Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Institut Carnot France Futur Elevage (progetto "OrganoPig") e da INRAE HOLOFLUX (progetto "Holopig"). Gli autori sono grati alle strutture di base di Genotoul (TRI). Ringraziamo Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Tolosa) per l'attenta correzione di bozze.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo utilizzato per crioconservare le cripte epiteliali dall'intestino dei suinetti per la conservazione a lungo termine e la successiva coltura di organoidi 3D. Questo protocollo utilizza una soluzione di congelamento contenente DMSO, FBS, l'inibitore Y27632 ROCK, DMEM e antibiotici. Un altro studio sui suini ha ottenuto organoidi da cripte crioconservate in una soluzione di congelamento simile ma senza l'inibitore ROCK15. L'inibitore Y27632 ROCK è stato incluso per prevenire l'apoptosi e mantenere il pool di cellule staminali poiché, dopo lo scongelamento, le cellule della cripta epiteliale vengono dissociate, il che può portare alla morte cellulare ("anoikis")27,28. È interessante notare che gli enteroidi equini sono stati ottenuti da cripte epiteliali congelate in un terreno di coltura contenente solo DMEM e DMSO16; Questo semplice metodo non è stato ancora testato per le cripte epiteliali dei maiali. Altri metodi sono stati pubblicati per coltivare organoidi umani e suini da tessuti congelati o biopsie invece di cripte epiteliali 4,17. Il vantaggio di questo metodo è la capacità di crioconservare direttamente i tessuti intestinali senza eseguire la procedura di isolamento della cripta, che richiede tempo e attrezzature di laboratorio. Questo potrebbe essere conveniente quando i tessuti devono essere raccolti lontano dal laboratorio. Tuttavia, quando si isolano le cripte immediatamente dopo la macellazione, è possibile elaborare ampi segmenti dell'intestino per ottenere un numero molto elevato di cripte, il che non è il caso quando si parte da piccoli frammenti di tessuto congelato. Dopo lo scongelamento delle cripte epiteliali, gli organoidi sono stati osservati da 3-4 giorni dopo la semina e divisi dopo 10 giorni. Questo è un tasso di crescita più lento rispetto a quando si inizia la coltura da cripte epiteliali fresche, per le quali gli organoidi sono stati ottenuti dal giorno 1 post-semina, e di solito possono essere divisi intorno al giorno 511. Khalil et al. hanno anche riportato una crescita ritardata degli enteroidi di maiale quando si parte dalle cripte congelate15, suggerendo che le cellule staminali potrebbero richiedere tempo per recuperare la loro capacità proliferativa. Abbiamo anche ottenuto un numero inferiore di organoidi quando si parte da cripte congelate rispetto alle cripte fresche, che potrebbe essere dovuto alla morte delle cellule staminali durante il processo di congelamento. In alcuni tentativi di scongelamento delle cripte (<20%), non abbiamo ottenuto organoidi da cripte congelate, probabilmente a causa di una procedura di crioconservazione non ottimale (ad esempio, congelamento ritardato dopo l'isolamento della cripta probabilmente superiore a 1 ora). Pertanto, si consiglia di tenere le cripte sul ghiaccio fino al conteggio e congelarle il più rapidamente possibile.
Per gli organoidi 3D, abbiamo scelto di utilizzare un terreno di coltura organoide commerciale formulato per gli esseri umani. In effetti, rapporti precedenti hanno dimostrato che gli organoidi intestinali di maiale crescono in modo efficiente con questo mezzo 8,11,14,19,25,26,29,30. È interessante che questo terreno di coltura sia pronto all'uso e abbia una concentrazione standardizzata di fattori di crescita all'interno di un lotto. Tuttavia, questo terreno di coltura è costoso, la sua composizione non è divulgata e quindi non è possibile modularne la composizione. Al contrario, altri studi hanno coltivato organoidi intestinali di maiale in terreni personalizzati contenenti inibitori farmacologici, fattore di crescita ricombinante e / o terreni condizionati 5,6,7,21. Sebbene altamente flessibile ed economico, questo metodo richiede molto tempo per la produzione di mezzi condizionati e potrebbe mancare di riproducibilità a causa della potenziale variabilità nella concentrazione dei fattori di crescita nei mezzi condizionati. Pertanto, la qualità di ciascun lotto di mezzi condizionati dovrebbe essere convalidata misurando la crescita organoide o l'espressione genica del marcatore31.
