Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’Institut Carnot France Futur Elevage (projet OrganoPig) et par INRAE HOLOFLUX (projet Holopig). Les auteurs sont reconnaissants envers les installations centrales de Genotoul (TRI). Nous remercions Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) pour sa relecture attentive.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode utilisée pour cryoconserver les cryptes épithéliales de l’intestin du porcelet pour le stockage à long terme et la culture ultérieure d’organoïdes 3D. Ce protocole utilise une solution de congélation contenant du DMSO, du FBS, l’inhibiteur Y27632 ROCK, du DMEM et des antibiotiques. Une autre étude chez le porc a obtenu des organoïdes provenant de cryptes cryoconservées dans une solution de congélation similaire mais sans l’inhibiteur ROCK15. L’inhibiteur Y27632 ROCK a été inclus pour prévenir l’apoptose et maintenir le pool de cellules souches puisque, après décongélation, les cellules cryptiques épithéliales sont dissociées, ce qui peut entraîner la mort cellulaire (« anoikis »)27,28. Il est intéressant de noter que des entéroïdes équins ont été obtenus à partir de cryptes épithéliales congelées dans un milieu de culture contenant uniquement du DMEM et du DMSO16; Cette méthode simple n’a pas encore été testée pour les cryptes épithéliales du porc. D’autres méthodes ont été publiées pour cultiver des organoïdes humains et porcins à partir de tissus congelés ou de biopsies au lieu de cryptes épithéliales 4,17. L’avantage de cette méthode est la possibilité de cryoconserver directement les tissus intestinaux sans effectuer la procédure d’isolement de la crypte, qui nécessite du temps et du matériel de laboratoire. Cela peut être pratique lorsque les tissus doivent être prélevés loin du laboratoire. Cependant, lors de l’isolement des cryptes immédiatement après l’abattage, de grands segments de l’intestin peuvent être traités pour obtenir un très grand nombre de cryptes, ce qui n’est pas le cas à partir de petits fragments de tissus congelés. Après le dégel des cryptes épithéliales, des organoïdes ont été observés 3-4 jours après l’ensemencement et se sont divisés après 10 jours. Il s’agit d’un taux de croissance plus lent que lors du démarrage de la culture à partir de cryptes épithéliales fraîches, pour lesquelles les organoïdes ont été obtenus dès le jour 1 après l’ensemencement et peuvent généralement être divisés vers le jour 5et 11. Khalil et al. ont également signalé un retard de croissance des entéroïdes porcins à partir de cryptes congelées15, ce qui suggère que les cellules souches pourraient avoir besoin de temps pour récupérer leur capacité proliférative. Nous avons également obtenu un nombre inférieur d’organoïdes en partant de cryptes congelées par rapport aux cryptes fraîches, ce qui pourrait être dû à la mort des cellules souches pendant le processus de congélation. Dans certaines tentatives de décongélation des cryptes (<20%), nous n’avons pas obtenu d’organoïdes à partir de cryptes gelées, probablement en raison d’une procédure de cryoconservation sous-optimale (par exemple, congélation retardée après isolement de la crypte de probablement plus de 1 h). Ainsi, nous recommandons de garder les cryptes sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient comptées et de les congeler le plus rapidement possible.
Pour les organoïdes 3D, nous avons choisi d’utiliser un milieu de culture organoïde commercial formulé pour les humains. En effet, des rapports antérieurs ont montré que les organoïdes intestinaux de porc se développent efficacement avec ce milieu 8,11,14,19,25,26,29,30. Il est intéressant que ce milieu de culture soit prêt à l’emploi et présente une concentration standardisée de facteurs de croissance au sein d’un lot. Cependant, ce milieu de culture est coûteux, sa composition n’est pas divulguée et il n’est donc pas possible de moduler sa composition. En revanche, d’autres études ont mis en culture des organoïdes intestinaux de porc dans des milieux personnalisés contenant des inhibiteurs pharmacologiques, un facteur de croissance recombinant et/ou des milieux conditionnés 5,6,7,21. Bien que très flexible et moins chère, cette méthode prend beaucoup de temps pour la production de milieux conditionnés et pourrait manquer de reproductibilité en raison de la variabilité potentielle de la concentration des facteurs de croissance dans les milieux conditionnés. Ainsi, la qualité de chaque lot de milieux conditionnés doit être validée en mesurant la croissance organoïde ou l’expression géniquemarqueur 31.
