Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Institut Carnot France Futur Elevage (פרויקט "OrganoPig") ועל ידי INRAE HOLOFLUX (פרויקט "Holopig"). המחברים אסירי תודה למתקני הליבה של Genotoul (TRI). אנו מודים לכריסטל קנודסן (GenPhySE, INRAE, Toulouse) על הגהה קפדנית.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשמשת לשימור קריפטות אפיתל ממעי החזרזיר לאחסון לטווח ארוך ולתרבית עוקבת של אורגנואידים תלת-ממדיים. פרוטוקול זה משתמש בתמיסת הקפאה המכילה DMSO, FBS, מעכב ROCK Y27632, DMEM ואנטיביוטיקה. מחקר אחר בחזירים השיג אורגנואידים מקריפטות שנשמרו בהקפאה בתמיסת הקפאה דומה, אך ללא מעכב ROCK15. מעכב Y27632 ROCK נכלל כדי למנוע אפופטוזיס ולשמור על מאגר תאי הגזע מכיוון שלאחר ההפשרה, תאי קריפטת אפיתל מנותקים, מה שעלול להוביל למוות תאי ('אנואיקיס')27,28. מעניין, אנטרואידים סוסים התקבלו מקריפטות אפיתל שהוקפאו במדיום תרבית המכיל רק DMEM ו- DMSO16; שיטה פשוטה זו עדיין לא נבדקה עבור קריפטים אפיתל חזיר. שיטות אחרות פורסמו לגידול אורגנואידים אנושיים וחזירים מרקמות קפואות או ביופסיות במקום קריפטות אפיתל 4,17. היתרון של שיטה זו הוא היכולת ישירות cryoלשמר את רקמות המעי מבלי לבצע את הליך בידוד קריפטה, אשר דורש זמן וציוד מעבדה. זה עשוי להיות נוח כאשר הרקמות צריכות להיאסף הרחק מהמעבדה. עם זאת, כאשר מבודדים את הקריפטים מיד לאחר השחיטה, חלקים גדולים של המעי ניתן לעבד כדי להשיג מספר גבוה מאוד של crypts, וזה לא המקרה כאשר מתחילים משברי רקמות קפואים קטנים. לאחר הפשרת קריפטים אפיתליאליים, אורגנואידים נצפו מ 3-4 ימים לאחר הזריעה ופיצול לאחר 10 ימים. זהו קצב גדילה איטי יותר מאשר כאשר מתחילים את התרבית מקריפטות אפיתל טריות, שעבורן האורגנואידים התקבלו מהיום הראשון שלאחר הזריעה, ובדרך כלל ניתן לפצל אותם בסביבות יום 511. חליל ועמיתיו דיווחו גם על עיכוב בגדילה של אנטרואידים של חזירים כאשר הם מתחילים מקריפטיםקפואים 15, דבר המצביע על כך שתאי גזע עשויים לדרוש זמן כדי לשחזר את יכולת ההתרבות שלהם. השגנו גם מספר נמוך יותר של אורגנואידים כאשר התחלנו מקריפטים קפואים בהשוואה לקריפטים טריים, אשר עשויים לנבוע ממוות של תאי גזע במהלך תהליך ההקפאה. בחלק מהניסיונות להפשיר קריפטים (<20%), לא השגנו אורגנואידים מקריפטות קפואות, כנראה בגלל הליך שימור קריוגני לא אופטימלי (למשל, הקפאה מאוחרת לאחר בידוד קריפטה של יותר משעה אחת). לכן, אנו ממליצים לשמור את הקריפטות על קרח עד הספירה, ולהקפיא אותם מהר ככל האפשר.
