Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig"-Projekt) und von INRAE HOLOFLUX ("Holopig"-Projekt) unterstützt. Dankbar sind die Autoren den Genotoul Core Facilities (TRI). Wir danken Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) für das sorgfältige Korrekturlesen.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kryokonservierung von Epithelkrypten aus dem Ferkeldarm für die Langzeitlagerung und anschließende Kultivierung von 3D-Organoiden. Dieses Protokoll verwendet eine Gefrierlösung, die DMSO, FBS, den Y27632 ROCK-Inhibitor, DMEM und Antibiotika enthält. In einer anderen Studie an Schweinen wurden Organoide aus Krypten gewonnen, die in einer ähnlichen Gefrierlösung kryokonserviert wurden, jedoch ohne den ROCK-Inhibitor15. Der Y27632 ROCK-Inhibitor wurde hinzugefügt, um Apoptose zu verhindern und den Stammzellpool aufrechtzuerhalten, da epitheliale Kryptenzellen nach dem Auftauen dissoziiert werden, was zum Zelltod ("anoikis") führen kann27,28. Interessanterweise wurden equine Enteroide aus Epithelkrypten gewonnen, die in einem Nährmedium eingefroren wurden, das nur DMEM und DMSO16 enthielt; Diese einfache Methode wurde noch nicht für Epithelkrypten von Schweinen getestet. Es wurden andere Methoden veröffentlicht, um Organoide von Menschen und Schweinen aus gefrorenem Gewebe oder Biopsien anstelle von Epithelkrypten zu züchten 4,17. Der Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, das Darmgewebe direkt zu kryokonservieren, ohne die Kryptenisolierung durchzuführen, die Zeit und Laborgeräte erfordert. Dies kann praktisch sein, wenn das Gewebe weit weg vom Labor entnommen werden muss. Bei der Isolierung der Krypten unmittelbar nach der Schlachtung können jedoch große Darmsegmente verarbeitet werden, um eine sehr hohe Anzahl von Krypten zu erhalten, was bei der Entnahme von kleinen gefrorenen Gewebefragmenten nicht der Fall ist. Nach dem Auftauen der Epithelkrypten wurden die Organoide 3-4 Tage nach der Aussaat beobachtet und nach 10 Tagen gespalten. Dies ist eine langsamere Wachstumsrate als beim Beginn der Kultur aus frischen Epithelkrypten, für die die Organoide ab Tag 1 nach der Aussaat gewonnen wurden, und kann in der Regel um Tag 5bis 11 geteilt werden. Khalil et al. berichteten auch über ein verzögertes Wachstum von Schweineenteroiden, wenn sie von gefrorenen Krypten ausgehen15, was darauf hindeutet, dass Stammzellen möglicherweise Zeit benötigen, um ihre proliferative Kapazität wiederzuerlangen. Wir erhielten auch eine geringere Anzahl von Organoiden, wenn wir aus gefrorenen Krypten im Vergleich zu frischen Krypten ausgingen, was auf das Absterben von Stammzellen während des Einfrierprozesses zurückzuführen sein könnte. Bei einigen Versuchen des Auftauens von Krypten (<20%) erhielten wir keine Organoide aus gefrorenen Krypten, wahrscheinlich aufgrund eines suboptimalen Kryokonservierungsverfahrens (z. B. verzögertes Einfrieren nach Kryptenisolierung von wahrscheinlich mehr als 1 h). Wir empfehlen daher, die Krypten bis zur Zählung auf Eis zu legen und sie so schnell wie möglich einzufrieren.
Für 3D-Organoide haben wir uns für ein kommerzielles Organoid-Nährmedium entschieden, das für den Menschen entwickelt wurde. In der Tat haben frühere Berichte gezeigt, dass Schweinedarmorganoide mit diesem Medium effizient wachsen 8,11,14,19,25,26,29,30. Es ist von Interesse, dass dieses Nährmedium gebrauchsfertig ist und eine standardisierte Konzentration von Wachstumsfaktoren innerhalb einer Charge aufweist. Dieses Nährmedium ist jedoch kostspielig, seine Zusammensetzung ist nicht offenbart und es ist daher nicht möglich, seine Zusammensetzung zu modulieren. Im Gegensatz dazu wurden in anderen Studien Darmorganoide von Schweinen in maßgeschneiderten Medien kultiviert, die pharmakologische Inhibitoren, rekombinante Wachstumsfaktoren und/oder konditionierte Medien enthielten 5,6,7,21. Obwohl diese Methode sehr flexibel und kostengünstig ist, ist sie zeitaufwändig für die Herstellung konditionierter Medien und kann aufgrund der potenziellen Variabilität in der Konzentration von Wachstumsfaktoren in konditionierten Medien nicht reproduzierbar sein. Daher sollte die Qualität jeder Charge konditionierter Medien durch Messung des Organoidwachstums oder der Markergenexpressionvalidiert werden 31.