Une étude a montré que les organoïdes jéjunaux de porc cultivés dans le même milieu de culture organoïde commercial utilisé ici se développaient plus rapidement et semblaient moins différenciés que les entéroïdes cultivés avec des milieux contenant un facteur de croissance recombinant et/ou des milieux conditionnés23. Un état prolifératif élevé facilite la culture d’organoïdes 3D, mais peut nécessiter d’induire une différenciation pour être plus représentatif des caractéristiques physiologiques intestinales. Dans ce protocole, pour le passage des organoïdes 3D, les cellules sont entièrement dissociées pour le comptage, ce qui permet de contrôler le nombre de cellules ensemencées en ECM. Cela augmente la reproductibilité du phénotype des organoïdes, qui est fortement influencé par leur densité. De plus, compter les cellules évite d’obtenir une culture trop faible ou surpeuplée, ce qui nécessite d’adapter le calendrier de culture. La plupart des autres études ont préparé des fragments organoïdes non complètement dissociés en cellules individuelles et ont utilisé un rapport de dilution pour le passage. Cette méthode est plus simple, mais pourrait induire une variabilité en fonction de la densité organoïde de la culture.
Pour la culture en monocouches, les cellules organoïdes sont ensemencées dans des inserts de culture préenduits d’une fine couche d’ECM, qui permet la fixation des cellules mais évite la croissance des organoïdes en 3D. Ce protocole utilisait du collagène de type IV comme protéine ECM, comme décrit précédemment chez les porcs23. D’autres études avec des monocouches organoïdes de porc ont utilisé la même ECM dérivée de la tumeur utilisée ici pour cultiver des organoïdes 3D 6,8,9,21,25,30. L’avantage de l’utilisation du collagène est la possibilité de normaliser la concentration en protéines avec une composition entièrement définie, ce qui n’est pas le cas dans l’ECM dérivée de la tumeur. Une étape critique pour le succès de la culture des monocouches cellulaires est de prêter attention à l’apparence visuelle des organoïdes 3D précurseurs, qui devraient avoir des bords bien définis et une lumière vide sans débris noirs. En effet, les organoïdes avec un niveau de maturation élevé et un faible taux de prolifération ne sont pas une source appropriée de cellules pour la culture 2D. Ainsi, le moment de la dissociation des organoïdes 3D en cellules uniques est crucial pour le succès de cette étape.
La culture de monocouches 2D à partir de cellules individuelles permet de standardiser le nombre de cellules ensemencées, ce qui est plus difficile à partir de fragments organoïdes, comme cela est effectué dans d’autres méthodes. Nous avons ensemencé 7,6 x 10 5 cellules par cm 2, ce qui est élevé par rapport à la plupart des autres études 21,22,23 chez des porcs qui utilisaient une densité cellulaire inférieure, allant de0,25 x 10 5 cellules par cm 2 à 1,78 x 10 5 cellules par cm2. L’exigence d’un nombre élevé de cellules organoïdes constitue une limitation de ce protocole, mais elle nous a permis d’obtenir rapidement une monocouche confluente, recouvrant entièrement l’insert de culture après 1 jour. En revanche, Vermeire et al.23 ont obtenu une confluence après 4-7 jours avec une densité plus faible de cellules ensemencées (de 0,25 x 10 5 cellules/cm 2 à 0,4 x 105 cellules/cm2). Certaines études ont également utilisé des monocouches de cellules organoïdes de porc qui ne couvraient pas entièrement la surface de culture pour les infections par les virus 8,30. Dans ces conditions, la face apicale des cellules épithéliales est accessible pour les traitements, mais des monocouches entièrement confluentes sont nécessaires si l’objectif est d’étudier l’absorption des nutriments ou la perméabilité épithéliale.