Uno studio ha dimostrato che gli organoidi digiunali di maiale coltivati nello stesso terreno di coltura di organoidi commerciali qui utilizzato crescevano più velocemente e sembravano meno differenziati, rispetto agli enteroidi coltivati con terreni contenenti fattore di crescita ricombinante e/o terreni condizionati23. Un elevato stato proliferativo facilita la coltura di organoidi 3D, ma potrebbe richiedere di indurre la differenziazione per essere più rappresentativa delle caratteristiche fisiologiche intestinali. In questo protocollo, per il passaggio di organoidi 3D, le cellule sono completamente dissociate per il conteggio, permettendo di controllare il numero di cellule seminate in ECM. Ciò aumenta la riproducibilità del fenotipo degli organoidi, che è fortemente influenzato dalla loro densità. Inoltre, il conteggio delle cellule evita di ottenere una coltura troppo bassa o sovraffollata, che richiede l'adattamento del programma di coltura. La maggior parte degli altri studi ha preparato frammenti organoidi non completamente dissociati in singole cellule e ha utilizzato un rapporto di diluizione per il passaggio. Questo metodo è più semplice, ma potrebbe indurre variabilità in base alla densità organoide della coltura.
Per la coltura in monostrati, le cellule organoidi vengono seminate in inserti di coltura prepatinati con un sottile strato di ECM, che consente l'attaccamento delle cellule ma evita la crescita di organoidi in 3D. Questo protocollo utilizzava collagene di tipo IV come proteina ECM, come descritto in precedenza nei suini23. Altri studi con monostrati organoidi di maiale hanno utilizzato la stessa ECM derivata dal tumore utilizzata qui per la coltura di organoidi 3D 6,8,9,21,25,30. Il vantaggio dell'utilizzo del collagene è la capacità di standardizzare la concentrazione proteica con una composizione completamente definita, che non è il caso della ECM derivata dal tumore. Un passo fondamentale per il successo della coltura di monostrati cellulari è prestare attenzione all'aspetto visivo degli organoidi 3D precursori, che dovrebbero avere bordi ben definiti e un lume vuoto senza detriti neri. In effetti, gli organoidi con un alto livello di maturazione e un basso tasso proliferativo non sono una fonte appropriata di cellule per la coltura 2D. Pertanto, la tempistica della dissociazione degli organoidi 3D in singole cellule è cruciale per il successo di questa fase.
La coltura di monostrati 2D da singole cellule consente di standardizzare il numero di cellule seminate, il che è più difficile quando si parte da frammenti organoidi, come eseguito in altri metodi. Abbiamo seminato 7,6 x 10 5 cellule per cm 2, che è alto rispetto alla maggior parte degli altri studi 21,22,23 nei suini che utilizzavano una densità cellulare inferiore, che andava da0,25 x 10 5 cellule per cm 2 a 1,78 x 10 5 cellule per cm2. Il requisito di un elevato numero di cellule organoidi costituisce una limitazione di questo protocollo, ma ci ha permesso di ottenere rapidamente un monostrato confluente, coprendo completamente l'inserto di coltura dopo 1 giorno. Al contrario, Vermeire et al.23 hanno ottenuto la confluenza dopo 4-7 giorni con una minore densità di cellule seminate (da 0,25 x 10 5 cellule / cm 2 a 0,4 x 105 cellule / cm2). Alcuni studi hanno anche utilizzato monostrati di cellule organoidi di maiale che non coprivano completamente la superficie di coltura per le infezioni da virus 8,30. In queste condizioni, il lato apicale delle cellule epiteliali è accessibile per i trattamenti, ma sono necessari monostrati completamente confluenti se l'obiettivo è studiare l'assorbimento dei nutrienti o la permeabilità epiteliale.
