Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
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この研究は、Institut Carnot France Futur Elevage(「OrganoPig」プロジェクト)とINRAE HOLOFLUX(「Holopig」プロジェクト)の支援を受けました。著者らは、ジェノトール中核施設(TRI)に感謝しています。私たちは、Christelle Knudsen(GenPhySE、INRAE、トゥールーズ)の慎重な校正に感謝します。

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著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルは、3Dオルガノイドの長期保存およびその後の培養のために、子豚の腸からの上皮陰窩を凍結保存するために使用される方法について説明しています。このプロトコルは、DMSO、FBS、Y27632 ROCK阻害剤、DMEM、および抗生物質を含む凍結溶液を使用します。ブタにおける別の研究では、同様の凍結溶液中で凍結保存された陰窩からオルガノイドを得たが、ROCK阻害剤は含まれていない15。Y27632 ROCK阻害剤は、融解後に上皮陰窩細胞が解離し、細胞死(「anoikis」)につながる可能性があるため、アポトーシスを防ぎ、幹細胞プールを維持するために含まれていました27,28。興味深いことに、ウマエンテロイドは、DMEMとDMSO16のみを含む培地で凍結された上皮陰窩から得られました。この簡単な方法は、ブタの上皮陰窩についてまだテストされていません。上皮陰窩の代わりに凍結組織または生検からヒトおよびブタオルガノイドを増殖させる他の方法が発表されている4,17。この方法の利点は、時間と実験装置を必要とする陰窩分離手順を実行せずに腸組織を直接凍結保存できることです。これは、組織をラボから遠く離れた場所に収集する必要がある場合に便利です。しかしながら、屠殺直後に陰窩を単離する場合、腸の大きな部分を処理して非常に多数の陰窩を得ることができるが、これは小さな凍結組織片から始める場合には当てはまらない。上皮陰窩の融解後、播種後3〜4日でオルガノイドが観察され、10日後に分裂した。これは、播種後1日目からオルガノイドが得られた新鮮な上皮陰窩から培養を開始する場合よりも遅い増殖速度であり、通常、5日目から11日目頃に分割できます。Khalilらはまた、凍結した陰窩から開始するとブタのエンテロイドの成長が遅れることを報告し15、幹細胞が増殖能力を回復するのに時間がかかる可能性があることを示唆しています。また、凍結クリプトから開始した場合、新鮮なクリプトと比較してオルガノイドの数が少なくなりましたが、これは凍結プロセス中の幹細胞の死が原因である可能性があります。陰窩融解のいくつかの試み(<20%)では、おそらく最適ではない凍結保存手順(例えば、おそらく1時間以上の陰窩分離後の凍結の遅延)のために、凍結陰窩からオルガノイドを取得しませんでした。したがって、カウントするまで地下室を氷上に保ち、できるだけ早く凍結することをお勧めします。
3Dオルガノイドについては、ヒト用に製剤化された市販のオルガノイド培養培地を使用することを選択しました。実際、以前の報告では、ブタの腸管オルガノイドがこの培地で効率的に増殖することが示されています8、11、14、19、25、26、29、30。この培地がすぐに使用でき、バッチ内の成長因子の濃度が標準化されていることは重要です。しかしながら、この培地は高価であり、その組成は開示されておらず、したがってその組成を調節することはできない。対照的に、他の研究では、薬理学的阻害剤、組換え成長因子、および/または馴化培地を含むカスタマイズされた培地でブタ腸オルガノイドを培養しています5、6、7、21。この方法は柔軟性が高く安価ですが、馴化培地の製造には時間がかかり、馴化培地中の成長因子の濃度にばらつきが生じる可能性があるため、再現性に欠ける可能性があります。したがって、馴化培地の各バッチの品質は、オルガノイド増殖またはマーカー遺伝子発現を測定することによって検証されるべきである31。