Pour les monocouches de cellules organoïdes, un milieu de culture organoïde commercial complété par 20 % de FBS a été utilisé, sur la base d’une étude récente sur les monocouches dérivées d’entéroïdesbovins 32. Dans nos tests, la supplémentation avec 20% FBS était nécessaire pour obtenir des monocouches entièrement confluentes, probablement en raison d’une exigence élevée en facteur de croissance. Au contraire, d’autres études utilisant le même milieu commercial ont établi des monocouches sans FBS 8,25,30 supplémentaire, mais sans atteindre la confluence complète. D’autres études ont également utilisé une supplémentation avec 20% FBS dans un milieu personnalisé pour la culture de monocouches de cellules organoïdesporcines 21,22. Dans nos expériences, TEER est élevé 1 jour après l’ensemencement (environ 700 Ω·cm2), et reste élevé jusqu’au jour 3 (environ 1 500 Ω·cm2 ; ceci est cohérent avec la formation de jonctions serrées, comme l’indique l’expression de l’occludine. Van der Hee et al. ont obtenu des valeurs TEER similaires sur 72 h pour les monocouches organoïdes de jéjunum21. Ils ont également démontré que les monocouches peuvent être maintenues jusqu’au jour 12-15 avec des changements quotidiens de support. En revanche, d’autres études ont rapporté des valeurs TEER beaucoup plus faibles (environ 200 Ω·cm2) pour les monocouches de cellules organoïdesporcines 6,22. Ces différences entre les études peuvent être liées au segment intestinal étudié ou aux milieux utilisés qui influencent la différenciation épithéliale.
En conclusion, le protocole ci-dessus pour cultiver des organoïdes 3D intestinaux de porc à partir de cryptes épithéliales congelées facilite l’organisation du travail de culture. Il réduit le besoin d’obtenir des tissus frais à partir d’animaux vivants. Nous expliquons également comment établir des monocouches cellulaires entièrement confluentes dérivées d’organoïdes porcins en moins de 3 jours. Ainsi, nos protocoles pourraient être des ressources utiles pour les scientifiques qui étudient l’épithélium intestinal du porc pour la recherche vétérinaire ou biomédicale.

L’épithélium intestinal est formé d’une monocouche de cellules recouvrant la muqueuse digestive à l’interface avec l’environnement luminal. Cette position est associée à diverses fonctions, telles que l’absorption des nutriments et la fonction de barrière, qui sont soutenues par la présence de cellules souches et de multiples types de cellules épithéliales différenciées (cellules absorbantes, entéroendocrines, Paneth et caliciformes)1. Les lignées cellulaires immortalisées traditionnellement utilisées pour étudier les cellules épithéliales présentent des limitations majeures, car elles ne reflètent pas la complexité cellulaire de l’épithélium intestinal et présentent des anomalies génomiques2. Le développement d’organoïdes tridimensionnels (3D) par Sato et al.3 a fourni un nouveau modèle pour étudier l’épithélium intestinal avec une pertinence physiologique améliorée. En effet, les organoïdes intestinaux sont dérivés de cellules souches non transformées, sont composés de multiples types de cellules, et récapitulent la fonctionnalité de l’épithélium intestinal. Les organoïdes intestinaux sont de plus en plus utilisés pour comprendre le développement et les fonctions de l’épithélium intestinal et ses interactions avec les agents pathogènes, les nutriments, les toxines, les médicaments, le microbiote et ses métabolites2.
