze methoden maken de cryopreservatie van intestinale epitheelstamcellen uit meerdere darmsegmenten van een enkel dier mogelijk, die vervolgens kunnen worden gebruikt om organoïden te laten groeien wanneer dat nodig is. Bovendien maakt dit een sterke vermindering mogelijk van het aantal levende dieren dat als donoren van stamcellen wordt gebruikt, omdat grote voorraden gecryopreserveerde crypten kunnen worden gecreëerd (principes van 3R). Een ander voordeel van deze methode is de groei van intestinale organoïden alleen van dieren van belang na het verkrijgen van fenotypische of genotypische resultaten, wat zeer kosteneffectief is.
In vivo zijn darmepitheelcellen gepolariseerd, waarbij de apicale kant naar het lumen is gericht. In vitro, in 3D-organoïden, is de apicale kant van epitheelcellen ook naar het lumen gericht (d.w.z. in de organoïden)4. Deze organisatie voorkomt toegang tot de apicale kant, wat een probleem is bij het bestuderen van de effecten van luminale componenten (bijv. Voedingsstoffen, microben, metabolieten) op epitheelcellen. Om dit nadeel te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld, zoals de kweek van organoïde cellen als 2D-monolagen, micro-injectie en polariteitsomkering ("apicale organoïden")18,19. De cultuur van organoïde cel monolagen is in opkomst als het meest efficiënte en handelbare systeem. Het principe is om 3D-organoïden te dissociëren in afzonderlijke cellen en ze te zaaien op een celkweekvat dat eerder is bedekt met een dunne laag extracellulaire matrix (ECM)20. In deze kweekomstandigheden is de apicale kant van de epitheelcellen naar boven gericht en dus toegankelijk voor experimentele behandelingen20. De kweek van organoïde cel monolagen is onlangs aangepast voor de varkensdarm21,22; celmonolagen afgeleid van 3D-organoïden van varkens zijn gebruikt voor meerdere toepassingen, waaronder de studie van enterische infecties 6,23,24,25, het transport van voedingsstoffen9 en spijsverteringsziektemodellering 26.
Hier presenteert deze studie eerst een gedetailleerd protocol voor de kweek en het onderhoud van 3D-organoïden van varkensdarm afgeleid van gecryopreserveerde epitheelcrypten (figuur 1). Vervolgens wordt een protocol beschreven om celmonolagen vast te stellen uit 3D-organoïden van varkensdarmen. De hier beschreven methoden bieden experimentele hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om het darmepitheel van varkens te bestuderen voor nutriëntentransport, barrièrefunctie en gastheer-micro-organisme interacties.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Intestinale organoïden worden steeds vaker gebruikt om het darmepitheel te bestuderen voor het modelleren van spijsverteringsziekten, of om interacties met geneesmiddelen, voedingsstoffen, metabolieten, pathogenen en de microbiota te onderzoeken. Methoden om darmorganoïden te kweken zijn nu beschikbaar voor meerdere soorten, waaronder varkens, een soort van groot belang, zowel als landbouwhuisdier als als translationeel model voor mensen, bijvoorbeeld om zoönotische ziekten te bestuderen. Hier geven we een diepgaande beschrijving van een procedure die wordt gebruikt om 3D-organoïden van varkensdarmen te kweken uit bevroren epitheelcrypten. Het protocol beschrijft hoe epitheliale crypten uit de varkensdarm te cryopreserveren en de daaropvolgende procedures om 3D-darmorganoïden te kweken. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn (i) de temporele dissociatie van de isolatie van crypten uit de cultuur van 3D-organoïden, (ii) de bereiding van grote voorraden gecryopreserveerde crypten afgeleid van meerdere darmsegmenten en van meerdere dieren tegelijk, en dus (iii) de vermindering van de noodzaak om verse weefsels van levende dieren te bemonsteren. We beschrijven ook een protocol om celmonolagen vast te stellen die zijn afgeleid van 3D-organoïden om toegang te krijgen tot de apicale kant van epitheelcellen, de plaats van interacties met voedingsstoffen, microben of medicijnen. Over het algemeen zijn de hier beschreven protocollen een nuttige bron voor het bestuderen van het darmepitheel van varkens in veterinair en biomedisch onderzoek.

