Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

इस काम को इंस्टीट्यूट कार्नोट फ्रांस फ्यूचर एलीवेज ("ऑर्गेनोपिग" परियोजना) और INRAE HOLOFLUX ("होलोपिग" परियोजना) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक जीनोटौल कोर सुविधाओं (टीआरआई) के आभारी हैं। हम सावधानीपूर्वक प्रूफरीडिंग के लिए क्रिस्टेल नुडसेन (जेनफिज़, आईएनआरएई, टूलूज़) को स्वीकार करते हैं।

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

आंतों के उपकला का निर्माण ल्यूमिनल वातावरण के साथ इंटरफ़ेस पर पाचन श्लेष्म को कवर करने वाली कोशिकाओं के एक मोनोलेयर द्वारा किया जाता है। यह स्थिति पोषक तत्व अवशोषण और बाधा समारोह जैसे विविध कार्यों से जुड़ी हुई है, जो स्टेम कोशिकाओं और कई विभेदित उपकला कोशिका प्रकारों (अवशोषक, एंटरोएंडोक्राइन, पनेथ और गोब्लेट कोशिकाओं) की उपस्थिति द्वारा समर्थित हैं। पारंपरिक रूप से उपकला कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली अमर कोशिका लाइनों की प्रमुख सीमाएं हैं, क्योंकि वे आंतों के उपकला की सेलुलर जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं औरजीनोमिक असामान्यताएं प्रस्तुत करते हैं। सातो एट अल.3 द्वारा त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड्स के विकास ने आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक नया मॉडल प्रदान किया, जिसमें एक बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता थी। दरअसल, आंतों के ऑर्गेनोइड गैर-रूपांतरित स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, कई सेल प्रकारों से बने होते हैं, और आंतों के उपकला की कार्यक्षमता को पुन: उत्पन्न करते हैं। आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आंतों के उपकला के विकास और कार्यों और रोगजनकों, पोषक तत्वों, विषाक्त पदार्थों, दवाओं, माइक्रोबायोटा और इसके मेटाबोलाइट्सके साथ इसकी बातचीत को समझने के लिए किया जा रहा है।
प्रारंभ में मनुष्यों और चूहों के लिए विकसित, आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को हाल हीमें सूअरों सहित अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया गया है। गोंजालेस एट अल.5 जेजुनम से सुअर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति करने वाले पहले व्यक्ति थे; तब से, पोर्सिन ऑर्गेनोइड्स को अन्य आंत खंडों (ग्रहणी, इलियम और बृहदान्त्र) 6,7,8 के लिए वर्णित किया गया है, और एक स्थान-विशिष्ट फेनोटाइप 9,10,11 को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। सुअर आंतों 3 डी ऑर्गेनोइड्स का उपयोग अब आमतौर पर पोषक तत्वों12,13 या एंटरिक संक्रमण 6,8,14 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
अधिकांश अध्ययनों ने ताजा पृथक उपकला क्रिप्ट्स से शुरू होने वाले आंतों के ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति का वर्णन किया है। हालांकि, यह हमेशा तार्किक कारणों से संभव नहीं होता है, विशेष रूप से सूअरों जैसे बड़े जानवरों के साथ काम करते समय। दरअसल, सूअरों के लिए पशु सुविधाएं प्रयोगशाला से दूर स्थित हो सकती हैं जहां ऑर्गेनोइड सुसंस्कृत होते हैं, जो कार्य संगठन को जटिल बनाता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड संस्कृति समय लेने वाली है; इस प्रकार, एक साथ कई ऑर्गेनॉइड लाइनों को विकसित करना व्यावहारिक नहीं है, उदाहरण के लिए, विभिन्न आंत खंडों या कई जानवरों से। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, मनुष्यों, घोड़ों और सूअरों में कुछ अध्ययनों ने जमे हुए आंतों के ऊतकों (या बायोप्सी) या पृथक उपकला क्रिप्ट 4,15,16,17 से ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के तरीकों का वर्णन किया है। ये विधियां एक ही जानवर के कई आंत खंडों से आंतों के उपकला स्टेम कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन की अनुमति देती हैं, जिसका उपयोग तब आवश्यकता होने पर ऑर्गेनोइड्स को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह स्टेम कोशिकाओं के दाताओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले जीवित जानवरों की संख्या में एक मजबूत कमी की अनुमति देता है, क्योंकि क्रायोप्रिजर्व्ड क्रिप्ट्स के बड़े स्टॉक बनाए जा सकते हैं (3 आर के सिद्धांत)। इस विधि का एक और लाभ फेनोटाइपिक या जीनोटाइपिक परिणाम प्राप्त करने के बाद केवल रुचि के जानवरों से आंतों के ऑर्गेनोइड्स का विकास है, जो अत्यधिक लागत प्रभावी है।