ある研究によると、ここで使用されているのと同じ市販のオルガノイド培養培地で培養されたブタ空腸オルガノイドは、組換え成長因子および/または馴化培地を含む培地で培養されたエンテロイドと比較して、より速く成長し、分化が少ないように見えました23。高増殖状態は3Dオルガノイドの培養を容易にするが、腸の生理学的特性をより代表するために分化誘導を必要とするかもしれない。このプロトコルでは、3Dオルガノイドの通過のために、細胞は計数のために完全に解離され、ECMに播種される細胞の数を制御することができます。これにより、オルガノイドの表現型の再現性が高まり、その密度に大きく影響されます。さらに、細胞を数えることは、低すぎるまたは過密な培養を得ることを回避し、それは培養スケジュールを適応させることを必要とする。他のほとんどの研究では、単一細胞に完全に解離していないオルガノイド断片を調製し、継代に希釈比を使用しました。この方法はより単純ですが、培養物のオルガノイド密度に応じて変動を誘発する可能性があります。
単層培養では、ECMの薄層でプレコートされた培養インサートにオルガノイド細胞を播種し、細胞の付着を可能にしますが、3Dでのオルガノイドの増殖を回避します。このプロトコルは、ブタ23で前述したように、ECMタンパク質としてコラーゲンIV型を使用した。ブタオルガノイド単分子膜を用いた他の研究では、ここで使用したのと同じ腫瘍由来ECMを使用して3Dオルガノイドを培養しました6、8、9、21、25、30。コラーゲンを使用する利点は、完全に定義された組成でタンパク質濃度を標準化できることですが、これは腫瘍由来ECMには当てはまりません。細胞単層の培養を成功させるための重要なステップは、明確なエッジと黒い破片のない空の内腔を持つべき前駆体3Dオルガノイドの視覚的外観に注意を払うことです。実際、成熟レベルが高く増殖速度が低いオルガノイドは、2D培養に適した細胞源ではありません。したがって、3Dオルガノイドを単一細胞に解離するタイミングは、このステップの成功にとって非常に重要です。
単一細胞からの2D単分子膜の培養は、播種される細胞の数を標準化することを可能にするが、これは他のいくつかの方法で行われるように、オルガノイド断片から始める場合により困難である。7.6 x 10 5細胞/cm 2を播種したが、これは、0.25 x 105細胞/cm2から1.78 x 105細胞/cm 2の範囲のより低い細胞密度を使用したブタにおいて、他のほとんどの研究21,22,23と比較して高い。多数のオルガノイド細胞を必要とすることがこのプロトコルの制限となりますが、1日後に培養インサートを完全に覆うコンフルエント単層を迅速に得ることができました。対照的に、Vermeireら23は、播種された細胞の密度が低い(0.25 x 10 5細胞/cm 2から0.4 x 105細胞/cm2)4〜7日後にコンフルエント性を得た。いくつかの研究では、ウイルス感染のために培養表面を完全に覆っていないブタオルガノイド細胞単層も使用しています8,30。これらの条件では、上皮細胞の頂端側は治療のためにアクセス可能ですが、目的が栄養素吸収または上皮透過性を研究することであるならば、完全にコンフルエントな単層が必要です。
オルガノイド細胞単層については、ウシエンテロイド由来単分子膜に関する最近の研究に基づいて、20%FBSを添加した市販のオルガノイド培養培地を使用した32。我々の試験では、完全にコンフルエントな単層を得るために20%FBSの補給が必要であったが、これはおそらく高い成長因子要件のためであった。それどころか、同じ市販培地を使用する他の研究では、追加のFBS8、25、30なしで単層が確立されていますが、完全なコンフルエントに達することはありません。他の研究でも、ブタオルガノイド細胞単層の培養用にカスタマイズされた培地に20%FBSを補給して使用しています21,22。我々の実験では、TEERは播種後1日目(約700 Ω・cm 2)高く、3日目まで高いまま(約1,500 Ω・cm2;これは、オクルジンの発現によって示されるように、タイトジャンクションの形成と一致している。Van der Heeらは、空腸オルガノイド細胞単層について72時間にわたって同様のTEER値を得た21。彼らはまた、単層が毎日の培地交換で12〜15日目まで維持できることを実証した。対照的に、他の研究では、ブタオルガノイド細胞単層についてはるかに低いTEER値(約200 Ω・cm2)が報告されています6,22。研究間のこれらの違いは、研究された腸セグメントまたは上皮分化に影響を与えるために使用される培地に関連している可能性があります。