עבור אורגנואידים תלת-ממדיים, בחרנו להשתמש במדיום תרבית אורגנואידים מסחרי שפותח עבור בני אדם. ואכן, דיווחים קודמים הראו כי אורגנואידים במעיים חזיר גדלים ביעילות עם מדיום זה 8,11,14,19,25,26,29,30. זה מעניין עבור מדיום תרבות זה להיות מוכן לשימוש יש ריכוז סטנדרטי של גורמי צמיחה בתוך אצווה. עם זאת, מדיום תרבות זה הוא יקר, הרכבו אינו ידוע, ולכן לא ניתן לווסת את הרכבו. לעומת זאת, מחקרים אחרים תרבו אורגנואידים של מעי חזיר במדיה מותאמת אישית המכילה מעכבים פרמקולוגיים, גורם גדילה רקומביננטי ו/או מדיה מותנית 5,6,7,21. למרות שהיא גמישה מאוד וזולה יותר, שיטה זו גוזלת זמן רב לייצור מדיה מותנית ועלולה להיות חסרת יכולת שחזור בשל שונות פוטנציאלית בריכוז גורמי הצמיחה במדיה מותנית. לפיכך, יש לאמת את האיכות של כל אצווה של מדיה מותנית על ידי מדידת גידול אורגנואידים או ביטוי גנים סמן31.
מחקר הראה כי אורגנואידים ג'ג'ונליים של חזירים שגודלו באותו מדיום תרבית אורגנואידים מסחרי המשמש כאן גדלו מהר יותר ונראו פחות מובחנים, בהשוואה לאנטרואידים שתורבתו עם מדיה המכילה גורם גדילה רקומביננטי ו / או מדיה מותנית23. מצב שגשוג גבוה מאפשר את התרבות של אורגנואידים תלת-ממדיים, אך עשוי לדרוש גרימת התמיינות כדי לייצג יותר את המאפיינים הפיזיולוגיים של המעי. בפרוטוקול זה, עבור המעבר של אורגנואידים 3D, התאים מנותקים לחלוטין לספירה, המאפשר לשלוט במספר התאים זרע ECM. זה מגדיל את יכולת השחזור של הפנוטיפ של אורגנואידים, אשר מושפע מאוד על ידי צפיפותם. יתר על כן, ספירת התאים מונעת קבלת תרבית נמוכה מדי או צפופה מדי, הדורשת התאמת לוח הזמנים של התרבית. רוב המחקרים האחרים הכינו מקטעי אורגנואידים שלא נותקו לחלוטין לתאים בודדים, והשתמשו ביחס דילול למעבר. שיטה זו פשוטה יותר, אך עשויה לגרום לשונות בהתאם לצפיפות האורגנואידים של התרבית.
עבור התרבית בחד-שכבות, תאי אורגנואיד נזרעים בתוספות תרבית מצופות מראש בשכבה דקה של ECM, המאפשרת התקשרות של תאים אך מונעת צמיחה של אורגנואידים בתלת-ממד. פרוטוקול זה השתמש בקולגן מסוג IV כחלבון ECM, כפי שתואר קודם לכן בחזירים23. מחקרים אחרים עם חד-שכבות אורגנואידים חזיריות השתמשו באותו ECM שמקורו בגידול המשמש כאן לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים 6,8,9,21,25,30. היתרון בשימוש בקולגן הוא היכולת לתקנן את ריכוז החלבון בהרכב מוגדר במלואו, מה שלא קורה ב-ECM שמקורו בגידול. צעד קריטי להצלחת התרבות של monolayers התא הוא לשים לב המראה החזותי של מבשר 3D אורגנואידים, אשר צריך להיות קצוות מוגדרים היטב לומן ריק ללא פסולת שחורה. ואכן, אורגנואידים בעלי רמת התבגרות גבוהה וקצב התרבות נמוך אינם מקור מתאים לתאים לתרבית דו-ממדית. לפיכך, העיתוי של דיסוציאציה של אורגנואידים תלת-ממדיים לתאים בודדים הוא קריטי להצלחת שלב זה.