Per i monostrati di cellule organoidi, è stato utilizzato un terreno di coltura organoide commerciale integrato con il 20% di FBS, sulla base di un recente studio su monostrati derivati da enteroidi bovini32. Nei nostri test, l'integrazione con il 20% di FBS era necessaria per ottenere monostrati completamente confluenti, probabilmente a causa di un elevato fabbisogno di fattore di crescita. Al contrario, altri studi che utilizzano lo stesso mezzo commerciale hanno stabilito monostrati senza FBS aggiuntivo 8,25,30, ma senza raggiungere la piena confluenza. Altri studi hanno anche utilizzato l'integrazione con FBS al 20% in un mezzo personalizzato per la coltura di monostrati di cellule organoidi di maiale21,22. Nei nostri esperimenti, il TEER è alto 1 giorno dopo la semina (circa 700 Ω·cm 2), e rimane alto fino al giorno 3 (circa 1.500 Ω·cm2; questo è coerente con la formazione di giunzioni strette, come indicato dall'espressione di occludina. Van der Hee et al. hanno ottenuto valori TEER simili su 72 h per i monostrati di cellule organoidi di digiuno21. Hanno anche dimostrato che i monostrati possono essere mantenuti fino al giorno 12-15 con cambi giornalieri dei media. Al contrario, altri studi hanno riportato valori di TEER molto più bassi (circa 200 Ω·cm2) per i monostrati di cellule organoidi di suino 6,22. Queste differenze tra gli studi potrebbero essere correlate al segmento intestinale studiato o ai mezzi utilizzati che influenzano la differenziazione epiteliale.
In conclusione, il protocollo di cui sopra per far crescere organoidi 3D intestinali di maiale da cripte epiteliali congelate facilita l'organizzazione del lavoro di coltura. Riduce la necessità di ottenere tessuti freschi da animali vivi. Spieghiamo anche come stabilire monostrati cellulari completamente confluenti derivati da organoidi di maiale in meno di 3 giorni. Pertanto, i nostri protocolli potrebbero essere risorse utili per gli scienziati che studiano l'epitelio intestinale suino per la ricerca veterinaria o biomedica.

L'epitelio intestinale è formato da un monostrato di cellule che ricopre la mucosa digestiva all'interfaccia con l'ambiente luminale. Questa posizione è associata a diverse funzioni, come l'assorbimento dei nutrienti e la funzione barriera, che sono supportate dalla presenza di cellule staminali e da più tipi di cellule epiteliali differenziate (cellule assorbenti, enteroendocrine, Paneth e calici)1. Le linee cellulari immortalizzate tradizionalmente utilizzate per studiare le cellule epiteliali hanno importanti limitazioni, poiché non riflettono la complessità cellulare dell'epitelio intestinale e presentano anomalie genomiche2. Lo sviluppo di organoidi tridimensionali (3D) da parte di Sato et al.3 ha fornito un nuovo modello per studiare l'epitelio intestinale con una migliore rilevanza fisiologica. Infatti, gli organoidi intestinali derivano da cellule staminali non trasformate, sono composti da più tipi di cellule e ricapitolano la funzionalità dell'epitelio intestinale. Gli organoidi intestinali vengono sempre più utilizzati per comprendere lo sviluppo e le funzioni dell'epitelio intestinale e le sue interazioni con agenti patogeni, sostanze nutritive, tossine, farmaci, microbiota e suoi metaboliti2.
Inizialmente sviluppati per l'uomo e i topi, i metodi utilizzati per la coltura di organoidi intestinali sono stati recentemente adattati ad altre specie, compresi i suini4. Gonzales et al.5 furono i primi a coltivare organoidi di maiale dal digiuno; Da allora, organoidi suini sono stati descritti per altri segmenti intestinali (duodeno, ileo e colon)6,7,8 e hanno dimostrato di mantenere un fenotipo specifico della posizione 9,10,11. Gli organoidi 3D intestinali di maiale sono ora comunemente usati per studiare l'effetto dei nutrienti 12,13 o delle infezioni enteriche 6,8,14.
La maggior parte degli studi ha descritto la coltura di organoidi intestinali a partire da cripte epiteliali appena isolate. Tuttavia, ciò non è sempre fattibile per motivi logistici, in particolare quando si lavora con animali di grossa taglia come i maiali. In effetti, le strutture per animali per suini possono essere situate lontano dal laboratorio in cui vengono coltivati gli organoidi, il che complica l'organizzazione del lavoro. Inoltre, la coltura organoide richiede molto tempo; Pertanto, non è pratico coltivare contemporaneamente più linee organoidi, ad esempio da diversi segmenti intestinali o da diversi animali. Per aggirare questi problemi, alcuni studi su esseri umani, cavalli e maiali hanno descritto metodi per coltivare organoidi da tessuti intestinali congelati (o biopsie) o da cripte epiteliali isolate 4,15,16,17. Questi metodi consentono la crioconservazione delle cellule staminali epiteliali intestinali da più segmenti intestinali di un singolo animale, che possono quindi essere utilizzati per coltivare organoidi quando necessario. Inoltre, ciò consente una forte riduzione del numero di animali vivi utilizzati come donatori di cellule staminali, poiché è possibile creare grandi stock di cripte crioconservate (principi di 3R). Un altro vantaggio di questo metodo è la crescita di organoidi intestinali solo da animali di interesse dopo aver ottenuto risultati fenotipici o genotipici, che è altamente conveniente.