विवो में, आंतों के उपकला कोशिकाओं को ध्रुवीकृत किया जाता है, जिसमें एपिकल पक्ष लुमेन की ओर निर्देशित होता है। विट्रो में, 3 डी ऑर्गेनोइड्स में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष भी लुमेन (यानी, ऑर्गेनोइड्स के अंदर) का सामना कर रहा है। यह संगठन एपिकल पक्ष तक पहुंच को रोकता है, जो उपकला कोशिकाओं पर ल्यूमिनल घटकों (जैसे, पोषक तत्वों, रोगाणुओं, मेटाबोलाइट्स) के प्रभावों का अध्ययन करते समय एक मुद्दा है। इस नुकसान को दरकिनार करने के लिए, कई तरीकों को विकसित किया गया है, जैसे कि 2 डी मोनोलेयर, माइक्रोइंजेक्शन और पोलैरिटी रिवर्सल ("एपिकल-आउट ऑर्गेनोइड्स") 18,19 के रूप में ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की संस्कृति। ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति सबसे कुशल और वापस लेने योग्य प्रणाली के रूप में उभर रही है। सिद्धांत 3 डी ऑर्गेनोइड्स को एकल कोशिकाओं में अलग करना है और उन्हें एक सेल कल्चर पोत पर बीज देना है जो पहले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 20 की एक पतली परत के साथ लेपित था। इन संस्कृति स्थितियों में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष ऊपर की ओर है, और इस प्रकार प्रयोगात्मक उपचार20 के लिए सुलभ है। ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति को हाल ही में सुअर आंत21,22 के लिए अनुकूलित किया गया था; सुअर 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया गया है, जिसमें एंटरिक संक्रमण 6,23,24,25, पोषक तत्वों का परिवहन9, और पाचन रोग मॉडलिंग26 शामिल हैं।
यहां, यह अध्ययन पहले क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स (चित्रा 1) से प्राप्त सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और रखरखाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। फिर, सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स से सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यहां वर्णित विधियां प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करती हैं जिनका उपयोग पोषक तत्व परिवहन, बाधा समारोह और मेजबान-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन के लिए सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पाचन रोग मॉडलिंग के लिए आंत उपकला का अध्ययन करने के लिए, या दवाओं, पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स, रोगजनकों और माइक्रोबायोटा के साथ बातचीत की जांच करने के लिए किया जा रहा है। आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के तरीके अब सूअरों सहित कई प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, जो एक खेत जानवर के रूप में और मनुष्यों के लिए एक ट्रांसलेशनल मॉडल के रूप में प्रमुख रुचि की एक प्रजाति है, उदाहरण के लिए, जूनोटिक रोगों का अध्ययन करने के लिए। यहां, हम जमे हुए उपकला क्रिप्ट से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का गहन विवरण देते हैं। प्रोटोकॉल बताता है कि सुअर की आंत से उपकला क्रिप्ट्स को कैसे क्रायोप्रिजर्व किया जाए और 3 डी आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए बाद की प्रक्रियाएं। इस पद्धति के मुख्य लाभ हैं (i) 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति से क्रिप्ट्स के अलगाव का अस्थायी पृथक्करण, (ii) कई आंतों के खंडों और कई जानवरों से एक साथ प्राप्त क्रायोसंरक्षित क्रिप्ट्स के बड़े स्टॉक की तैयारी, और इस प्रकार (iii) जीवित जानवरों से ताजा