Initialement développées pour l’homme et la souris, les méthodes utilisées pour la culture des organoïdes intestinaux ont récemment été adaptées à d’autres espèces, dont les porcs4. Gonzales et al.5 ont été les premiers à cultiver des organoïdes porcins du jéjunum ; Depuis lors, des organoïdes porcins ont été décrits pour d’autres segments intestinaux (duodénum, iléon et côlon)6,7,8, et il a été démontré qu’ils conservent un phénotype spécifique à l’emplacement 9,10,11. Les organoïdes 3D intestinaux de porc sont maintenant couramment utilisés pour étudier l’effet des nutriments 12,13 ou des infections entériques 6,8,14.
La plupart des études ont décrit la culture d’organoïdes intestinaux à partir de cryptes épithéliales fraîchement isolées. Cependant, cela n’est pas toujours possible pour des raisons logistiques, notamment lorsque l’on travaille avec de gros animaux tels que les porcs. En effet, les animaleries pour porcs peuvent être situées loin du laboratoire où les organoïdes sont cultivés, ce qui complique l’organisation du travail. De plus, la culture organoïde prend beaucoup de temps; Ainsi, il n’est pas pratique de cultiver simultanément plusieurs lignées organoïdes, par exemple, à partir de différents segments intestinaux ou de plusieurs animaux. Pour contourner ces problèmes, quelques études chez l’homme, les chevaux et les porcs ont décrit des méthodes pour cultiver des organoïdes à partir de tissus intestinaux congelés (ou biopsies) ou de cryptes épithéliales isolées 4,15,16,17. Ces méthodes permettent la cryoconservation de cellules souches épithéliales intestinales provenant de plusieurs segments intestinaux d’un seul animal, qui peuvent ensuite être utilisées pour cultiver des organoïdes en cas de besoin. De plus, cela permet une forte réduction du nombre d’animaux vivants utilisés comme donneurs de cellules souches, car d’importants stocks de cryptes cryoconservées peuvent être créés (principes des 3R). Un autre avantage de cette méthode est la croissance des organoïdes intestinaux uniquement à partir d’animaux d’intérêt après avoir obtenu des résultats phénotypiques ou génotypiques, ce qui est très rentable.
In vivo, les cellules épithéliales intestinales sont polarisées, le côté apical étant dirigé vers la lumière. In vitro, dans les organoïdes 3D, la face apicale des cellules épithéliales est également face à la lumière (c’est-à-dire à l’intérieur des organoïdes)4. Cette organisation empêche l’accès au côté apical, ce qui est un problème lors de l’étude des effets des composants luminaux (p. ex. nutriments, microbes, métabolites) sur les cellules épithéliales. Pour contourner cet inconvénient, plusieurs méthodes ont été développées, telles que la culture de cellules organoïdes en monocouches 2D, la micro-injection et l’inversion de polarité (« organoïdes apical-out »)18,19. La culture de monocouches de cellules organoïdes est en train de devenir le système le plus efficace et le plus traitable. Le principe est de dissocier les organoïdes 3D en cellules uniques et de les ensemencer sur un récipient de culture cellulaire préalablement recouvert d’une fine couche de matrice extracellulaire (MEC)20. Dans ces conditions de culture, la face apicale des cellules épithéliales est orientée vers le haut, et est donc accessible à des traitements expérimentaux20. La culture de monocouches de cellules organoïdes a été récemment adaptée pour l’intestin de porc21,22; Les monocouches cellulaires dérivées d’organoïdes 3D porcins ont été utilisées pour de multiples applications, notamment l’étude des infections entériques 6,23,24,25, le transport des nutriments9 et la modélisation des maladies digestives 26.