התרבות של monolayers 2D מתאים בודדים מאפשר סטנדרטיזציה של מספר התאים זרע, וזה קשה יותר כאשר מתחילים מקטעים אורגנואידים, כפי שבוצע בכמה שיטות אחרות. זרענו 7.6 x 10 5 תאים לס"מ 2, שזה גבוה בהשוואה לרוב המחקרים האחרים 21,22,23 בחזירים שהשתמשו בצפיפות תאים נמוכה יותר, שנעה בין 0.25 x 10 5 תאים לס"מ 2 ל 1.78 x 10 5 תאים לס"מ 2. הדרישה למספר גבוה של תאים אורגנואידים מהווה מגבלה של פרוטוקול זה, אך היא אפשרה לנו להשיג במהירות מונושכבה קונפלואנטית, המכסה במלואה את עלון התרבית לאחר יום אחד. לעומת זאת, Vermeire et al.23 השיגו מפגש לאחר 4-7 ימים עם צפיפות נמוכה יותר של תאים שנזרעו (מ 0.25 x 10 5 תאים / ס"מ 2 ל 0.4 x 105 תאים / ס"מ2). מחקרים מסוימים השתמשו גם בחד-שכבות של תאי אורגנואיד חזירים שלא כיסו באופן מלא את משטח התרבית לזיהומים בנגיפים 8,30. במצבים אלה, הצד האפי של תאי אפיתל נגיש לטיפולים, אך יש צורך בחד-שכבות מתמזגות לחלוטין אם המטרה היא לחקור ספיגת חומרים מזינים או חדירות אפיתל.
עבור חד-שכבות של תאים אורגנואידים, נעשה שימוש במדיום תרבית אורגנואידים מסחרי בתוספת 20% FBS, בהתבסס על מחקר שנערך לאחרונה על מונושכבות32 שמקורן באנטרואידים בקר. בבדיקות שלנו, תוספת עם 20% FBS היה הכרחי כדי להשיג monolayers confluent מלא, כנראה בשל דרישה גורם גדילה גבוהה. להיפך, מחקרים אחרים המשתמשים באותו מדיום מסחרי ביססו מונושכבות ללא FBS 8,25,30 נוספים, אך מבלי להגיע למפגש מלא. מחקרים אחרים השתמשו גם בתוסף עם 20% FBS במדיום מותאם אישית לתרבית של חד-שכבות תאי אורגנואיד חזיר21,22. בניסויים שלנו, TEER גבוה יום אחד לאחר הזריעה (סביב 700 Ω·cm 2), ונשאר גבוה עד יום 3 (סביב 1,500 Ω·cm2; זה עקבי עם היווצרות של צמתים הדוקים, כפי שמצוין על ידי ביטוי של occludin. Van der Hee et al. השיגו ערכי TEER דומים מעל 72 שעות עבור חד-שכבות של תאי אורגנואיד ג'ג'ונום21. הם גם הראו כי ניתן לשמור על חד-שכבות עד היום ה-12-15 עם שינויי מדיה יומיים. לעומת זאת, מחקרים אחרים דיווחו על ערכי TEER נמוכים בהרבה (בסביבות 200 Ω·cm2) עבור חד-שכבות של תאי אורגנואיד חזירים 6,22. הבדלים אלה בין מחקרים עשויים להיות קשורים למקטע המעיים שנחקר או למדיה המשמשת המשפיעה על התמיינות אפיתל.
לסיכום, הפרוטוקול הנ"ל לגידול אורגנואידים תלת ממדיים במעי חזיר מקריפטות אפיתל קפואות מקל על ארגון עבודת התרבית. זה מפחית את הצורך רקמות טריות להתקבל מבעלי חיים חיים. אנו גם מסבירים כיצד להקים מונושכבות תאים מתמזגות לחלוטין שמקורן באורגנואידים חזירים תוך פחות משלושה ימים. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו יכולים להיות משאבים שימושיים עבור מדענים החוקרים את אפיתל מעי החזיר למחקר וטרינרי או ביו-רפואי.

אפיתל המעי נוצר על ידי monolayer של תאים המכסים את רירית העיכול בממשק עם הסביבה הלומינלית. מיקום זה קשור לתפקודים מגוונים, כגון ספיגת חומרי מזון ותפקוד המחסום, הנתמכים על ידי נוכחות תאי גזע וסוגי תאי אפיתל ממוינים מרובים (תאי ספיגה, אנטרואנדוקרינית, פאנת וגביע)1. קווי תאים אימורטליים המשמשים באופן מסורתי לחקר תאי אפיתל יש מגבלות גדולות, שכן הם אינם משקפים את המורכבות התאית של אפיתל המעי ומציגים הפרעות גנומיות2. הפיתוח של אורגנואידים תלת מימדיים (3D) על ידי Sato et al.3 סיפק מודל חדש לחקר אפיתל המעי עם רלוונטיות פיזיולוגית משופרת. ואכן, אורגנואידים במעיים נגזרים מתאי גזע שלא עברו טרנספורמציה, מורכבים מסוגי תאים מרובים, ומשחזרים את הפונקציונליות של אפיתל המעי. אורגנואידי מעיים משמשים יותר ויותר להבנת ההתפתחות והתפקודים של אפיתל המעי והאינטראקציות שלו עם פתוגנים, חומרים מזינים, רעלים, תרופות, המיקרוביוטה והמטבוליטים שלה2.