ऊतकों का नमूना लेने की आवश्यकता में कमी। हम उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति देने के लिए 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी विस्तार करते हैं, जो पोषक तत्वों, रोगाणुओं या दवाओं के साथ बातचीत की साइट है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल पशु चिकित्सा और जैव चिकित्सा अनुसंधान में सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी संसाधन है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, उपकला क्रिप्ट्स सुअर की आंत से प्राप्त किए जाते हैं और तरल नाइट्रोजन (चित्रा 1 और चित्रा 2 ए) में दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोसंरक्षित होते हैं। पिघलने के बाद, क्रिप्ट स्टेम कोशिकाओं को ईसीएम (चित्रा 2 बी) में बीज दिया जाता है। ईसीएम में क्रिप्ट संरचना के विघटन के कारण, इस चरण के बाद क्रिप्ट संरचना आमतौर पर खो जाती है। ऑर्गेनोइड्स को 3-4 दिनों के भीतर देखा जा सकता है, और फिर तेजी से बढ़ता है और नवोदित संरचनाओं को विकसित करता है (चित्रा 2 बी)। हमने >80% प्रयासों में जमे हुए क्रिप्ट को पिघलाने के बाद सफलतापूर्वक ऑर्गेनोइड प्राप्त किए। पिघलने के लगभग 10 दिन बाद (ऑर्गेनोइड्स की वृद्धि दर के अनुसार), संस्कृति का विस्तार करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का एक मार्ग किया जाता है (चित्रा 3)। ऑर्गेनोइड विभाजित होने के बाद तेजी से बढ़ते हैं, और वे कुछ सिस्टिक और अधिकांश उभरते ऑर्गेनोइड्स के साथ विविध आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं। संस्कृति के इष्टतम रखरखाव के लिए, पासिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑर्गेनोइड्स को एक स्पष्ट और खाली लुमेन और अच्छी तरह से परिभाषित किनारों (हरे तीरों द्वारा इंगित उदाहरण) को प्रस्तुत करना चाहिए, जिसमें लुमेन में कोई काला मलबा नहीं है (लाल तीर द्वारा इंगित), जैसा कि परिपक्व ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 3) में देखा गया है। हमने पाया कि ब्लैक सेल का मलबा 6 वें दिन के आसपास जमा होना शुरू हो जाता है। इस प्रकार, 4-5 दिन के बाद ऑर्गेनोइड्स को विभाजित या फ्रीज करने की सिफारिश की जाती है।
सेल मोनोलेयर प्राप्त करने में ऑर्गेनोइड्स का परिपक्वता चरण भी एक महत्वपूर्ण बिंदु है। उन्नत परिपक्वता वाले ऑर्गेनोइड्स (लुमेन में काले सेल मलबे की उपस्थिति से संकेत मिलता है) बीज मोनोलेयर के लिए इष्टतम नहीं हैं। हम आमतौर पर 2 डी संस्कृति के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पारित होने के 4 दिन बाद 3 डी ऑर्गेनोइड्स को अलग करते हैं। ईसीएम के प्रति 50 μL गुंबद में 3,000 कोशिकाओं पर संवर्धित 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लगभग एक से तीन कुओं को 2.5 x10 5 कोशिकाओं के साथ एक कल्चर डालने के लिए आवश्यक है। कोशिकाएं 1 दिन के भीतर एक पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर को जोड़ती हैं और बनाती हैं (चित्रा 4 ए), जिसकी पुष्टि लगभग 700 Ω सेमी2 (चित्रा 4 बी) के उच्च टीईआर द्वारा की जाती है। हालांकि, सेल किनारों को इस शुरुआती समय बिंदु पर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करना मुश्किल है, शायद कम भेदभाव स्तर के कारण। टीईआर 3 दिनों के लिए उच्च रहता है (चित्रा 4 बी)।
एक्टिन धुंधला होना इंगित करता है कि उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष 3 डी ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 5 ए) में लुमेन की ओर उन्मुख है। संस्कृति में बीजित ऑर्गेनोइड कोशिकाएं उपकला कोशिकाओं की एक कंफ्लुएंट एकल परत बनाती हैं, जिसमें एपिकल पक्ष ऊपरी डिब्बे (चित्रा 4 बी, सी) की ओर उन्मुख होता है। ऑक्लुडिन धुंधला होने से 3 डी ऑर्गेनोइड्स और सेल मोनोलेयर (चित्रा 5 ए-सी) में उपकला कोशिकाओं के एपिकल साइड पर तंग जंक्शनों की उपस्थिति का पता चलता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> चित्रा 1: ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड्स और सेल मोनोलेयर को कल्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एपिथेलियल क्रिप्ट्स को पिगलेट आंत से अलग किया जाता है। इन क्रिप्ट्स का उपयोग तुरंत 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए किया जा सकता है या ii) तरल नाइट्रोजन में बायोबैंक में जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है। क्रायोप्रिजर्व्ड क्रिप्ट्स को पिघलाया जा सकता है और 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृति को क्रमिक विभाजन के साथ बनाए रखा जा सकता है, या बायोबैंक में जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है। कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति देने और उपकला बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए सेल मोनोलेयर को 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृति से प्राप्त किया जा सकता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> चित्रा 2: क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति। (ए) ताजा पृथक जेजुनल क्रिप्ट्स की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवि। (बी) जेजुनल क्रिप्ट्स के पिघलने के बाद प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां। ऑर्गेनोइड्स को 48-वेल प्लेट में ईसीएम के 25 μL गुंबद में सुसंस्कृत किया गया था। यह आंकड़ा 4, 7, 8, 9 और 10 दिनों के बाद 3 डी ऑर्गेनोइड्स की छवियों को दिखाता है। स्केल पट्टी 500 μm का प्रतिनिधित्व करती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> चित्रा 3: पहले मार्ग के बाद क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट से प्राप्त सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की आकृति विज्ञान। प्रतिनिधि सूक्ष्म चित्र जो दिन 4 से दिन 7 तक पहले मार्ग के बाद क्रायोसंरक्षित जेजुनम क्रिप्ट्स से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स के विकास को दर्शाते हैं। हरे तीर मोनोलेयर के मार्ग या सीडिंग के लिए उपयुक्त स्पष्ट ऑर्गेनोइड्स का संकेत देते हैं। लाल तीर परिपक्व ऑर्गेनोइड्स को इंगित करते हैं जो मोनोलेयर को विभाजित या सीडिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं; इस प्रकार, इस आकृति विज्ञान के मूल्यांकन से पहले कुओं का उपयोग किया जाना चाहिए। स्केल पट्टी 500 μm का प्रतिनिधित्व करती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> चित्र 4: सुअर आंतों 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर की विशेषताएं। (ए) 3 दिनों में मोनोलेयर आकृति विज्ञान की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां। जेजुनम ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं को 2.5 x 105 कोशिकाओं में 0.33 सेमी2 सेल कल्चर इंसर्ट में 50 एनजी / एमएल पर कोलेजन IV के साथ लेपित किया गया था। स्केल बार 3 दिनों में ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर के 500 μm. (B) ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (TEER) का प्रतिनिधित्व करता है। एक रेखा से जुड़े बिंदु अलग-अलग समय पर एक ही कुएं के अनुरूप होते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> चित्रा 5: 3 डी या 2 डी में संवर्धित सुअर जेजुनम ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग। विभाजन के 5 दिन बाद (ए) 3 डी ऑर्गेनोइड्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और सीडिंग के 3 दिन बाद (बी, सी) ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर (बी: एक्सजेड सेक्शन; सी: एक्सवाई अनुभाग)। डीएनए (नीला) DAPI के साथ सना हुआ था। एक्टिन (लाल) फेलोइडिन से सना हुआ था। ऑक्लुडिन (हरा) एक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी से सना हुआ था। सफेद तीर तंग जंक्शन पर स्थानीयकृत ऑक्लुडिन का संकेत देते हैं। स्केल पट्टी 20 μm का प्रतिनिधित्व करती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