Volgens het hierboven beschreven protocol worden epitheliale crypten verkregen uit de varkensdarm en gecryopreserveerd voor langdurige opslag in vloeibare stikstof (figuur 1 en figuur 2A). Na het ontdooien worden de cryptestamcellen in de ECU gezaaid (figuur 2B). De crypt-structuur gaat meestal verloren na deze stap, als gevolg van het uiteenvallen van de crypt-structuur in de ECM. De organoïden kunnen binnen 3-4 dagen worden waargenomen en groeien dan snel en ontwikkelen ontluikende structuren (figuur 2B). We hebben met succes organoïden verkregen na het ontdooien van bevroren crypten in >80% van de pogingen. Ongeveer 10 dagen na het ontdooien (volgens de groeisnelheid van organoïden) wordt een passage van organoïden uitgevoerd om de cultuur uit te breiden (figuur 3). De organoïden groeien sneller na het splitsen en ze presenteren verschillende morfologieën, met sommige cystische en een meerderheid van ontluikende organoïden. Voor een optimaal onderhoud van de cultuur moeten de organoïden die worden gebruikt voor het passeren een helder en leeg lumen en goed gedefinieerde randen hebben (voorbeelden aangegeven met groene pijlen) zonder zwart puin in het lumen (aangegeven door rode pijlen), zoals waargenomen bij volwassen organoïden (figuur 3). We ontdekten dat zwart celafval zich begint op te hopen rond dag 6 na het passeren. Daarom wordt het splitsen of bevriezen van de organoïden op dag 4-5 na het passeren aanbevolen.
De volwassenheidsfase van de organoïden is ook een belangrijk punt bij het verkrijgen van celmonolagen. Organoïden met gevorderde rijpheid (aangegeven door de aanwezigheid van zwarte celresten in het lumen) zijn niet optimaal om monolagen te zaaien. We dissociëren 3D-organoïden meestal 4 dagen na passage om cellen te verzamelen voor 2D-cultuur. Ongeveer één tot drie putjes van 3D-organoïden gekweekt op 3.000 cellen per 50 μL koepel van de ECM zijn nodig voor het zaaien van één kweekinzet met 2,5 x 105 cellen. Cellen hechten zich en vormen binnen 1 dag een volledig confluente monolaag (figuur 4A), wat wordt bevestigd door de hoge TEER van ongeveer 700 Ω·cm2 (figuur 4B). De celranden zijn echter moeilijk te visualiseren door brightfieldmicroscopie op dit vroege tijdstip, waarschijnlijk vanwege een laag differentiatieniveau. De TEER blijft 3 dagen hoog (figuur 4B).
Actinekleuring geeft aan dat de apicale kant van de epitheelcellen is gericht op het lumen in 3D-organoïden (figuur 5A). Organoïde cellen gezaaid in cultuur insert vormen een confluente enkele laag epitheelcellen, met de apicale kant gericht op het bovenste compartiment (figuur 4B,C). Occludinkleuring onthult de aanwezigheid van tight junctions aan de apicale zijde van de epitheelcellen in 3D-organoïden en in celmonolagen (figuur 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de methoden die worden gebruikt om 3D-organoïden en celmonolagen afgeleid van organoïden te kweken. Epitheelcrypten worden geïsoleerd uit de darm van de biggetje. Deze crypten kunnen i) onmiddellijk worden gebruikt om 3D-organoïden te kweken of ii) worden ingevroren en opgeslagen in een biobank in vloeibare stikstof. Gecryopreserveerde crypten kunnen worden ontdooid en gebruikt om 3D-organoïden te kweken. De 3D-organoïdecultuur kan worden onderhouden met opeenvolgende splitsingen, of worden ingevroren en opgeslagen in de biobank. Celmonolagen kunnen worden verkregen uit de 3D-organoïdecultuur om toegang te krijgen tot de apicale kant van de cellen en de epitheliale barrièrefunctie te bestuderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figuur 2: Kweek van varkensdarm 3D organoïden uit gecryopreserveerde epitheelcrypten. (A) Representatief microscopisch beeld van vers geïsoleerde jejunale crypten. (B) Representatieve microscopische beelden van 3D-organoïden verkregen na het ontdooien van de jejunale crypten. De organoïden werden gekweekt in een 25 μL koepel van ECM in een 48-well plaat. De figuur toont afbeeldingen van de 3D-organoïden op 4, 7, 8, 9 en 10 dagen na het zaaien. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figuur 3: Morfologie van varkensdarm 3D-organoïden afgeleid van gecryopreserveerde epitheelcrypten na de eerste passage. Representatieve microscopische beelden van de ontwikkeling van organoïden afgeleid van gecryopreserveerde jejunumcrypten na de eerste passage van dag 4 naar dag 7. Groene pijlen geven duidelijke organoïden aan die geschikt zijn voor de passage of het zaaien van monolagen. Rode pijlen geven volwassen organoïden aan die niet geschikt zijn voor het splitsen of zaaien van monolagen; Putten moeten dus worden gebruikt vóór de verschijning van deze morfologie. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figuur 4: Kenmerken van cel monolagen afgeleid van varkens intestinale 3D organoïden . (A) Representatieve microscopische beelden van de monolaag morfologie gedurende 3 dagen. Jejunum organoïde cellen werden gezaaid op 2,5 x 105 cellen in 0,33 cm2 celcultuur inserts bedekt met collageen IV bij 50 ng / ml. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. (B) Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) van organoïde cel monolagen gedurende 3 dagen. Stippen verbonden door een lijn corresponderen met dezelfde put op verschillende tijdstippen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figuur 5: Beeldvorming van varkensjejunum organoïden gekweekt in 3D of 2D. Confocale microscopie beeldvorming van (A) 3D organoïden 5 dagen na splitsing en (B,C) organoïde cel monolagen 3 dagen na het zaaien (B: XZ sectie; C: XY sectie). DNA (blauw) was gekleurd met DAPI. Actine (rood) was gekleurd met falloidine. Occludin (groen) was gekleurd met een polyklonaal antilichaam. Witte pijlen geven occludin aan dat gelokaliseerd is op de tight junction. De schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Hier beschrijven we een protocol om varkensdarm 3D-organoïden te kweken uit gecryopreserveerde epitheelcrypten. We beschrijven ook een methode om celmonolagen vast te stellen die zijn afgeleid van 3D-organoïden, waardoor toegang wordt verkregen tot de apicale kant van epitheelcellen.

Kweek van biggendarm 3D-organoïden uit gecryopreserveerde epitheliale crypten en oprichting van celmonolagen

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Ons protocol biedt hulpmiddelen om het darmepitheel van varkens te bestuderen voor veterinair en biomedisch onderzoek. Intestinale organoïden van varkens kunnen worden gebruikt om het transport van voedingsstoffen, de barrièrefunctie en interacties tussen gastheer en microben te bestuderen. Door het behoud van varkensdarmepitheelcrypten maken het mogelijk om een grote voorraad stamcellen te creëren die later kunnen worden gebruikt om organoïden in 3D- of 2D-monolagen te kweken.Dit protocol is gedetailleerd voor het jejunum, maar het kan ook worden gebruikt voor andere darmsegmenten zoals twaalfvingerige darm, ileum en dikke darm. Ontdooi om te beginnen snel een flacon met 900 bevroren crypten in een waterbad bij 37 graden Celsius. Breng de crypte-oplossing over in een conische buis van 15 milliliter.Centrifugeer op 300 x g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Voeg 150 microliter van de extracellulaire matrix of ECU toe met een gekoelde tip om een uiteindelijke concentratie van 150 crypten per 25 microliter ECM te verkrijgen. Pipetteer 10 keer op en neer om een homogene suspensie van crypten in de ECU te verkrijgen.Zaai zes putjes met een druppel van 25 microliter per put in een voorverwarmde plaat met 48 putten. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor polymerisatie van de ECM. Voeg een 250 microliter per put van cultuur van medium bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Verander het kweekmedium om de twee tot drie dagen. Om 3D-organoïden afgeleid van bevroren crypten 10 dagen na het zaaien te passeren, verwijdert u de kweekmedia en voegt u 250 microliter voorverwarmd PBS toe bij 37 graden Celsius. Vervang na incubatie de PBS door 250 microliter voorverwarmd enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 micromolaire rotsremmer bij 37 graden Celsius in elke put.Maak de organoïden in de ECU los door te schrapen met een P-1000 pipet en homogeniseer voorzichtig door vijf keer te pipetteren. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voordat je de cellen dissocieert door 10 keer op en neer te pipetteren. Voeg 500 microliter DMEMc toe in elke put met gedissocieerde cellen en trek tot 12 putjes in een conische buis van 15 milliliter met drie milliliter koude DMEMc.Centrifugeer op 500 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in één milliliter koude DMEMc. Tel de cellen met een verdunning van één tot twee in trypan blauw met een celteller.Centrifugeer het benodigde volume van de celoplossing om 3000 levende cellen per koepel te hebben. Resuspendeerde de pellet met 17 microliter koude DMEMc per 3000 levende cellen op ijs. Pas het volume aan op het vereiste aantal putjes.Voeg langzaam 33 microliter koude ECM per 3000 levende cellen toe. Pas het volume aan op het vereiste aantal putten en homogeniseer zonder bubbels te maken. Bekijk vervolgens de putjes met 50 microliter van de ECM-celsuspensie per put in een voorverwarmde 