結論として、凍結上皮陰窩からブタ腸3Dオルガノイドを増殖させる上記のプロトコールは、培養作業の組織化を容易にする。それは生きている動物から新鮮な組織を得る必要性を減らします。また、ブタオルガノイド由来の完全コンフルエントな細胞単分子膜を3日以内に樹立する方法についても説明します。したがって、私たちのプロトコルは、獣医学または生物医学研究のためにブタ腸上皮を研究する科学者にとって有用なリソースになる可能性があります。

腸上皮は、管腔環境との界面で消化粘膜を覆う細胞の単層によって形成される。この位置は、幹細胞や複数の分化した上皮細胞タイプ(吸収細胞、腸内分泌細胞、パネス細胞、杯細胞)の存在によって支えられている栄養素吸収やバリア機能などの多様な機能に関連しています1。上皮細胞の研究に伝統的に使用されている不死化細胞株は、腸上皮の細胞の複雑さを反映しておらず、ゲノム異常が存在するため、大きな制限があります2。佐藤らによる 3次元(3D)オルガノイドの開発3は、生理学的関連性が改善された腸上皮を研究するための新しいモデルを提供しました。実際、腸管オルガノイドは非形質転換幹細胞に由来し、複数の細胞型で構成され、腸上皮の機能を要約しています。腸管オルガノイドは、腸上皮の発生と機能、および病原体、栄養素、毒素、薬物、微生物叢、およびその代謝物との相互作用を理解するためにますます使用されています2。
当初はヒトとマウス用に開発されましたが、腸管オルガノイドの培養に使用される方法は、最近、ブタ4を含む他の種に適応しています。Gonzalesら5は、空腸からブタオルガノイドを培養した最初の人でした。それ以来、ブタオルガノイドは他の腸セグメント(十二指腸、回腸、結腸)6,7,8について記載されており、位置特異的な表現型を保持していることが示されています9,10,11。ブタ腸3Dオルガノイドは現在、栄養素12、13または腸内感染症6、8、14の影響を研究するために一般的に使用されている。
ほとんどの研究は、新たに単離された上皮陰窩から始まる腸オルガノイドの培養について説明しています。ただし、これは、特に豚などの大型動物を扱う場合、ロジスティック上の理由から常に実行可能であるとは限りません。実際、豚用の動物施設は、オルガノイドが培養されている実験室から遠く離れた場所にある可能性があるため、作業組織を複雑にします。さらに、オルガノイド培養には時間がかかります。したがって、例えば、異なる腸セグメントまたは複数の動物から、複数のオルガノイド株を同時に成長させることは実用的ではありません。これらの問題を回避するために、ヒト、ウマ、およびブタにおけるいくつかの研究では、凍結腸組織(または生検)または単離された上皮陰窩からオルガノイドを培養する方法が記載されている4,15,16,17。これらの方法により、単一の動物の複数の腸セグメントからの腸上皮幹細胞の凍結保存が可能になり、必要に応じてオルガノイドを増殖させるために使用できます。さらに、これにより、凍結保存された陰窩を大量に作成できるため、幹細胞のドナーとして使用される生きた動物の数を大幅に減らすことができます(3Rの原則)。この方法の他の利点は、表現型または遺伝子型の結果が得られた後に関心のある動物からのみ腸オルガノイドを増殖させることであり、これは非常に費用効果が高い。