Eine Studie hat gezeigt, dass jejunale Organoide von Schweinen, die in demselben kommerziellen Organoid-Nährmedium kultiviert wurden, das hier verwendet wurde, schneller wuchsen und weniger differenziert zu sein schienen, verglichen mit Enteroiden, die mit Medien kultiviert wurden, die rekombinanten Wachstumsfaktor und/oder konditionierten Medien enthielten23. Ein hoher proliferativer Zustand erleichtert die Kultivierung von 3D-Organoiden, erfordert jedoch möglicherweise eine Induktion der Differenzierung, um repräsentativer für die physiologischen Eigenschaften des Darms zu sein. Bei diesem Protokoll werden die Zellen für die Passage von 3D-Organoiden für die Zählung vollständig dissoziiert, wodurch die Anzahl der in der EZM ausgesäten Zellen kontrolliert werden kann. Dies erhöht die Reproduzierbarkeit des Phänotyps von Organoiden, die stark von ihrer Dichte beeinflusst wird. Darüber hinaus vermeidet die Zählung der Zellen, dass eine zu niedrige oder überfüllte Kultur erhalten wird, was eine Anpassung des Kulturplans erfordert. In den meisten anderen Studien wurden Organoidfragmente hergestellt, die nicht vollständig in einzelne Zellen dissoziiert waren, und ein Verdünnungsverhältnis für die Passage verwendet. Diese Methode ist einfacher, kann aber je nach Organoiddichte der Kultur zu einer Variabilität führen.
Für die Kultur in Monoschichten werden Organoidzellen in Kultureinsätze eingesät, die mit einer dünnen EZM-Schicht vorbeschichtet sind, die die Anheftung von Zellen ermöglicht, aber das Wachstum von Organoiden in 3D verhindert. Bei diesem Protokoll wurde Kollagen Typ IV als ECM-Protein verwendet, wie zuvor bei Schweinenbeschrieben 23. Andere Studien mit Schweine-Organoid-Monolayern verwendeten die gleiche tumorabgeleitete EZM, die hier verwendet wurde, um 3D-Organoide zu kultivieren 6,8,9,21,25,30. Der Vorteil der Verwendung von Kollagen ist die Möglichkeit, die Proteinkonzentration mit einer vollständig definierten Zusammensetzung zu standardisieren, was bei der tumorbedingten EZM nicht der Fall ist. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Kultivierung von Zellmonolayern besteht darin, auf das visuelle Erscheinungsbild der Vorläufer-3D-Organoide zu achten, die gut definierte Kanten und ein leeres Lumen ohne schwarze Trümmer aufweisen sollten. In der Tat sind Organoide mit einem hohen Reifegrad und einer niedrigen Proliferationsrate keine geeignete Zellquelle für die 2D-Kultur. Daher ist der Zeitpunkt der Dissoziation von 3D-Organoiden in einzelne Zellen entscheidend für den Erfolg dieses Schritts.