השיטות שפותחו בתחילה עבור בני אדם ועכברים, המשמשות לתרבית אורגנואידים במעיים הותאמו לאחרונה למינים אחרים, כולל חזירים4. גונזלס ואחרים 5 היו הראשונים לגדל אורגנואידים חזירים מהג'ג'ונום; מאז, אורגנואידים חזיריים תוארו עבור מקטעי מעיים אחרים (תריסריון, איליאום ומעי גס)6,7,8, והוכחו כשומרים על פנוטיפ ספציפי למיקום 9,10,11. אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר משמשים כיום בדרך כלל לחקר ההשפעה של חומרים מזינים12,13 או זיהומים אנטריים 6,8,14.
רוב המחקרים תיארו את התרבית של אורגנואידי מעיים החל מקריפטות אפיתל מבודדות טריות. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי מסיבות לוגיסטיות, במיוחד כאשר עובדים עם בעלי חיים גדולים כגון חזירים. ואכן, מתקנים לבעלי חיים לחזירים יכולים להיות ממוקמים הרחק מהמעבדה שבה מתורבתים אורגנואידים, מה שמסבך את ארגון העבודה. יתר על כן, תרבות אורגנואידים גוזלת זמן; לכן, אין זה מעשי לגדל בו זמנית קווי אורגנואידים מרובים, למשל, ממקטעי מעיים שונים או מכמה בעלי חיים. כדי לעקוף בעיות אלה, כמה מחקרים בבני אדם, סוסים וחזירים תיארו שיטות לתרבית אורגנואידים מרקמות מעי קפואות (או ביופסיות) או מקריפטות אפיתל מבודדות 4,15,16,17. שיטות אלה מאפשרות שימור בהקפאה של תאי גזע אפיתל מעיים ממקטעי מעיים מרובים של חיה אחת, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לגדל אורגנואידים בעת הצורך. יתר על כן, זה מאפשר הפחתה חזקה במספר בעלי החיים המשמשים כתורמים של תאי גזע, שכן מלאי גדול של crypts cryopreserved ניתן ליצור (עקרונות של 3R). יתרון נוסף של שיטה זו הוא גידול אורגנואידים במעיים רק מבעלי חיים בעלי עניין לאחר קבלת תוצאות פנוטיפיות או גנוטיפיות, וזה חסכוני מאוד.
In vivo, תאי אפיתל המעי מקוטבים, כאשר הצד האפי מופנה לכיוון הלומן. במבחנה, באורגנואידים תלת-ממדיים, הצד האפי של תאי אפיתל פונה גם הוא אל הלומן (כלומר, בתוך האורגנואידים)4. ארגון זה מונע גישה לצד האפיקאלי, דבר המהווה בעיה כאשר חוקרים את ההשפעות של רכיבים לומינליים (למשל, חומרי מזון, חיידקים, מטבוליטים) על תאי אפיתל. כדי לעקוף חיסרון זה, פותחו מספר שיטות, כגון תרבית תאי אורגנואידים כחד-שכבות דו-ממדיות, מיקרו-הזרקה והיפוך קוטביות ("אורגנואידים אפיקליים")18,19. התרבית של חד-שכבות תאים אורגנואידים מסתמנת כמערכת היעילה והגמישה ביותר. העיקרון הוא לנתק אורגנואידים תלת-ממדיים לתאים בודדים ולזרוע אותם על כלי תרבית תאים שהיה מצופה בעבר בשכבה דקה של מטריצה חוץ-תאית (ECM)20. בתנאי תרבית אלה, הצד האפי של תאי האפיתל פונה כלפי מעלה, ולכן נגיש לטיפולים ניסיוניים20. התרבית של חד-שכבות תאים אורגנואידים הותאמה לאחרונה למעי החזיר21,22; חד-שכבות תאיות שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים של חזירים שימשו ליישומים רבים, כולל מחקר של זיהומים אנטריים 6,23,24,25, הובלת חומרים מזינים9 ומידול מחלות עיכול 26.