In vivo, le cellule epiteliali intestinali sono polarizzate, con il lato apicale diretto verso il lume. In vitro, negli organoidi 3D, anche il lato apicale delle cellule epiteliali è rivolto verso il lume (cioè all'interno degli organoidi)4. Questa organizzazione impedisce l'accesso al lato apicale, che è un problema quando si studiano gli effetti dei componenti luminali (ad esempio, nutrienti, microbi, metaboliti) sulle cellule epiteliali. Per aggirare questo svantaggio, sono stati sviluppati diversi metodi, come la coltura di cellule organoidi come monostrati 2D, la microiniezione e l'inversione di polarità ("organoidi apical-out")18,19. La coltura di monostrati di cellule organoidi sta emergendo come il sistema più efficiente e trattabile. Il principio è quello di dissociare organoidi 3D in singole cellule e seminarle su un vaso di coltura cellulare precedentemente rivestito con un sottile strato di matrice extracellulare (ECM)20. In queste condizioni di coltura, il lato apicale delle cellule epiteliali è rivolto verso l'alto ed è quindi accessibile ai trattamenti sperimentali20. La coltura di monostrati di cellule organoidi è stata recentemente adattata per l'intestino suino21,22; monostrati cellulari derivati da organoidi 3D di maiale sono stati utilizzati per molteplici applicazioni, tra cui lo studio delle infezioni enteriche 6,23,24,25, il trasporto di nutrienti9 e la modellazione delle malattie digestive 26.
Qui, questo studio presenta per la prima volta un protocollo dettagliato per la coltura e il mantenimento di organoidi 3D intestinali di maiale derivati da cripte epiteliali crioconservate (Figura 1). Quindi, viene descritto un protocollo per stabilire monostrati cellulari da organoidi 3D intestinali di maiale. I metodi qui descritti forniscono strumenti sperimentali che possono essere utilizzati per studiare l'epitelio intestinale del maiale per il trasporto dei nutrienti, la funzione barriera e le interazioni ospite-microrganismo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Gli organoidi intestinali vengono sempre più utilizzati per studiare l'epitelio intestinale per la modellazione delle malattie digestive o per studiare le interazioni con farmaci, nutrienti, metaboliti, agenti patogeni e microbiota. I metodi per la coltura di organoidi intestinali sono ora disponibili per più specie, compresi i suini, che è una specie di grande interesse sia come animale da allevamento che come modello traslazionale per l'uomo, ad esempio, per studiare le malattie zoonotiche. Qui, diamo una descrizione approfondita di una procedura utilizzata per la coltura di organoidi 3D intestinali di maiale da cripte epiteliali congelate. Il protocollo descrive come crioconservare le cripte epiteliali dall'intestino del maiale e le successive procedure per la coltura di organoidi intestinali 3D. I principali vantaggi di questo metodo sono (i) la dissociazione temporale dell'isolamento delle cripte dalla coltura di organoidi 3D, (ii) la preparazione di grandi stock di cripte crioconservate derivate da più segmenti intestinali e da più animali contemporaneamente, e quindi (iii) la riduzione della necessità di campionare tessuti freschi da animali vivi. Dettagliamo anche un protocollo per stabilire monostrati cellulari derivati da organoidi 3D per consentire l'accesso al lato apicale delle cellule epiteliali, che è il sito di interazioni con nutrienti, microbi o farmaci. Nel complesso, i protocolli qui descritti sono una risorsa utile per lo studio dell'epitelio intestinale suino nella ricerca veterinaria e biomedica.