Die Kultivierung von 2D-Monoschichten aus einzelnen Zellen ermöglicht die Standardisierung der Anzahl der ausgesäten Zellen, was schwieriger ist, wenn man von Organoidfragmenten ausgeht, wie es bei einigen anderen Methoden der Fall ist. Wir säten 7,6 x 10 5 Zellen pro cm2 aus, was im Vergleich zu den meisten anderen Studien 21,22,23 bei Schweinen mit einer geringeren Zelldichte von 0,25 x 105 Zellen pro cm2 bis 1,78 x 105 Zellen pro cm2 hoch ist. Die Forderung nach einer hohen Anzahl von Organoidzellen stellt eine Einschränkung dieses Protokolls dar, aber es ermöglichte uns, schnell eine konfluente Monoschicht zu erhalten, die den Kultureinsatz nach 1 Tag vollständig bedeckt. Im Gegensatz dazu erreichten Vermeire et al.23 eine Konfluenz nach 4-7 Tagen mit einer geringeren Dichte der ausgesäten Zellen (von 0,25 x 10 5 Zellen/cm2 auf 0,4 x 105 Zellen/cm2). In einigen Studien wurden auch Organoidzell-Monoschichten von Schweinen verwendet, die die Kulturoberfläche für Infektionen mit Viren nicht vollständig bedeckten 8,30. Unter diesen Bedingungen ist die apikale Seite der Epithelzellen für Behandlungen zugänglich, aber vollständig konfluierende Monoschichten sind erforderlich, wenn das Ziel darin besteht, die Nährstoffaufnahme oder die Epithelpermeabilität zu untersuchen.
Für Organoidzell-Monolayer wurde ein kommerzielles Organoid-Nährmedium verwendet, das mit 20 % FBS ergänzt wurde, basierend auf einer kürzlich durchgeführten Studie an Rinder-Enteroid-Monolayern32. In unseren Tests war die Supplementierung mit 20% FBS notwendig, um vollständig konfluierende Monolagen zu erhalten, wahrscheinlich aufgrund eines hohen Wachstumsfaktorbedarfs. Im Gegenteil, andere Studien, die das gleiche kommerzielle Medium verwendeten, haben Monolagen ohne zusätzliche FBS 8,25,30 etabliert, ohne jedoch eine vollständige Konfluenz zu erreichen. In anderen Studien wurde auch eine Supplementierung mit 20 % FBS in einem maßgeschneiderten Medium für die Kultivierung von Organoidzell-Monolayern von Schweinen verwendet21,22. In unseren Experimenten ist TEER 1 Tag nach der Aussaat hoch (ca. 700 Ω·cm 2) und bleibt bis Tag 3 hoch (ca. 1.500 Ω·cm2; dies stimmt mit der Bildung von Tight Junctions überein, was durch die Expression von Occludin angezeigt wird. Van der Hee et al. erhielten ähnliche TEER-Werte über 72 h für Jejunum-Organoidzell-Monolayer21. Sie zeigten auch, dass Monoschichten bis zum 12. bis 15. Tag mit täglichem Medienwechsel aufrechterhalten werden können. Im Gegensatz dazu haben andere Studien viel niedrigere TEER-Werte (ca. 200 Ω·cm2) für Organoidzell-Monoschichten von Schweinen berichtet 6,22. Diese Unterschiede zwischen den Studien könnten mit dem untersuchten Darmsegment oder den verwendeten Medien zusammenhängen, die die Epitheldifferenzierung beeinflussen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das obige Protokoll zur Zucht von Schweinedarm-3D-Organoiden aus gefrorenen Epithelkrypten die Organisation der Kulturarbeit erleichtert. Es reduziert den Bedarf an frischem Gewebe, das von lebenden Tieren gewonnen werden muss. Wir erklären auch, wie man in weniger als 3 Tagen vollständig konfluierende Zellmonoschichten aus Schweineorganoiden herstellen kann. Daher könnten unsere Protokolle nützliche Ressourcen für Wissenschaftler sein, die das Darmepithel von Schweinen für die veterinärmedizinische oder biomedizinische Forschung untersuchen.

Das Darmepithel besteht aus einer Monoschicht von Zellen, die die Verdauungsschleimhaut an der Grenzfläche zur luminalen Umgebung bedecken. Diese Position ist mit verschiedenen Funktionen verbunden, wie z. B. der Nährstoffaufnahme und der Barrierefunktion, die durch das Vorhandensein von Stammzellen und mehreren differenzierten Epithelzelltypen (absorbierende, enteroendokrine, Paneth- und Becherzellen) unterstützt werden1. Immortalisierte Zelllinien, die traditionell zur Untersuchung von Epithelzellen verwendet werden, weisen große Einschränkungen auf, da sie nicht die zelluläre Komplexität des Darmepithels widerspiegeln und genomische Anomalien aufweisen2. Die Entwicklung von dreidimensionalen (3D) Organoiden durch Sato et al.3 lieferte ein neues Modell zur Untersuchung des Darmepithels mit einer verbesserten physiologischen Relevanz. Tatsächlich werden Darmorganoide aus nicht transformierten Stammzellen gewonnen, bestehen aus mehreren Zelltypen und rekapitulieren die Funktionalität des Darmepithels. Darmorganoide werden zunehmend verwendet, um die Entwicklung und Funktion des Darmepithels und seine Wechselwirkungen mit Krankheitserregern, Nährstoffen, Toxinen, Medikamenten, der Mikrobiota und ihren Metaboliten zu verstehen2.