כאן, המחקר הזה מציג לראשונה פרוטוקול מפורט לתרבית ולתחזוקה של אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר שמקורם בקריפטות אפיתל שמורות בהקפאה (איור 1). לאחר מכן, מתואר פרוטוקול ליצירת מונושכבות תאים מאורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר. השיטות המתוארות כאן מספקות כלים ניסיוניים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את אפיתל מעי החזיר להובלת חומרי מזון, תפקוד מחסום ואינטראקציות בין מיקרואורגניזם מארח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

אורגנואידים של המעי משמשים יותר ויותר לחקר אפיתל המעי לצורך מידול מחלות עיכול, או כדי לחקור אינטראקציות עם תרופות, חומרים מזינים, מטבוליטים, פתוגנים והמיקרוביוטה. שיטות לתרבית אורגנואידים במעיים זמינות כיום עבור מינים רבים, כולל חזירים, שהוא מין בעל עניין רב הן כחיית משק והן כמודל תרגום לבני אדם, למשל, לחקר מחלות זואונוטיות. כאן, אנו נותנים תיאור מעמיק של הליך המשמש לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתל קפואים. הפרוטוקול מתאר כיצד לשמר בהקפאה קריפטות אפיתל ממעי החזיר ואת ההליכים הבאים לתרבית אורגנואידים תלת ממדיים במעי. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם: (i) הדיסוציאציה הטמפורלית של בידוד הקריפטות מהתרבות של אורגנואידים תלת-ממדיים, (ii) הכנת מלאי גדול של קריפטים שמורים בהקפאה שמקורם במקטעי מעיים מרובים וממספר בעלי חיים בבת אחת, ובכך (iii) הפחתת הצורך לדגום רקמות טריות מבעלי חיים חיים. אנו גם מפרטים פרוטוקול ליצירת חד-שכבות תאיות שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים כדי לאפשר גישה לצד האפי של תאי אפיתל, שהוא האתר של אינטראקציות עם חומרי מזון, מיקרובים או תרופות. בסך הכל, הפרוטוקולים המתוארים כאן הם משאב שימושי לחקר אפיתל מעיים חזיר במחקר וטרינרי וביו-רפואי.

בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל, קריפטים אפיתליאליים מתקבלים ממעי החזיר ונשמרים בהקפאה לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי (איור 1 ואיור 2A). לאחר ההפשרה, תאי הגזע של הקריפטה נזרעים ב-ECM (איור 2B). מבנה הקריפטה הולך לאיבוד בדרך כלל לאחר שלב זה, עקב התפוררות מבנה הקריפטה ב- ECM. ניתן לצפות באורגנואידים תוך 3-4 ימים, ואז לגדול במהירות ולפתח מבנים ניצנים (איור 2B). השגנו בהצלחה אורגנואידים לאחר הפשרת קריפטות קפואות ב->80% מהניסיונות. כ-10 ימים לאחר ההפשרה (בהתאם לקצב הגדילה של אורגנואידים), מתבצע מעבר של אורגנואידים כדי להרחיב את התרבית (איור 3). האורגנואידים גדלים מהר יותר לאחר הפיצול, והם מציגים מורפולוגיות מגוונות, עם כמה ציסטיים ורוב אורגנואידים ניצנים. לתחזוקה אופטימלית של התרבית, האורגנואידים המשמשים למעבר חייבים להציג לומן ברור וריק וקצוות מוגדרים היטב (דוגמאות מסומנות על-ידי חיצים ירוקים) ללא פסולת שחורה בלומן (מסומנת על-ידי חיצים אדומים), כפי שנצפה באורגנואידים בוגרים (איור 3). מצאנו שפסולת תאים שחורים מתחילה להצטבר סביב יום 6 לאחר המעבר. לכן, מומלץ לפצל או להקפיא את האורגנואידים ביום 4-5 לאחר המעבר.