生体内では、腸管上皮細胞は分極しており、頂端側は内腔に向けられています。in vitroでは、3Dオルガノイドでは、上皮細胞の頂端側も内腔(すなわち、オルガノイドの内側)に面しています4。この組織は、上皮細胞に対する管腔成分(例えば、栄養素、微生物、代謝物)の影響を研究する際に問題となる頂端側へのアクセスを妨げる。この欠点を回避するために、オルガノイド細胞を2D単層として培養する方法、マイクロインジェクション、極性反転(「頂端アウトオルガノイド」)など、いくつかの方法が開発されています18,19。オルガノイド細胞の単層の培養は、最も効率的で扱いやすいシステムとして浮上しています。原理は、3Dオルガノイドを単一細胞に解離し、細胞外マトリックス(ECM)20の薄層で予めコーティングした細胞培養容器に播種することです。これらの培養条件では、上皮細胞の頂端側が上向きであり、したがって実験的処置20にアクセス可能である。オルガノイド細胞単層の培養は、最近ブタの腸に適応した21,22;ブタ3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜は、腸内感染症の研究6、23、24、25、栄養素の輸送9、消化器疾患モデリング26など、複数の用途に使用されています。
ここでは、この研究では、凍結保存された上皮陰窩に由来するブタ腸3Dオルガノイドの培養と維持のための詳細なプロトコルを最初に提示します(図1)。次に、ブタ腸3Dオルガノイドから細胞単層を確立するためのプロトコルが記載されている。ここで説明する方法は、栄養素輸送、バリア機能、および宿主と微生物の相互作用についてブタ腸上皮を研究するために使用できる実験ツールを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

腸内オルガノイドは、消化器疾患モデリングのための腸上皮の研究、または薬物、栄養素、代謝産物、病原体、および微生物叢との相互作用の調査にますます使用されています。腸管オルガノイドの培養方法は、家畜としても、人獣共通感染症の研究など、ヒトのトランスレーショナルモデルとしても大きな関心を集めているブタを含む複数の種で利用可能になりました。ここでは、凍結上皮陰窩からブタ腸3Dオルガノイドを培養するために使用される手順の詳細な説明を与える。このプロトコルでは、ブタの腸から上皮陰窩を凍結保存する方法と、その後の3D腸管オルガノイドを培養する手順について説明しています。この方法の主な利点は、(i)3Dオルガノイドの培養物からの陰窩の単離の時間的解離、(ii)複数の腸セグメントおよび複数の動物に由来する凍結保存された陰窩の大量ストックの調製、したがって(iii)生きている動物から新鮮な組織をサンプリングする必要性の減少である。また、栄養素、微生物、または薬物との相互作用の部位である上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にするために、3Dオルガノイドに由来する細胞単層を確立するためのプロトコルについても詳しく説明します。全体として、ここで説明するプロトコルは、獣医学および生物医学研究においてブタ腸上皮を研究するための有用なリソースです。

上記のプロトコルに従って、ブタの腸から上皮陰窩が得られ、液体窒素中での長期保存のために凍結保存される(図1および図2A)。融解後、陰窩幹細胞をECMに播種する(図2B)。クリプト構造は通常、ECMのクリプト構造が崩壊するため、このステップの後に失われます。オルガノイドは3〜4日以内に観察され、その後急速に成長し、出芽構造を発達させます(図2B)。凍結した陰窩を解凍した後、>80%の試行でオルガノイドを取得することに成功しました。解凍の約10日後(オルガノイドの増殖速度に応じて)、オルガノイドの継代を行い、培養を拡大します(図3)。オルガノイドは分裂後により速く成長し、多様な形態を示し、いくつかの嚢胞性オルガノイドと大部分の出芽オルガノイドがあります。培養を最適に維持するために、継代に使用されるオルガノイドは、成熟オルガノイドで観察されるように、内腔に黒い破片がない(赤い矢印で示されている)明確で空の内腔と明確に定義されたエッジ(緑色の矢印で示されている例)を提示する必要があります(図3)。我々は、黒血球の破片が継代後6日目頃に蓄積し始めることを発見した。したがって、継代後4〜5日目にオルガノイドを分割または凍結することが推奨されます。