Ici, cette étude présente d’abord un protocole détaillé pour la culture et le maintien d’organoïdes 3D intestinaux de porc dérivés de cryptes épithéliales cryoconservées (Figure 1). Ensuite, un protocole est décrit pour établir des monocouches cellulaires à partir d’organoïdes 3D intestinaux de porc. Les méthodes décrites ici fournissent des outils expérimentaux qui peuvent être utilisés pour étudier l’épithélium intestinal du porc pour le transport des nutriments, la fonction de barrière et les interactions hôte-microorganisme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Les organoïdes intestinaux sont de plus en plus utilisés pour étudier l’épithélium intestinal pour la modélisation des maladies digestives, ou pour étudier les interactions avec les médicaments, les nutriments, les métabolites, les agents pathogènes et le microbiote. Des méthodes de culture d’organoïdes intestinaux sont maintenant disponibles pour de multiples espèces, y compris les porcs, qui est une espèce d’intérêt majeur à la fois comme animal de ferme et comme modèle translationnel pour les humains, par exemple, pour étudier les maladies zoonotiques. Ici, nous donnons une description approfondie d’une procédure utilisée pour cultiver des organoïdes 3D intestinaux de porc à partir de cryptes épithéliales gelées. Le protocole décrit comment cryoconserver les cryptes épithéliales de l’intestin du porc et les procédures ultérieures pour cultiver des organoïdes intestinaux 3D. Les principaux avantages de cette méthode sont (i) la dissociation temporelle de l’isolement des cryptes de la culture d’organoïdes 3D, (ii) la préparation de stocks importants de cryptes cryoconservées provenant de plusieurs segments intestinaux et de plusieurs animaux à la fois, et donc (iii) la réduction du besoin d’échantillonner des tissus frais d’animaux vivants. Nous détaillons également un protocole pour établir des monocouches cellulaires dérivées d’organoïdes 3D pour permettre l’accès à la face apicale des cellules épithéliales, qui est le site d’interactions avec les nutriments, les microbes ou les médicaments. Dans l’ensemble, les protocoles décrits ici constituent une ressource utile pour étudier l’épithélium intestinal du porc dans la recherche vétérinaire et biomédicale.

Selon le protocole décrit ci-dessus, les cryptes épithéliales sont obtenues à partir de l’intestin du porc et cryoconservées pour un stockage à long terme dans de l’azote liquide (Figure 1 et Figure 2A). Après décongélation, les cellules souches cryptiques sont ensemencées dans l’ECM (Figure 2B). La structure de la crypte est généralement perdue après cette étape, en raison de la désintégration de la structure de la crypte dans l’ECM. Les organoïdes peuvent être observés en 3-4 jours, puis se développent rapidement et développent des structures bourgeonnantes (Figure 2B). Nous avons réussi à obtenir des organoïdes après décongélation de cryptes gelées dans >80% des tentatives. Environ 10 jours après la décongélation (selon le taux de croissance des organoïdes), un passage des organoïdes est effectué pour élargir la culture (Figure 3). Les organoïdes se développent plus rapidement après la division, et ils présentent diverses morphologies, avec quelques organoïdes kystiques et une majorité d’organoïdes bourgeonnants. Pour un maintien optimal de la culture, les organoïdes utilisés pour le passage doivent présenter une lumière claire et vide et des bords bien définis (exemples indiqués par des flèches vertes) sans débris noirs dans la lumière (indiqués par des flèches rouges), comme observé chez les organoïdes matures (Figure 3). Nous avons constaté que les débris de globules noirs commencent à s’accumuler vers le jour 6 après le décès. Ainsi, il est recommandé de diviser ou de congeler les organoïdes au jour 4-5 après le passage.
Le stade de maturité des organoïdes est également un point important dans l’obtention des monocouches cellulaires. Les organoïdes à maturité avancée (indiquée par la présence de débris de cellules noires dans la lumière) ne sont pas optimaux pour ensemencer des monocouches. Nous dissocions généralement les organoïdes 3D 4 jours après le passage pour collecter des cellules pour la culture 2D. Environ un à trois puits d’organoïdes 3D cultivés à 3 000 cellules par dôme de 50 μL de l’ECM sont nécessaires pour ensemencer un insert de culture de 2,5 x 105 cellules. Les cellules se fixent et forment une monocouche entièrement confluente en 1 jour (Figure 4A), ce qui est confirmé par le TEER élevé d’environ 700 Ω·cm2 (Figure 4B). Cependant, les bords cellulaires sont difficiles à visualiser par microscopie à fond clair à ce stade précoce, probablement en raison d’un faible niveau de différenciation. Le TEER reste élevé pendant 3 jours (Figure 4B).