यहां, हम क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक विधि का भी वर्णन करते हैं, जिससे उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति मिलती है।

क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से पिगलेट इंटेस्टाइनल 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और सेल मोनोलेयर की स्थापना

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

हमारा प्रोटोकॉल पशु चिकित्सा और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए उपकरण प्रदान करता है। सूअरों से आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पोषक तत्व परिवहन, बाधा समारोह और मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। सुअर आंतों के उपकला क्रिप्ट के संरक्षण के माध्यम से स्टेम सेल का एक बड़ा स्टॉक बनाने की अनुमति देता है जिसका उपयोग बाद में 3 डी या 2 डी मोनोलेयर में ऑर्गेनॉइड को कल्चर करने के लिए किया जा सकता है।यह प्रोटोकॉल जेजुनम के लिए विस्तृत है, लेकिन इसका उपयोग ग्रहणी, इलियम और बृहदान्त्र जैसे अन्य आंतों के खंडों के लिए भी किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 900 जमे हुए क्रिप्ट युक्त एक शीशी को जल्दी से पिघलाएं। क्रिप्ट समाधान को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें। ईसीएम के प्रति 25 माइक्रोलीटर में 150 क्रिप्ट की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कूल्ड टिप के साथ बाह्य मैट्रिक्स या ईसीएम के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। ईसीएम में क्रिप्ट्स का समरूप निलंबन प्राप्त करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे करें।प्री-वार्मेड 48-वेल प्लेट में प्रति कुएं 25 माइक्रोलीटर ड्रॉप के साथ छह कुओं को बीज दें। ईसीएम के पोलीमराइजेशन के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर मध्यम की संस्कृति के 250 माइक्रोलीटर प्रति कुएं जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें।हर दो से तीन दिन में संस्कृति माध्यम बदलें। बीज बोने के 10 दिन बाद जमे हुए क्रिप्ट से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड्स को पारित करने के लिए, कल्चर मीडिया को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्मेड पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन बाद, पीबीएस को 250 माइक्रोलीटर प्री-वार्मेड एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक के साथ बदलें, जो प्रत्येक कुएं में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ पूरक है।पी -1000 पिपेट के साथ स्क्रैप करके ईसीएम में ऑर्गेनोइड्स को अलग करें और पांच बार पाइप करके सावधानीपूर्वक समरूप करें। 10 बार ऊपर और नीचे पाइप करके कोशिकाओं को अलग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अलग-थलग कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं में डीएमईएमसी के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और तीन मिलीलीटर ठंडे डीएमईएमसी वाले 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 12 कुओं तक खींचें।सेंट्रीफ्यूज 500 x g पर चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और गोली को एक मिलीलीटर ठंडे डीएमईएमसी में फिर से निलंबित करें। सेल काउंटर के साथ ट्रिपैन ब्लू में एक से दो के कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं की गणना करें।प्रति गुंबद 3000 जीवित कोशिकाओं के लिए सेल समाधान की आवश्यक मात्रा को सेंट्रीफ्यूज करें। बर्फ पर प्रति 3000 जीवित कोशिकाओं में 17 माइक्रोलीटर ठंडे डीएमईएमसी के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। मात्रा को कुओं की आवश्यक संख्या में समायोजित करें।धीरे-धीरे प्रति 3000 जीवित कोशिकाओं में 33 माइक्रोलीटर ठंडा ईसीएम जोड़ें। मात्रा को कुओं की आवश्यक संख्या में समायोजित करें और बुलबुले बनाए बिना समरूप करें। फिर पूर्व-गर्म 24-वेल प्लेट में प्रति कुएं ईसीएम सेल सस्पेंशन के 50 माइक्रोलीटर वाले कुओं को देखें और ईसीएम के पोलीमराइजेशन के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।प्रति अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर हर दो से तीन दिनों में संस्कृति माध्यम को इनक्यूबेट करें और बदलें। कल्चर इंसर्ट को कोट करने के लिए, ठंडे पीबीएस में 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर पतला कोलेजन IV युक्त कोटिंग समाधान तैयार करें।प्रत्येक सेल कल्चर में पतला कोटिंग समाधान के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें और रात भर या तीन घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। विभाजन के पांच दिन बाद, ऑर्गेनोइड्स को पी -1000 पिपेट के साथ स्क्रैप करके ईसीएम के साथ अलग करें। संस्कृति माध्यम में पाइपिंग द्वारा सावधानीपूर्वक समरूप किया जाता है और बर्फ पर पांच मिलीलीटर ठंडे डीएमईएमसी युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।एकत्र किए गए ऑर्गेनोइड्स को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और सेल पेलेट को 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ पूरक पूर्व-गर्म एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक के एक मिलीलीटर में पुन: निलंबित करें। ऑर्गेनोइड्स के पृथक्करण को शुरू करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे करें।