שלב הבשלות של האורגנואידים הוא גם נקודה חשובה בהשגת חד-שכבות תאים. אורגנואידים עם בגרות מתקדמת (מסומנת על ידי נוכחות של פסולת תאים שחורים בלומן) אינם אופטימליים לזרעים monolayers. בדרך כלל אנו מנתקים אורגנואידים תלת-ממדיים 4 ימים לאחר המעבר כדי לאסוף תאים לתרבית דו-ממדית. כבאר אחת עד שלוש בארות של אורגנואידים תלת-ממדיים בתרבית של 3,000 תאים לכל כיפה של 50 מיקרוליטר של ECM דרושים לזריעת תוספת תרבית אחת עם 2.5 x 105 תאים. תאים מתחברים ויוצרים שכבה חד-שכבתית מלאה תוך יום אחד (איור 4A), אשר מאושר על-ידי TEER גבוה של כ-700 Ω·cm2 (איור 4B). עם זאת, קשה לדמיין את קצוות התא במיקרוסקופ שדה בהיר בנקודת זמן מוקדמת זו, כנראה בשל רמת התמיינות נמוכה. ה-TEER נשאר גבוה במשך 3 ימים (איור 4B).
צביעת אקטין מצביעה על כך שהצד האפי של תאי האפיתל מכוון לכיוון הלומן באורגנואידים תלת-ממדיים (איור 5A). תאי אורגנואיד שנזרעו בתרבית יוצרים שכבה אחת של תאי אפיתל, כאשר הצד האפי מכוון לכיוון התא העליון (איור 4B,C). צביעת אוקלודין חושפת נוכחות של צמתים הדוקים בצד האפי של תאי האפיתל באורגנואידים תלת-ממדיים ובחד-שכבות של תאים (איור 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של השיטות ששימשו לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים וחד-שכבות של תאים שמקורם באורגנואידים. קריפטים אפיתל מבודדים ממעי חזרזיר. קריפטים אלה יכולים לשמש באופן מיידי לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים או ii) להיות מוקפאים ומאוחסנים בביובנק בחנקן נוזלי. ניתן להפשיר קריפטות בהקפאה ולהשתמש בהן לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים. ניתן לתחזק את תרבית האורגנואידים התלת-ממדית באמצעות פיצול עוקב, או להקפיא ולאחסן בביו-בנק. ניתן לקבל חד-שכבות של תאים מתרבית אורגנואידים תלת-ממדית כדי לאפשר גישה לצד האפי של התאים ולחקור את תפקוד מחסום האפיתל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> איור 2: תרבית של אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. (A) תמונה מיקרוסקופית מייצגת של קריפטים ג'ג'ונליים שזה עתה בודדו. (B) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של אורגנואידים תלת-ממדיים שהתקבלו לאחר הפשרת הקריפטות הג'ג'ונליות. האורגנואידים תורבתו בכיפה של 25 μL של ECM בצלחת של 48 בארות. האיור מציג תמונות של אורגנואידים תלת-ממדיים ב-4, 7, 8, 9 ו-10 ימים לאחר הזריעה. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> איור 3: מורפולוגיה של אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר שמקורם בקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה לאחר המעבר הראשון. תמונות מיקרוסקופיות מייצגות המראות את התפתחות האורגנואידים שמקורם בקריפטות ג'ג'ונום שמורים בהקפאה לאחר המעבר הראשון מהיום הרביעי ליום השביעי. חיצים ירוקים מציינים אורגנואידים ברורים המתאימים למעבר או זריעה של חד-שכבות. חיצים אדומים מציינים אורגנואידים בוגרים שאינם מתאימים לפיצול או זריעה של חד-שכבות; לפיכך, יש להשתמש בוולס לפני הופעת מורפולוגיה זו. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> איור 4: מאפיינים של חד-שכבות תאיות שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים של מעי חזיר . (A) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של המורפולוגיה החד-שכבתית במשך 3 ימים. תאי אורגנואיד ג'ג'ונום נזרעו בגודל 2.5 x 105 תאים לתוך 0.33 ס"מ2 תוספות תרבית תאים מצופות קולגן IV ב 50 ng / mL. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרומטר. (B) התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) של חד-שכבות תאי אורגנואיד במשך 3 ימים. נקודות המחוברות על ידי קו מתאימות לאותה באר בזמנים שונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> איור 5: הדמיה של אורגנואידים של חזיר ג'ג'ונום שגודלו בתרבית תלת-ממדית או דו-ממדית. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של (A) אורגנואידים תלת-ממדיים 5 ימים לאחר הפיצול ו-(B,C) חד-שכבות של תאים אורגנואידים 3 ימים לאחר הזריעה (B: XZ section; ג: סעיף XY). DNA (כחול) הוכתם ב-DAPI. אקטין (אדום) היה מוכתם בפלואידין. Occludin (ירוק) היה מוכתם עם נוגדן רב שבטי. חיצים לבנים מציינים אוקלודין הממוקם בצומת ההדוק. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. אנו מתארים גם שיטה להקמת חד-שכבות תאים הנגזרות מאורגנואידים תלת-ממדיים, המאפשרים גישה לצד האפי של תאי אפיתל.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

הפרוטוקול שלנו מספק כלים לחקר אפיתל מעי החזיר למחקר וטרינרי וביו-רפואי. אורגנואידים במעיים מחזירים יכולים לשמש לחקר הובלת חומרי מזון, תפקוד מחסום ואינטראקציות בין מיקרואורגניזמים מארחים. באמצעות שימור של קריפטים אפיתל מעיים חזיר מאפשרים ליצור מלאי גדול של תאי גזע כי מאוחר יותר ניתן להשתמש בהם לתרבית אורגנואיד ב monolayers 3D או 2D.פרוטוקול זה מפורט עבור הג'ג'ונום, אך ניתן להשתמש בו גם עבור מקטעי מעיים אחרים כגון תריסריון, איליאום ומעי גס. כדי להתחיל, במהירות להפשיר בקבוקון המכיל 900 crypts קפואים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. העבר את תמיסת הקריפטה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant. הוסף 150 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית או ECM עם קצה מקורר כדי לקבל ריכוז סופי של 150 crypts לכל 25 מיקרוליטר של ECM. Pipet למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להשיג השעיה הומוגנית של crypts ב ECM.זרעו שש בארות עם טיפה של 25 מיקרוליטר לבאר בצלחת 48 בארות שחוממה מראש. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% לצורך פילמור של ה-ECM. מוסיפים 250 מיקרוליטר לבאר של תרבית בינונית בטמפרטורת החדר ודגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.החליפו את מדיום התרבות כל יומיים-שלושה. כדי להעביר אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם בקריפטות קפואות 10 ימים לאחר הזריעה, הסירו את מצע התרבית והוסיפו 250 מיקרוליטר PBS שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, החלף את PBS עם 250 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה אנזים מחומם מראש בתוספת 10 מעכב סלע מיקרומולרי ב 37 מעלות צלזיוס בכל באר.נתק את האורגנואידים ב- ECM על ידי גירוד עם פיפטה P-1000 והומוגניזציה בזהירות על ידי פיפט חמש פעמים. יש לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני לפני ניתוק התאים על ידי פיטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. הוסף 500 מיקרוליטר של DMEMc בכל באר המכילה תאים מנותקים ומשוך עד 12 בארות בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של DMEMc קר.צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-DMEMc קר במיליליטר אחד. ספרו את התאים עם דילול של אחד עד שניים בכחול טריפאן עם מונה תאים.צנטריפוגה את הנפח הדרוש של תמיסת התא כדי לקבל 3000 תאים חיים לכל כיפה. להשעות את הגלולה עם 17 מיקרוליטר של DMEMc קר לכל 3000 תאים חיים על קרח. התאם את עוצמת הקול למספר הבארות הנדרש.הוסף לאט 33 מיקרוליטר של ECM קר לכל 3000 תאים חיים. התאם את עוצמת הקול למספר הבארות הנדרש והומוגניזציה מבלי ליצור בועות. לאחר מכן לראות את הבארות עם 50 מיקרוליטר של השעיית תא ECM לכל באר בצלחת 24 בארות שחוממה מראש לדגור במשך 30 דקות פילמור של ECM.מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום התרבית לכל באר. לאחר מכן דוגרים ומשנים את מדיום התרבית כל יומיים-שלושה. כדי לצפות את תוספת התרבית, הכינו את תמיסת הציפוי המכילה קולגן IV מדולל ב-50 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS קר.מוסיפים 150 מיקרוליטר של תמיסת הציפוי המדולל לכל תרבית תאים, מחדירים ודגרים למשך לילה או שלוש שעות. חמישה ימים לאחר הפיצול, נתקו את האורגנואידים עם ה-ECM על ידי גירודם עם פיפטה P-1000. הומוגני בזהירות על ידי פיפטינג בתווך התרבית ולהעביר לצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של DMEMc קר על קרח.צנטריפוגה את האורגנואידים שנאספו ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה אנזים שחומם מראש בתוספת מעכב ROCK מיקרומולרי 10. פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים כדי ליזום דיסוציאציה של האורגנואידים.לדגור במשך חמש דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לעיכול אנזימטי. לשבש מכנית את האורגנואידים על ידי pipetting 10 פעמים ולהוסיף ארבעה מיליליטר של DMEMc קר כקרח. צנטריפוגה ולהשליך את supernatant לפני resuspending את גלולת התא organoid במיליליטר אחד של DMEMc.ספרו את התאים בכחול טריפאן עם מונה תאים וחשבו את הנפח הדרוש לזרע 2.5 כפול 10 עד התאים החמישיים לכל תוספת תרבית. צנטריפוגה את הנפח הדרוש של תרחיף התא המתאים 2.5 פעמים 10 של התאים החמישי לכל תוספת תרבית. במהלך הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את תמיסת הציפוי מתוספות התרבית ואפשרו לה להתייבש מתחת למכסה המנוע ללא המכסה במשך חמש דקות.לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בנפח הדרוש של מדיום דו-ממדי בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולארי. זרעו 200 מיקרוליטר של תרחיף התא על הקרום החדיר המצופה. הוסף 500 מיקרוליטר של המדיום הדו-ממדי בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי לתא התחתון ודגירה.צפיפות גבוהה של תאים יש לראות על הממברנה. יום לאחר הזריעה, החלף את המדיה האפית והבסיסית במדיה דו-ממדית רעננה ללא מעכב ROCK. שנה את המדיה בכל יום.החד-שכבה מתמזגת יום אחד לאחר הזריעה וניתן להשתמש בה לניסוייה. במחקר זה, קריפטות אפיתל התקבלו ממעי החזיר ונשמרו בהקפאה לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי. לאחר ההפשרה, תאי הגזע של הקריפטה נזרעו ב- ECM.האורגנואידים נצפו תוך שלושה עד ארבעה ימים וגדלו במהירות ופיתחו מבנים ניצנים. כ-10 ימים לאחר ההפשרה, בוצע מעבר של אורגנואידים כדי להרחיב את התרבות. לתחזוקה אופטימלית של התרבית, האורגנואידים המשמשים לאריזה חייבים להציג לומן ברור וריק וקצוות מוגדרים היטב ללא פסולת שחורה בלומן כפי שנצפה באורגנואידים בוגרים.תאים מתחברים ויוצרים חד-שכבה מתמזגת לחלוטין תוך יום אחד, אשר מאושרת על ידי התנגדות חשמלית טרנסאפיתל גבוהה, או TEER, של כ -700 סנטימטרים רבועים. ה-TEER נשאר גבוה במשך שלושה ימים. צביעת אקטין מצביעה על כך שהצד האפי של תאי האפיתל מכוון לכיוון הלומן באורגנואידים תלת-ממדיים.תאים אורגנואידים שנזרעו בתוספות תרבית יוצרים שכבה אחת של תאי אפיתל כאשר הצד האפי מכוון לכיוון התא העליון. צביעת אוקלודין חושפת את נוכחותם של צמתים הדוקים בצד האפי של תאי האפיתל באורגנואידים תלת-ממדיים ובחד-שכבות של תאים. חשוב לזכור כי אורגנואיד המשמש לזרע חד-שכבות תאים צריך להיראות צלול עם לומן ריק ללא פסולת שחורה המתאימה להצטברות של תאים מתים.ניתן להשתמש בחד-שכבות מאורגנואיד מעי חזיר כדי לבדוק את ההשפעות של מטבוליטים או מיקרובים על תפקוד מחסום האפיתל באמצעות בדיקות פונקציונליות, הדמיה וניתוח ביטוי גנים.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...