Ursprünglich für Menschen und Mäuse entwickelt, wurden die Methoden zur Kultivierung von Darmorganoiden in jüngster Zeit auch auf andere Spezies übertragen, darunter Schweine4. Gonzales et al.5 waren die ersten, die Schweineorganoide aus dem Jejunum kultivierten; Seitdem wurden porcine Organoide für andere Darmsegmente (Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm) beschrieben6,7,8, und es wurde gezeigt, dass sie einen ortsspezifischen Phänotyp beibehalten 9,10,11. 3D-Organoide aus Schweinedarm werden heute häufig verwendet, um die Wirkung von Nährstoffen 12,13 oder Darminfektionen 6,8,14 zu untersuchen.
Die meisten Studien haben die Kultivierung von Darmorganoiden ausgehend von frisch isolierten Epithelkrypten beschrieben. Dies ist jedoch aus logistischen Gründen nicht immer möglich, insbesondere bei der Arbeit mit großen Tieren wie Schweinen. In der Tat können sich Tiereinrichtungen für Schweine weit vom Labor entfernt befinden, in dem Organoide kultiviert werden, was die Arbeitsorganisation erschwert. Darüber hinaus ist die Organoidkultur zeitaufwändig; Daher ist es nicht praktikabel, mehrere Organoidlinien gleichzeitig zu züchten, z. B. aus verschiedenen Darmsegmenten oder mehreren Tieren. Um diese Probleme zu umgehen, wurden in einigen Studien an Menschen, Pferden und Schweinen Methoden zur Kultivierung von Organoiden aus gefrorenem Darmgewebe (oder Biopsien) oder aus isolierten Epithelkryptenbeschrieben 4,15,16,17. Diese Methoden ermöglichen die Kryokonservierung von Darmepithelstammzellen aus mehreren Darmsegmenten eines einzigen Tieres, die dann bei Bedarf zur Züchtung von Organoiden verwendet werden können. Darüber hinaus ermöglicht dies eine starke Reduzierung der Anzahl lebender Tiere, die als Spender von Stammzellen verwendet werden, da große Bestände an kryokonservierten Krypten angelegt werden können (Prinzipien von 3R). Ein weiterer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass intestinale Organoide nur von Tieren von Interesse gezüchtet werden, nachdem phänotypische oder genotypische Ergebnisse erzielt wurden, was sehr kostengünstig ist.
In vivo sind die Darmepithelzellen polarisiert, wobei die apikale Seite zum Lumen gerichtet ist. In vitro ist bei 3D-Organoiden die apikale Seite der Epithelzellen ebenfalls dem Lumen zugewandt (d. h. innerhalb der Organoide)4. Diese Organisation verhindert den Zugang zur apikalen Seite, was ein Problem darstellt, wenn die Auswirkungen von luminalen Komponenten (z. B. Nährstoffe, Mikroben, Metaboliten) auf Epithelzellen untersucht werden. Um diesen Nachteil zu umgehen, wurden verschiedene Methoden entwickelt, wie z. B. die Kultur von Organoidzellen als 2D-Monolayer, die Mikroinjektion und die Polaritätsumkehr ("apikale Organoide")18,19. Die Kultivierung von Organoidzell-Monoschichten entwickelt sich zum effizientesten und kontrollierbarsten System. Das Prinzip besteht darin, 3D-Organoide in einzelne Zellen zu dissoziieren und sie auf ein Zellkulturgefäß zu legen, das zuvor mit einer dünnen Schicht extrazellulärer Matrix (EZM) beschichtet war20. Unter diesen Kulturbedingungen ist die apikale Seite der Epithelzellen nach oben gerichtet und somit für experimentelle Behandlungen zugänglich20. Die Kultivierung von Organoidzell-Monoschichten wurde kürzlich für den Schweinedarm adaptiert21,22; Zellmonoschichten, die aus Schweine-3D-Organoiden gewonnen wurden, wurden für zahlreiche Anwendungen verwendet, darunter die Untersuchung von enterischen Infektionen 6,23,24,25, des Transports von Nährstoffen 9 und der Modellierung von Verdauungskrankheiten 26.