एंजाइमेटिक पाचन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यांत्रिक रूप से 10 बार पाइपिंग करके ऑर्गेनोइड्स को बाधित करें और चार मिलीलीटर बर्फ ठंडा डीएमईएमसी जोड़ें। डीएमईएमसी के एक मिलीलीटर में ऑर्गेनॉइड सेल पेलेट को पुन: निलंबित करने से पहले सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज और छोड़ दें।एक सेल काउंटर के साथ ट्रिपैन ब्लू में कोशिकाओं की गणना करें और प्रति कल्चर सम्मिलित पांचवीं कोशिकाओं को 2.5 गुना 10 गुना बीज करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। सेंट्रीफ्यूज सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा प्रति संस्कृति सम्मिलित पांचवीं कोशिकाओं के 2.5 गुना 10 के अनुरूप होती है। सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, कल्चर इंसर्ट से कोटिंग घोल को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और इसे पांच मिनट के लिए ढक्कन के बिना हुड के नीचे सूखने दें।सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ पूरक 2 डी माध्यम की आवश्यक मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। लेपित पारगम्य झिल्ली पर सेल निलंबन के बीज 200 माइक्रोलीटर। निचले डिब्बे में 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ पूरक 2 डी माध्यम के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और इनक्यूबेट करें।झिल्ली पर कोशिकाओं का एक उच्च घनत्व देखा जाना चाहिए। सीडिंग के एक दिन बाद, रॉक अवरोधक के बिना ताजा 2 डी मीडिया के साथ एपिकल और बेसल मीडिया को बदलें। हर दिन मीडिया बदलें।मोनोलेयर बीज बोने के एक दिन बाद कंफ्लुएंट हो जाता है और इसका उपयोग इसके प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। इस अध्ययन में, उपकला क्रिप्ट्स को सुअर की आंत से प्राप्त किया गया था और तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोप्रिजर्व किया गया था। पिघलने के बाद, क्रिप्ट स्टेम कोशिकाओं को ईसीएम में बीज दिया गया था।ऑर्गेनोइड्स को तीन से चार दिनों के भीतर देखा गया और तेजी से बढ़ते और उभरते संरचनाओं को विकसित किया गया। पिघलने के लगभग 10 दिन बाद, संस्कृति का विस्तार करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का मार्ग किया गया था। संस्कृति के इष्टतम रखरखाव के लिए, पैकेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑर्गेनोइड्स को एक स्पष्ट और खाली लुमेन और अच्छी तरह से परिभाषित किनारों को पेश करना चाहिए, जिसमें लुमेन में कोई काला मलबा नहीं होता है जैसा कि परिपक्व ऑर्गेनोइड्स में देखा गया है।कोशिकाएं एक दिन के भीतर एक पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर को जोड़ती हैं और बनाती हैं, जिसकी पुष्टि लगभग 700 गुंबद वर्ग सेंटीमीटर के उच्च ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध, या टीईईआर द्वारा की जाती है। टीईईआर तीन दिनों तक उच्च रहता है। एक्टिन धुंधला होना इंगित करता है कि उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष 3 डी ऑर्गेनोइड्स में लुमेन की ओर उन्मुख है।कल्चर में बीजित ऑर्गेनॉइड कोशिकाएं उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत बनाती हैं जिसमें एपिकल पक्ष ऊपरी डिब्बे की ओर उन्मुख होता है। ऑक्लुडिन धुंधला होने से 3 डी ऑर्गेनोइड्स और सेल मोनोलेयर में उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष पर तंग जंक्शनों की उपस्थिति का पता चलता है। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि सेल मोनोलेयर को बीज करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑर्गेनोइड को मृत कोशिकाओं के संचय के अनुरूप काले मलबे के बिना एक खाली लुमेन के साथ स्पष्ट दिखाई देना चाहिए।सुअर आंतों के ऑर्गेनॉइड से मोनोलेयर का उपयोग कार्यात्मक परख, इमेजिंग और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उपयोग करके उपकला बाधा समारोह पर मेटाबोलाइट्स या रोगाणुओं के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Xenopus भ्रूण कोशिकाओं से म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड: पीढ़ी, संस्कृति और उच्च संकल्प लाइव इमेजिंग

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

आंतों विली एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की 3डी कल्टिंग डिफरेंटेशन से गुजर रही है

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

आंतों के क्रिप्ट्स से मुरीन प्राइमरी कोलन एपिथेलियल मोनोलेयर्स की पीढ़ी

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Murine हेपेटोसाइट Organoids की स्थापना और आनुवंशिक हेरफेर

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और 3 डी इमेजिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

माउस गर्भाशय से 3 डी एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की स्थापना

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

मुराइन इंटेस्टाइनल क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड्स की 3 डी खेती और ऑर्गेनॉइड रिसर्च के लिए एक एकल स्टेम सेल

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

स्थापित मुराइन कोलोनोइड्स पर विट्रो में आंतों की सूजन के उपकला प्रभावों का अध्ययन

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...