Seguendo il protocollo sopra descritto, le cripte epiteliali sono ottenute dall'intestino del maiale e crioconservate per la conservazione a lungo termine in azoto liquido (Figura 1 e Figura 2A). Dopo lo scongelamento, le cellule staminali della cripta vengono seminate nella ECM (Figura 2B). La struttura della cripta viene solitamente persa dopo questo passaggio, a causa della disintegrazione della struttura della cripta nell'ECM. Gli organoidi possono essere osservati entro 3-4 giorni, e quindi crescere rapidamente e sviluppare strutture in erba (Figura 2B). Abbiamo ottenuto con successo organoidi dopo aver scongelato le cripte congelate in >80% dei tentativi. Circa 10 giorni dopo lo scongelamento (in base al tasso di crescita degli organoidi), viene eseguito un passaggio di organoidi per espandere la coltura (Figura 3). Gli organoidi crescono più velocemente dopo la scissione e presentano morfologie diverse, con alcuni organoidi cistici e una maggioranza di organoidi in erba. Per un mantenimento ottimale della coltura, gli organoidi utilizzati per il passaggio devono presentare un lume chiaro e vuoto e bordi ben definiti (esempi indicati da frecce verdi) senza detriti neri nel lume (indicati da frecce rosse), come osservato negli organoidi maturi (Figura 3). Abbiamo scoperto che i detriti delle cellule nere iniziano ad accumularsi intorno al giorno 6 dopo il passaggio. Pertanto, si consiglia di dividere o congelare gli organoidi al giorno 4-5 dopo il passaggio.
La fase di maturità degli organoidi è anche un punto importante per ottenere monostrati cellulari. Gli organoidi con maturità avanzata (indicati dalla presenza di detriti a cellule nere nel lume) non sono ottimali per seminare monostrati. Di solito dissociamo gli organoidi 3D 4 giorni dopo il passaggio per raccogliere cellule per la coltura 2D. Circa da uno a tre pozzetti di organoidi 3D coltivati a 3.000 cellule per cupola da 50 μL della ECM sono necessari per seminare un inserto di coltura con 2,5 x 105 cellule. Le cellule si attaccano e formano un monostrato completamente confluente entro 1 giorno (Figura 4A), che è confermato dall'elevato TEER di circa 700 Ω·cm2 (Figura 4B). Tuttavia, i bordi delle cellule sono difficili da visualizzare al microscopio a campo chiaro in questo primo momento, probabilmente a causa di un basso livello di differenziazione. Il TEER rimane elevato per 3 giorni (Figura 4B).
La colorazione dell'actina indica che il lato apicale delle cellule epiteliali è orientato verso il lume negli organoidi 3D (Figura 5A). Le cellule organoidi seminate in coltura formano un singolo strato confluente di cellule epiteliali, con il lato apicale orientato verso il compartimento superiore (Figura 4B,C). La colorazione dell'occludina rivela la presenza di giunzioni strette sul lato apicale delle cellule epiteliali negli organoidi 3D e nei monostrati cellulari (Figura 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica dei metodi utilizzati per la coltura di organoidi 3D e monostrati cellulari derivati da organoidi. Le cripte epiteliali sono isolate dall'intestino dei maialini. Queste cripte possono i) essere utilizzate immediatamente per coltivare organoidi 3D o ii) essere congelate e conservate in una biobanca in azoto liquido. Le cripte crioconservate possono essere scongelate e utilizzate per coltivare organoidi 3D. La coltura di organoidi 3D può essere mantenuta con successiva scissione o congelata e conservata nella biobanca. I monostrati cellulari possono essere ottenuti dalla coltura di organoidi 3D per consentire l'accesso al lato apicale delle cellule e studiare la funzione di barriera epiteliale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figura 2: Coltura di organoidi 3D intestinali di maiale provenienti da cripte epiteliali crioconservate. (A) Immagine microscopica rappresentativa di cripte digiunali appena isolate. (B) Immagini microscopiche rappresentative di organoidi 3D ottenute dopo lo scongelamento delle cripte digiunali. Gli organoidi sono stati coltivati in una cupola da 25 μL di ECM in una piastra da 48 pozzetti. La figura mostra le immagini degli organoidi 3D a 4, 7, 8, 9 e 10 giorni dopo la semina. La barra della scala rappresenta 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figura 3: Morfologia degli organoidi 3D intestinali dei suini derivati da cripte epiteliali crioconservate dopo il primo passaggio. Immagini microscopiche rappresentative che mostrano lo sviluppo di organoidi derivati da cripte di digiuno crioconservate dopo il primo passaggio dal giorno 4 al giorno 7. Le frecce verdi indicano organoidi chiari appropriati per il passaggio o la semina di monostrati. Le frecce rosse indicano organoidi