La coloration à l’actine indique que la face apicale des cellules épithéliales est orientée vers la lumière dans les organoïdes 3D (Figure 5A). Les cellules organoïdes ensemencées en culture forment une couche unique confluente de cellules épithéliales, la face apicale étant orientée vers le compartiment supérieur (Figure 4B,C). La coloration à l’occludine révèle la présence de jonctions serrées du côté apical des cellules épithéliales dans les organoïdes 3D et dans les monocouches cellulaires (Figure 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique des méthodes utilisées pour cultiver des organoïdes 3D et des monocouches cellulaires dérivées d’organoïdes. Les cryptes épithéliales sont isolées de l’intestin du porcelet. Ces cryptes peuvent i) être utilisées immédiatement pour la culture d’organoïdes 3D ou ii) être congelées et stockées dans une biobanque dans de l’azote liquide. Les cryptes cryoconservées peuvent être décongelées et utilisées pour cultiver des organoïdes 3D. La culture organoïde 3D peut être maintenue par fractionnement successif, ou congelée et stockée dans la biobanque. Des monocouches cellulaires peuvent être obtenues à partir de la culture organoïde 3D pour permettre l’accès à la face apicale des cellules et étudier la fonction de barrière épithéliale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figure 2 : Culture d’organoïdes 3D intestinaux de porc provenant de cryptes épithéliales cryoconservées. (A) Image microscopique représentative de cryptes jéjunales fraîchement isolées. (B) Images microscopiques représentatives d’organoïdes 3D obtenues après décongélation des cryptes jéjunales. Les organoïdes ont été cultivés dans un dôme d’ECM de 25 μL dans une plaque de 48 puits. La figure montre des images des organoïdes 3D 4, 7, 8, 9 et 10 jours après l’ensemencement. La barre d’échelle représente 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figure 3 : Morphologie des organoïdes 3D intestinaux de porc dérivés de cryptes épithéliales cryoconservées après le premier passage. Images microscopiques représentatives montrant le développement d’organoïdes dérivés de cryptes de jéjunum cryoconservées après le premier passage du jour 4 au jour 7. Les flèches vertes indiquent des organoïdes clairs appropriés pour le passage ou l’ensemencement des monocouches. Les flèches rouges indiquent des organoïdes matures qui ne conviennent pas à la division ou à l’ensemencement des monocouches; Ainsi, les puits doivent être utilisés avant l’apparition de cette morphologie. La barre d’échelle représente 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figure 4 : Caractéristiques des monocouches cellulaires dérivées d’organoïdes 3D intestinaux de porc. (A) Images microscopiques représentatives de la morphologie de la monocouche sur 3 jours. Les cellules organoïdes de jéjunum ont été ensemencées à 2,5 x 105 cellules dans des inserts de culture cellulaire de 0,33 cm 2 recouvertsde collagène IV à 50 ng / mL. La barre d’échelle représente 500 μm. (B) Résistance électrique transépithéliale (TEER) des monocouches de cellules organoïdes sur 3 jours. Les points reliés par une ligne correspondent au même puits à des moments différents. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figure 5 : Imagerie d’organoïdes de jéjunum de porc cultivés en 3D ou 2D. Imagerie par microscopie confocale de (A) organoïdes 3D 5 jours après le fractionnement et de monocouches de cellules organoïdes (B,C) 3 jours après l’ensemencement (B: section XZ; C : section XY). L’ADN (bleu) a été coloré avec du DAPI. L’actine (rouge) était colorée à la phalloïdine. L’occludine (vert) a été colorée avec un anticorps polyclonal. Les flèches blanches indiquent l’occludine localisée à la jonction serrée. La barre d’échelle représente 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Ici, nous décrivons un protocole de culture d’organoïdes 3D intestinaux de porc à partir de cryptes épithéliales cryoconservées. Nous décrivons également une méthode pour établir des monocouches cellulaires dérivées d’organoïdes 3D, permettant l’accès à la face apicale des cellules épithéliales.