24-putplaat en incubeer gedurende 30 minuten voor polymerisatie van de ECM.Voeg 500 microliter van het kweekmedium per put toe. Incubeer en verander vervolgens het kweekmedium om de twee tot drie dagen. Om de kweekinzet te coaten, bereidt u de coatingoplossing met collageen IV verdund met 50 microgram per milliliter in koude PBS.Voeg 150 microliter van de verdunde coatingoplossing toe aan elke celkweekinzet en incuber een nacht of gedurende drie uur. Vijf dagen na het splitsen maakt u de organoïden los met de ECU door ze te schrapen met een P-1000-pipet. Zorgvuldig gehomogeniseerd door pipetteren in het kweekmedium en overbrengen naar een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter koude DMEMc op ijs.Centrifugeer de verzamelde organoïden op 500 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspendien de celkorrel in één milliliter voorverwarmd enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 micromolaire ROCK-remmers. Pipet 10 keer op en neer om dissociatie van de organoïden te initiëren.Incubeer gedurende vijf minuten in een waterbad van 37 graden Celsius voor enzymatische spijsvertering. Verstoor de organoïden mechanisch door 10 keer te pipetteren en voeg vier milliliter ijskoude DMEMc toe. Centrifugeer en gooi het supernatant weg voordat u de organoïde celpellet opnieuw in één milliliter DMEMc suspenseert.Tel de cellen in trypan blauw met een celteller en bereken het benodigde volume om 2,5 maal 10 tot de vijfde cel per kweekinzet te zaaien. Centrifugeer het benodigde volume van de celsuspensie dat overeenkomt met 2,5 maal 10 van de vijfde cellen per kweekinzet. Zuig tijdens het centrifugeren de coatingoplossing voorzichtig uit de kweekinzetstukken en laat deze vijf minuten zonder deksel onder de kap drogen.Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspensie de pellet in het benodigde volume 2D-medium aangevuld met 10 micromolaire ROCK-remmers. Zaai 200 microliter van de celsuspensie op het gecoate permeabele membraan. Voeg 500 microliter van het 2D-medium aangevuld met 10 micromolaire ROCK-remmer toe aan het onderste compartiment en incubeer.Een hoge dichtheid van cellen moet op het membraan worden waargenomen. Vervang een dag na het zaaien de epische en basale media door verse 2D-media zonder de ROCK-remmer. Verander de media elke dag.De monolaag wordt een dag na het zaaien samenvloeiend en kan worden gebruikt voor zijn experimenten. In deze studie werden epitheliale crypten verkregen uit de varkensdarm en gecryopreserveerd voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Na het ontdooien werden de cryptestamcellen in de ECU gezaaid.De organoïden werden binnen drie tot vier dagen waargenomen en groeiden snel en ontwikkelden ontluikende structuren. Ongeveer 10 dagen na het ontdooien werd de passage van organoïden uitgevoerd om de cultuur uit te breiden. Voor een optimaal onderhoud van de cultuur moeten de organoïden die voor de verpakking worden gebruikt, een helder en leeg lumen en goed gedefinieerde randen hebben zonder zwart puin in het lumen zoals waargenomen bij volwassen organoïden.Cellen hechten zich en vormen binnen één dag een volledig confluente monolaag die wordt bevestigd door de hoge transepitheliale elektrische weerstand, of TEER, van ongeveer 700 koepels vierkante centimeter. De TEER blijft drie dagen hoog. Actinekleuring geeft aan dat de apicale kant van de epitheelcellen is gericht op het lumen in 3D-organoïden.Organoïde cellen gezaaid in kweekinzetstukken vormen een confluente enkele laag epitheelcellen met de apicale kant gericht op het bovenste compartiment. Occludinkleuring onthult de aanwezigheid van tight junctions aan de apicale kant van de epitheelcellen in 3D-organoïden en in celmonolagen. Het is belangrijk om te onthouden dat organoïden die worden gebruikt om celmonolagen te zaaien, er helder uit moeten zien met een leeg lumen zonder zwart puin dat overeenkomt met een opeenhoping van dode cellen.Monolagen van varkensdarmorganoïde kunnen worden gebruikt om de effecten van metabolieten of microben op de epitheliale barrièrefunctie te testen met behulp van functionele assays, beeldvorming en genexpressieanalyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary Epithelial Organoids van Xenopus Embryonal Cells: Generatie, Cultuur en High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-kweek van organoïden uit het intestinale villi-epitheel dat dedifferentiatie ondergaat

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generatie van Murine Primaire Colon Epitheliale Monolayers uit Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...