maturi non adatti alla scissione o alla semina di monostrati; Pertanto, i pozzi dovrebbero essere usati prima dell'apparizione di questa morfologia. La barra della scala rappresenta 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figura 4: Caratteristiche dei monostrati cellulari derivati da organoidi 3D intestinali di maiale . (A) Immagini microscopiche rappresentative della morfologia monostrato nell'arco di 3 giorni. Le cellule organoidi di digiuno sono state seminate a 2,5 x 105 cellule in inserti di coltura cellulare di 0,33 cm2 rivestiti di collagene IV a 50 ng / ml. La barra della scala rappresenta 500 μm. (B) Resistenza elettrica transepiteliale (TEER) dei monostrati di cellule organoidi per 3 giorni. I punti collegati da una linea corrispondono allo stesso pozzo in momenti diversi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figura 5: Imaging di organoidi di digiuno suino coltivati in 3D o 2D. Microscopia confocale di (A) organoidi 3D 5 giorni dopo la scissione e (B,C) monostrati di cellule organoidi 3 giorni dopo la semina (sezione B: XZ; C: Sezione XY). Il DNA (blu) è stato colorato con DAPI. L'actina (rossa) era macchiata con falloidina. L'occludina (verde) è stata colorata con un anticorpo policlonale. Le frecce bianche indicano l'occludina localizzata alla giunzione stretta. La barra della scala rappresenta 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Qui, descriviamo un protocollo per la coltura di organoidi intestinali 3D di maiale da cripte epiteliali crioconservate. Descriviamo anche un metodo per stabilire monostrati cellulari derivati da organoidi 3D, consentendo l'accesso al lato apicale delle cellule epiteliali.

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Il nostro protocollo fornisce strumenti per studiare l'epitelio intestinale suino per la ricerca veterinaria e biomedica. Gli organoidi intestinali dei maiali possono essere utilizzati per studiare il trasporto dei nutrienti, la funzione barriera e le interazioni ospite-microbo. Attraverso la conservazione delle cripte epiteliali intestinali dei suini consentono di creare un grande stock di cellule staminali che possono essere successivamente utilizzate per la coltura organoide in monostrati 3D o 2D.Questo protocollo è dettagliato per il digiuno, ma può essere utilizzato anche per altri segmenti intestinali come duodeno, ileo e colon. Per iniziare, scongelare rapidamente una fiala contenente 900 cripte congelate a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Trasferire la soluzione di cripta in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare a 300 x g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 150 microlitri di matrice extracellulare o ECM con una punta raffreddata per ottenere una concentrazione finale di 150 cripte per 25 microlitri di ECM. Pipet su e giù 10 volte per ottenere una sospensione omogenea delle cripte nella ECM.Seminare sei pozzetti con una goccia da 25 microlitri per pozzetto in una piastra preriscaldata da 48 pozzetti. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per la polimerizzazione della ECM. Aggiungere un 250 microlitro per pozzetto di coltura di mezzo a temperatura ambiente e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Cambiare il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Per far passare organoidi 3D derivati da cripte congelate 10 giorni dopo la semina, rimuovere i terreni di coltura e aggiungere 250 microlitri di PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sostituire il PBS con 250 microlitri di reagente di dissociazione enzimatica preriscaldato integrato con 10 inibitori della roccia micromolare a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto.Staccare gli organoidi nell'ECM raschiando con una pipetta P-1000 e omogeneizzarli accuratamente mediante pipettaggio cinque volte. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima di dissociare le cellule pipettando su e giù 10 volte. Aggiungere 500 microlitri di DMEMc in ciascun pozzetto contenente cellule dissociate e tirare fino a 12 pozzetti in un tubo conico da 15 millilitri contenente tre millilitri di DMEMc freddo.Centrifugare a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di DMEMc freddo. Contare le celle con una diluizione da una a due in blu tripano con un contatore di celle.Centrifugare il volume necessario della soluzione cellulare per avere 3000 celle vive per cupola. Risospendere il pellet con 17 microlitri di DMEMc freddo per 3000 cellule vive su ghiaccio. Regolare il volume in base al numero richiesto di pozzetti.Aggiungere lentamente 33 microlitri di ECM freddo per 3000 cellule vive. Regolare il volume al numero richiesto di pozzetti e omogeneizzare