Culture d’organoïdes 3D intestinaux de porcelet à partir de cryptes épithéliales cryoconservées et établissement de monocouches cellulaires

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Notre protocole fournit des outils pour étudier l’épithélium intestinal du porc pour la recherche vétérinaire et biomédicale. Les organoïdes intestinaux des porcs peuvent être utilisés pour étudier le transport des nutriments, la fonction de barrière et les interactions hôte-microbe. Grâce à la préservation de l’intestin du porc, les cryptes épithéliales permettent de créer un stock important de cellules souches qui peuvent ensuite être utilisées pour la culture d’organoïdes en monocouches 3D ou 2D.Ce protocole est détaillé pour le jéjunum, mais il peut également être utilisé pour d’autres segments intestinaux tels que le duodénum, l’iléon et le côlon. Pour commencer, décongelez rapidement une fiole contenant 900 cryptes gelées dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Transférer la solution cryptique dans un tube conique de 15 millilitres.Centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant. Ajouter 150 microlitres de la matrice extracellulaire ou ECM avec une pointe refroidie pour obtenir une concentration finale de 150 cryptes pour 25 microlitres d’ECM. Pipet de haut en bas 10 fois pour obtenir une suspension homogène des cryptes dans l’ECM.Ensemencez six puits avec une goutte de 25 microlitres par puits dans une plaque préchauffée de 48 puits. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la polymérisation de l’ECM. Ajouter 250 microlitres par puits de culture de milieu à température ambiante et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Changez le milieu de culture tous les deux ou trois jours. Pour faire passer les organoïdes 3D dérivés de cryptes gelées 10 jours après l’ensemencement, retirez le milieu de culture et ajoutez 250 microlitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, remplacer le PBS par 250 microlitres de réactif de dissociation enzymatique préchauffé complété par 10 inhibiteurs de roche micromolaires à 37 degrés Celsius dans chaque puits.Détacher les organoïdes dans l’ECM en grattant avec une pipette P-1000 et homogénéiser soigneusement en pipetant cinq fois. Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avant de dissocier les cellules en pipetant de haut en bas 10 fois. Ajouter 500 microlitres de DMEMc dans chaque puits contenant des cellules dissociées et tirer jusqu’à 12 puits dans un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de DMEMc froid.Centrifuger à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de DMEMc froid. Compter les cellules avec une dilution de un à deux dans le bleu de trypan avec un compteur de cellules.Centrifuger le volume nécessaire de la solution cellulaire pour avoir 3000 cellules vivantes par dôme. Remettez en suspension la pastille avec 17 microlitres de DMEMc froid par 3000 cellules vivantes sur glace. Ajustez le volume au nombre de puits requis.Ajouter lentement 33 microlitres d’ECM froid pour 3000 cellules vivantes. Ajustez le volume au nombre requis de puits et homogénéisez sans faire de bulles. Ensuite, voir les puits avec 50 microlitres de suspension cellulaire ECM par puits dans une plaque préchauffée de 24 puits et incuber pendant 30 minutes pour la polymérisation de l’ECM.Ajouter 500 microlitres du milieu de culture par puits. Ensuite, incuber et changer le milieu de culture tous les deux à trois jours. Pour enduire l’insert de culture, préparer la solution d’enrobage contenant du collagène IV dilué à 50 microgrammes par millilitre dans du PBS froid.Ajouter 150 microlitres de la solution d’enrobage diluée à chaque insert de culture cellulaire et incuber pendant une nuit ou pendant trois heures. Cinq jours après la fendille, détacher les organoïdes avec l’ECM en les grattant avec une pipette P-1000. Homogénéiser soigneusement par pipetage dans le milieu de culture et transférer dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de DMEMc froid sur glace.Centrifuger les organoïdes collectés à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de réactif de dissociation enzymatique préchauffé complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Pipeter de haut en bas 10 fois pour initier la dissociation des organoïdes.Incuber pendant cinq minutes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pour