In dieser Arbeit wird zunächst ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung und Konservierung von 3D-Organoiden aus dem Darm von Schweinen vorgestellt, die aus kryokonservierten Epithelkrypten gewonnen wurden (Abbildung 1). Anschließend wird ein Protokoll zur Etablierung von Zellmonoschichten aus 3D-Organoiden im Darm von Schweinen beschrieben. Die hier beschriebenen Methoden bieten experimentelle Werkzeuge, mit denen das Darmepithel von Schweinen auf Nährstofftransport, Barrierefunktion und Wirt-Mikroorganismus-Interaktionen untersucht werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Darmorganoide werden zunehmend verwendet, um das Darmepithel für die Modellierung von Verdauungskrankheiten zu untersuchen oder um Wechselwirkungen mit Medikamenten, Nährstoffen, Metaboliten, Krankheitserregern und der Mikrobiota zu untersuchen. Methoden zur Kultivierung von Darmorganoiden stehen jetzt für mehrere Spezies zur Verfügung, darunter auch Schweine, eine Spezies, die sowohl als Nutztier als auch als translationales Modell für den Menschen von großem Interesse ist, z. B. zur Untersuchung von Zoonosen. Hier geben wir eine ausführliche Beschreibung eines Verfahrens, das zur Kultivierung von 3D-Organoiden aus gefrorenen Epithelkrypten verwendet wird. Das Protokoll beschreibt die Kryokonservierung von Epithelkrypten aus dem Schweinedarm und die anschließenden Verfahren zur Kultivierung von 3D-Darmorganoiden. Die Hauptvorteile dieser Methode sind (i) die zeitliche Dissoziation der Isolierung von Krypten aus der Kultur von 3D-Organoiden, (ii) die Präparation großer Bestände an kryokonservierten Krypten, die aus mehreren Darmsegmenten und von mehreren Tieren gleichzeitig stammen, und damit (iii) die Verringerung der Notwendigkeit, frisches Gewebe von lebenden Tieren zu beproben. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Etablierung von Zellmonolayern, die von 3D-Organoiden abgeleitet sind, um den Zugang zur apikalen Seite von Epithelzellen zu ermöglichen, die der Ort der Wechselwirkungen mit Nährstoffen, Mikroben oder Medikamenten ist. Insgesamt sind die hier beschriebenen Protokolle eine nützliche Ressource für die Untersuchung des Darmepithels von Schweinen in der veterinärmedizinischen und biomedizinischen Forschung.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll werden Epithelkrypten aus dem Schweinedarm gewonnen und für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Nach dem Auftauen werden die Kryptenstammzellen in der EZM ausgesät (Abbildung 2B). Die Kryptenstruktur geht in der Regel nach diesem Schritt verloren, da die Kryptenstruktur im ECM zerfällt. Die Organoide können innerhalb von 3-4 Tagen beobachtet werden und wachsen dann schnell und entwickeln knospende Strukturen (Abbildung 2B). Wir erhielten erfolgreich Organoide, nachdem wir gefrorene Krypten in >80% der Versuche aufgetaut hatten. Etwa 10 Tage nach dem Auftauen (entsprechend der Wachstumsrate der Organoide) wird eine Passage von Organoiden durchgeführt, um die Kultur zu erweitern (Abbildung 3). Die Organoide wachsen nach der Spaltung schneller und weisen unterschiedliche Morphologien auf, wobei einige zystische und die meisten knospenden Organoide vorhanden sind. Um eine optimale Aufrechterhaltung der Kultur zu gewährleisten, müssen die für die Passage verwendeten Organoide ein klares und leeres Lumen und gut definierte Ränder aufweisen (Beispiele durch grüne Pfeile gekennzeichnet) ohne schwarze Ablagerungen im Lumen (gekennzeichnet durch rote Pfeile), wie dies bei reifen Organoiden zu beobachten ist (Abbildung 3). Wir fanden heraus, dass sich die Trümmer der schwarzen Blutkörperchen um den 6. Tag nach der Passage ansammeln. Daher wird empfohlen, die Organoide am 4.-5. Tag nach der Passage zu spalten oder einzufrieren.