senza creare bolle. Quindi vedere i pozzetti con 50 microlitri di sospensione della cella ECM per pozzetto in una piastra preriscaldata a 24 pozzetti e incubare per 30 minuti per la polimerizzazione dell'ECM.Aggiungere 500 microlitri del terreno di coltura per pozzetto. Quindi incubare e cambiare il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Per rivestire l'inserto di coltura, preparare la soluzione di rivestimento contenente collagene IV diluito a 50 microgrammi per millilitro in PBS freddo.Aggiungere 150 microlitri della soluzione di rivestimento diluito a ciascun inserto di coltura cellulare e incubare durante la notte o per tre ore. Cinque giorni dopo la scissione, staccare gli organoidi con l'ECM raschiandoli con una pipetta P-1000. Omogeneizzare accuratamente mediante pipettaggio nel terreno di coltura e trasferire in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di DMEMc freddo su ghiaccio.Centrifugare gli organoidi raccolti a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di reagente di dissociazione enzimatica preriscaldato integrato con 10 inibitori micromolari ROCK. Pipet su e giù 10 volte per iniziare la dissociazione degli organoidi.Incubare per cinque minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius per la digestione enzimatica. Interrompere meccanicamente gli organoidi pipettando 10 volte e aggiungere quattro millilitri di DMEMc ghiacciato. Centrifugare ed eliminare il surnatante prima di risospendere il pellet di cellule organoidi in un millilitro di DMEMc.Contare le cellule in tripano blu con un contatore di cellule e calcolare il volume necessario per seminare 2,5 volte 10 alla quinta cellula per inserto di coltura. Centrifugare il volume necessario della sospensione cellulare corrispondente a 2,5 volte 10 delle quinte cellule per inserto di coltura. Durante la centrifugazione, aspirare con cura la soluzione di rivestimento dagli inserti di coltura e lasciarla asciugare sotto il cofano senza il coperchio per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet nel volume necessario di mezzo 2D integrato con inibitore ROCK 10 micromolare. Seminare 200 microlitri della sospensione cellulare sulla membrana permeabile rivestita. Aggiungere 500 microlitri di mezzo 2D integrato con 10 inibitori micromolari ROCK al compartimento inferiore e incubare.Un'alta densità di cellule dovrebbe essere osservata sulla membrana. Un giorno dopo la semina, sostituire i mezzi epici e basali con nuovi supporti 2D senza l'inibitore ROCK. Cambia i media ogni giorno.Il monostrato diventa confluente un giorno dopo la semina e può essere utilizzato per i suoi esperimenti. In questo studio, le cripte epiteliali sono state ottenute dall'intestino del maiale e crioconservate per la conservazione a lungo termine in azoto liquido. Dopo lo scongelamento, le cellule staminali della cripta sono state seminate nell'ECM.Gli organoidi sono stati osservati entro tre o quattro giorni e sono cresciuti rapidamente e hanno sviluppato strutture in erba. Circa 10 giorni dopo lo scongelamento, è stato eseguito il passaggio degli organoidi per espandere la coltura. Per un mantenimento ottimale della coltura, gli organoidi utilizzati per il confezionamento devono presentare un lume chiaro e vuoto e bordi ben definiti senza detriti neri nel lume come osservato negli organoidi maturi.Le cellule si attaccano e formano un monostrato completamente confluente entro un giorno, il che è confermato dall'elevata resistenza elettrica transepiteliale, o TEER, di circa 700 cupole centimetri quadrati. Il TEER rimane alto per tre giorni. La colorazione dell'actina indica che il lato apicale delle cellule epiteliali è orientato verso il lume negli organoidi 3D.Le cellule organoidi seminate negli inserti di coltura formano un singolo strato confluente di cellule epiteliali con il lato apicale orientato verso il compartimento superiore. La colorazione dell'occludina rivela la presenza di giunzioni strette sul lato apicale delle cellule epiteliali negli organoidi 3D e nei monostrati cellulari. È importante ricordare che l'organoide utilizzato per seminare monostrati cellulari dovrebbe apparire chiaro con un lume vuoto senza detriti neri corrispondenti a un accumulo di cellule morte.I monostrati dell'organoide intestinale del maiale possono essere utilizzati per testare gli effetti di metaboliti o microbi sulla funzione di barriera epiteliale utilizzando saggi funzionali, imaging e analisi dell'espressione genica.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

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Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

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