la digestion enzymatique. Perturber mécaniquement les organoïdes en pipetant 10 fois et ajouter quatre millilitres de DMEMc glacé. Centrifuger et jeter le surnageant avant de remettre en suspension la pastille de cellule organoïde dans un millilitre de DMEMc.Compter les cellules dans le bleu de trypan avec un compteur de cellules et calculer le volume nécessaire pour ensemencer 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par insert de culture. Centrifuger le volume nécessaire de la suspension cellulaire correspondant à 2,5 fois 10 des cinquièmes cellules par insert de culture. Pendant la centrifugation, aspirez soigneusement la solution de revêtement des inserts de culture et laissez-la sécher sous le capot sans couvercle pendant cinq minutes.Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume nécessaire de milieu 2D complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Ensemencez 200 microlitres de la suspension cellulaire sur la membrane perméable revêtue. Ajouter 500 microlitres du milieu 2D complété par 10 micromolaires inhibiteurs de ROCK dans le compartiment inférieur et incuber.Une forte densité de cellules doit être observée sur la membrane. Un jour après l’ensemencement, remplacez les milieux épiques et basaux par des milieux 2D frais sans inhibiteur de ROCK. Changez de média chaque jour.La monocouche devient confluente un jour après l’ensemencement et peut être utilisée pour ses expériences. Dans cette étude, des cryptes épithéliales ont été obtenues à partir de l’intestin du porc et cryoconservées pour un stockage à long terme dans de l’azote liquide. Après décongélation, les cellules souches cryptiques ont été ensemencées dans l’ECM.Les organoïdes ont été observés en trois à quatre jours et ont rapidement grandi et développé des structures bourgeonnantes. Environ 10 jours après la décongélation, le passage des organoïdes a été effectué pour étendre la culture. Pour un maintien optimal de la culture, les organoïdes utilisés pour l’emballage doivent présenter une lumière claire et vide et des bords bien définis sans débris noirs dans la lumière comme observé chez les organoïdes matures.Les cellules se fixent et forment une monocouche entièrement confluente en une journée, ce qui est confirmé par la résistance électrique transépithéliale élevée, ou TEER, d’environ 700 centimètres carrés de dômes. Le TEER reste élevé pendant trois jours. La coloration à l’actine indique que la face apicale des cellules épithéliales est orientée vers la lumière dans les organoïdes 3D.Les cellules organoïdes ensemencées dans des inserts de culture forment une couche unique confluente de cellules épithéliales avec la face apicale orientée vers le compartiment supérieur. La coloration à l’occludine révèle la présence de jonctions serrées du côté apical des cellules épithéliales dans les organoïdes 3D et dans les monocouches cellulaires. Il est important de se rappeler que les organoïdes utilisés pour ensemencer les monocouches cellulaires doivent apparaître clairs avec une lumière vide sans débris noirs correspondant à une accumulation de cellules mortes.Les monocouches d’organoïdes intestinaux de porc peuvent être utilisées pour tester les effets des métabolites ou des microbes sur la fonction de barrière épithéliale en utilisant des tests fonctionnels, l’imagerie et l’analyse de l’expression génique.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Organoïdes épithéliales mucociliaires des cellules embryonnaires de Xenopus : génération, culture et imagerie vivante haute résolution

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Recherche

Biologie

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Génération de monocouches épithéliales primaires murines du côlon à partir de cryptes intestinales

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Établissement et manipulation génétique d’organoïdes d’hépatocytes murins

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

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Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

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3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Étude des effets épithéliaux de l’inflammation intestinale in vitro sur les colonoïdes murins établis

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...