Auch das Reifestadium der Organoide ist ein wichtiger Punkt bei der Gewinnung von Zellmonolagen. Organoide mit fortgeschrittener Reife (angezeigt durch das Vorhandensein von schwarzen Blutkörperchen im Lumen) sind nicht optimal, um Monoschichten zu besiedeln. In der Regel dissoziieren wir 3D-Organoide 4 Tage nach der Passage, um Zellen für die 2D-Kultur zu sammeln. Etwa ein bis drei Vertiefungen mit 3D-Organoiden, die mit 3.000 Zellen pro 50-μl-Kuppel der EZM kultiviert werden, werden benötigt, um einen Kultureinsatz mit 2,5 x 105 Zellen zu besiedeln. Die Zellen heften sich an und bilden innerhalb von 1 Tag eine vollständig konfluierende Monoschicht (Abbildung 4A), was durch den hohen TEER von etwa 700 Ω·cm2 bestätigt wird (Abbildung 4B). Allerdings sind die Zellränder zu diesem frühen Zeitpunkt mit der Hellfeldmikroskopie nur schwer sichtbar zu machen, was wahrscheinlich auf ein geringes Differenzierungsniveau zurückzuführen ist. Der TEER bleibt 3 Tage lang hoch (Abbildung 4B).
Die Aktinfärbung zeigt an, dass die apikale Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden zum Lumen hin ausgerichtet ist (Abbildung 5A). Organoide Zellen, die in den Kultureinsatz eingesät werden, bilden eine konfluente einzelne Schicht von Epithelzellen, wobei die apikale Seite zum oberen Kompartiment hin ausgerichtet ist (Abbildung 4B, C). Die Okkludinfärbung zeigt das Vorhandensein von Tight Junctions an der apikalen Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden und in Zellmonolagen (Abbildung 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methoden zur Kultivierung von 3D-Organoiden und Zellmonolayern, die von Organoiden abgeleitet sind. Epithelkrypten werden aus dem Ferkeldarm isoliert. Diese Krypten können i) sofort zur Kultivierung von 3D-Organoiden verwendet oder ii) eingefroren und in einer Biobank in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Kryokonservierte Krypten können aufgetaut und zur Kultivierung von 3D-Organoiden verwendet werden. Die 3D-Organoidkultur kann durch sukzessive Spaltung beibehalten oder eingefroren und in der Biobank gelagert werden. Aus der 3D-Organoidkultur können Zellmonoschichten gewonnen werden, um den Zugang zur apikalen Seite der Zellen zu ermöglichen und die epitheliale Barrierefunktion zu untersuchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Kultivierung von 3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkryptionen. (A) Repräsentative mikroskopische Aufnahme frisch isolierter Jejunalkrypten. (B) Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von 3D-Organoiden, die nach dem Auftauen der jejunalen Krypten aufgenommen wurden. Die Organoide wurden in einer 25 μL EZM-Kuppel in einer 48-Well-Platte kultiviert. Die Abbildung zeigt Bilder der 3D-Organoide 4, 7, 8, 9 und 10 Tage nach der Aussaat. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Morphologie von 3D-Organoiden aus dem Darm von Schweinen, die aus kryokonservierten Epithelkrypten nach der ersten Passage gewonnen wurden. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen, die die Entwicklung von Organoiden aus kryokonservierten Jejunumkrypten nach der ersten Passage von Tag 4 bis Tag 7 zeigen. Grüne Pfeile zeigen klare Organoide an, die für die Passage oder Aussaat von Monoschichten geeignet sind. Rote Pfeile zeigen reife Organoide an, die nicht zum Spalten oder Aussäen von Monoschichten geeignet sind. Daher sollten Brunnen vor der Erscheinung dieser Morphologie verwendet werden. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Charakteristika von Zellmonolayern, die aus 3D-Organoiden aus Schweineintestinalen abgeleitet wurden . (A) Repräsentative mikroskopische Aufnahmen der Monolayer-Morphologie über 3 Tage. Jejunum-Organoidzellen wurden bei 2,5 x 105 Zellen in 0,33 cm2 Zellkultureinsätze eingesät, die mit Kollagen i.v. bei 50 ng/ml beschichtet waren. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. (B) Transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER) von Organoidzell-Monolagen über 3 Tage. Punkte, die durch eine Linie verbunden sind, entsprechen demselben Well zu unterschiedlichen Zeiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Abbildung 5: Bildgebung von Schweine-Jejunum-Organoiden, die in 3D oder 2D kultiviert wurden. Konfokalmikroskopische Bildgebung von (A) 3D-Organoiden 5 Tage nach der Teilung und (B,C)-Organoidzell-Monolayern 3 Tage nach der Aussaat (B: XZ-Schnitt; C: XY-Abschnitt). Die DNA (blau) wurde mit DAPI gefärbt. Aktin (rot) wurde mit Phalloidin gefärbt. Occludin (grün) wurde mit einem polyklonalen Antikörper gefärbt. Weiße Pfeile zeigen Occludin an, das an der Tight Junction lokalisiert ist. Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Kultivierung von 3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkryptionen. Wir beschreiben auch eine Methode zur Etablierung von Zellmonolagen, die von 3D-Organoiden abgeleitet sind und den Zugang zur apikalen Seite von Epithelzellen ermöglichen.

Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unser Protokoll bietet Werkzeuge zur Untersuchung des Darmepithels von Schweinen für die veterinärmedizinische und biomedizinische Forschung. Darmorganoide von Schweinen können verwendet werden, um den Nährstofftransport, die Barrierefunktion und die Wirt-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Durch die Konservierung von Schweinedarmepithelkrypten kann ein großer Vorrat an Stammzellen erzeugt werden, die später zur Kultivierung von Organoiden in 3D- oder 2D-Monoschichten verwendet werden können.Dieses Protokoll wird für das Jejunum detailliert beschrieben, kann aber auch für andere Darmsegmente wie Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm verwendet werden. Tauen Sie zunächst schnell ein Fläschchen mit 900 gefrorenen Krypten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Kryptenlösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.Bei 300 x g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 150 Mikroliter der extrazellulären Matrix oder EZM mit einer gekühlten Spitze hinzu, um eine Endkonzentration von 150 Krypten pro 25 Mikroliter EZM zu erhalten. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um eine homogene Suspension der Krypten im ECM zu erhalten.Säen Sie sechs Vertiefungen mit einem Tropfen von 25 Mikrolitern pro Vertiefung in eine vorgewärmte 48-Well-Platte. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zur Polymerisation der EZM inkubieren. Fügen Sie 250 Mikroliter pro Vertiefung Kulturmedium bei Raumtemperatur hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Wechseln Sie das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Um 3D-Organoide aus gefrorenen Krypten 10 Tage nach der Aussaat zu passieren, entfernen Sie das Nährmedium und fügen Sie 250 Mikroliter vorgewärmtes PBS bei 37 Grad Celsius hinzu. Ersetzen Sie das PBS nach der Inkubation durch 250 Mikroliter vorgewärmtes Enzymdissoziationsreagenz, das mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren bei 37 Grad Celsius in jeder Vertiefung ergänzt wird.Lösen Sie die Organoide im ECM durch Schaben mit einer P-1000-Pipette und homogenisieren Sie sie vorsichtig durch fünfmaliges Pipettieren. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Zellen durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren dissoziieren. Geben Sie 500 Mikroliter DMEMc in jede Vertiefung mit dissoziierten Zellen und ziehen Sie bis zu 12 Vertiefungen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern kaltem DMEMc.Bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter kaltem DMEMc. Zählen Sie die Zellen mit einer Verdünnung von ein bis zwei in Trypanblau mit einem Zellzähler.Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zelllösung, um 3000 lebende Zellen pro Kuppel zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet mit 17 Mikrolitern kaltem DMEMc pro 3000 lebende Zellen auf Eis. Stellen Sie die Lautstärke auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen ein.Fügen Sie langsam 33 Mikroliter kalte ECM pro 3000 lebende Zellen hinzu. Stellen Sie das Volumen auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen ein und homogenisieren Sie, ohne Blasen zu bilden. Sehen Sie sich dann die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern der ECM-Zellsuspension pro Well in einer vorgewärmten 24-Well-Platte an und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang für die Polymerisation der ECM.Fügen Sie 500 Mikroliter des Nährmediums pro Vertiefung hinzu. Inkubieren und wechseln Sie dann das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Um den Kultureinsatz zu beschichten, bereiten Sie die Beschichtungslösung mit Kollagen IV vor, die mit 50 Mikrogramm pro Milliliter in kaltem PBS verdünnt ist.Geben Sie 150 Mikroliter der verdünnten Beschichtungslösung in jeden Zellkultureinsatz und inkubieren Sie sie über Nacht oder drei Stunden lang. Fünf Tage nach dem Spalten lösen Sie die Organoide mit dem ECM, indem Sie sie mit einer P-1000-Pipette abkratzen. Vorsichtig durch Pipettieren im Nährmedium homogenisiert und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern kaltem DMEMc auf Eis überführen.Zentrifugieren Sie die gesammelten Organoide bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Enzymdissoziationsreagenz, das mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren ergänzt wird. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um die Dissoziation der Organoide einzuleiten.Zur enzymatischen Verdauung fünf Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Brechen Sie die Organoide mechanisch auf, indem Sie 10 Mal pipettieren und vier Milliliter eiskaltes DMEMc hinzufügen. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Organoid-Zellpellet in einem Milliliter DMEMc resuspendieren.Zählen Sie die Zellen in Trypanblau mit einem Zellzähler und berechnen Sie das notwendige Volumen, um 2,5 mal 10 bis fünfte Zellen pro Kultureinsatz auszusäen. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension entsprechend 2,5 mal 10 der fünften Zellen pro Kultureinsatz. Während der Zentrifugation die Beschichtungslösung vorsichtig aus den Kultureinsätzen absaugen und fünf Minuten lang ohne Deckel unter der Haube trocknen lassen.Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in der erforderlichen Menge an 2D-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, resuspendiert. 200 Mikroliter der Zellsuspension auf die beschichtete durchlässige Membran aufbringen. 500 Mikroliter des 2D-Mediums, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, in das untere Kompartiment geben und inkubieren.Auf der Membran sollte eine hohe Zelldichte beobachtet werden. Einen Tag nach der Aussaat werden die epischen und basalen Medien durch frische 2D-Medien ohne den ROCK-Inhibitor ersetzt. Wechseln Sie jeden Tag das Medium.Die Monolage wird einen Tag nach der Aussaat konfluent und kann für ihre Experimente verwendet werden. In dieser Arbeit wurden epitheliale Krypten aus dem Schweinedarm gewonnen und für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Nach dem Auftauen wurden die Kryptenstammzellen in der EZM ausgesät.Die Organoide wurden innerhalb von drei bis vier Tagen beobachtet und wuchsen schnell und entwickelten knospende Strukturen. Etwa 10 Tage nach dem Auftauen wurde die Passage von Organoiden durchgeführt, um die Kultur zu erweitern. Für eine optimale Aufrechterhaltung der Kultur müssen die für die Verpackung verwendeten Organoide ein klares und leeres Lumen und gut definierte Ränder ohne schwarze Ablagerungen im Lumen aufweisen, wie sie bei reifen Organoiden beobachtet werden.Die Zellen lagern sich an und bilden innerhalb eines Tages eine vollständig konfluierende Monoschicht, was durch den hohen transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) von etwa 700 Quadratzentimetern bestätigt wird. Der TEER bleibt drei Tage lang hoch. Die Aktinfärbung zeigt an, dass die apikale Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden zum Lumen hin ausgerichtet ist.Organoide Zellen, die in Kultureinsätzen ausgesät werden, bilden eine konfluierende Einzelschicht von Epithelzellen, wobei die apikale Seite zum oberen Kompartiment hin ausgerichtet ist. Die Okkludinfärbung zeigt das Vorhandensein von Tight Junctions an der apikalen Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden und in Zellmonolagen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Organoide, die zur Aussaat von Zellmonoschichten verwendet werden, klar mit einem leeren Lumen ohne schwarze Ablagerungen erscheinen sollten, die einer Ansammlung toter Zellen entsprechen.Monoschichten aus Darmorganoiden von Schweinen können verwendet werden, um die Auswirkungen von Metaboliten oder Mikroben auf die epitheliale Barrierefunktion zu testen, indem funktionelle Assays, Bildgebung und Genexpressionsanalysen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mukociliäre Epithelorganoide aus Xenopus Embryonal cells: Generation, Culture und High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Forschung

Biologie

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...