オルガノイドの成熟段階も細胞単層を得る上で重要なポイントです。成熟度が進んだオルガノイド(内腔内の黒い細胞の破片の存在によって示される)は、単層を播種するのに最適ではありません。通常、継代の4日後に3Dオルガノイドを解離し、2D培養用の細胞を回収します。ECMの50 μLドームあたり3,000細胞で培養された約1〜3ウェルの3Dオルガノイドは、2.5 x 105 細胞を1つの培養インサートに播種する必要があります。細胞は1日以内に付着して完全にコンフルエントな単層を形成し(図4A)、これは約700 Ω・cm2 の高いTEERによって確認されます(図4B)。しかし、細胞エッジは、おそらく分化レベルが低いため、この初期の時点で明視野顕微鏡で視覚化することは困難です。TEERは3日間高いままです(図4B)。
アクチン染色は、上皮細胞の頂端側が3Dオルガノイドの内腔に向いていることを示す(図5A)。培養インサートに播種されたオルガノイド細胞は、上皮細胞のコンフルエントな単層を形成し、頂端側は上部コンパートメントに向けられています(図4B、C)。オクルージン染色により、3Dオルガノイドおよび細胞単層の上皮細胞の頂端側にタイトジャンクションが存在することが明らかになりました(図5A-C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> 図1:オルガノイド由来の3Dオルガノイドおよび細胞単分子膜の培養に用いた方法の概略図。 上皮陰窩は子豚の腸から単離されています。これらの陰窩は、i)3Dオルガノイドの培養に直ちに使用するか、ii)凍結して液体窒素中のバイオバンクに保存することができます。凍結保存された陰窩は解凍して、3Dオルガノイドの培養に使用できます。3Dオルガノイド培養は、連続分割で維持することも、凍結してバイオバンクに保存することもできます。細胞単層は、細胞の頂端側へのアクセスを可能にし、上皮バリア機能を研究するために、3Dオルガノイド培養から得ることができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> 図2:凍結保存された上皮陰窩からのブタ腸3Dオルガノイドの培養。 (A)新たに単離された空腸陰窩の代表的な顕微鏡画像。(B)空腸陰窩の融解後に得られた3Dオルガノイドの代表的な顕微鏡画像。オルガノイドは、48ウェルプレート中のECMの25 μLドームで培養しました。図は、播種後4、7、8、9、および10日後の3Dオルガノイドの画像を示しています。スケールバーは500μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> 図3:最初の継代後の凍結保存された上皮陰窩に由来するブタ腸3Dオルガノイドの形態。 4日目から7日目までの最初の継代後の凍結保存された空腸陰窩に由来するオルガノイドの発達を示す代表的な顕微鏡画像。緑色の矢印は、単層の通過または播種に適した透明なオルガノイドを示す。赤い矢印は、単層の分割または播種に適さない成熟オルガノイドを示します。したがって、ウェルはこの形態の出現の前に使用されるべきです。スケールバーは500μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> 図4:ブタ腸管3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜の特徴。 (a)3日間にわたる単層形態の代表的な顕微鏡像。空腸オルガノイド細胞を、コラーゲンIVを50 ng/mLでコーティングした0.33 cm 2細胞培養インサートに2.5 x 105細胞で播種しました。スケールバーは500μmを表す。 (B)3日間にわたるオルガノイド細胞単層の経上皮電気抵抗(TEER)。線で結ばれた点は、異なる時間に同じウェルに対応しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> 図5:3Dまたは2Dで培養したブタ空腸オルガノイドのイメージング。(A)分裂後5日目の3Dオルガノイドおよび(B,C)播種後3日目のオルガノイド細胞単層の共焦点顕微鏡イメージング(B:XZセクション;C:XYセクション)。DNA(青色)をDAPIで染色した。アクチン(赤色)はファロイジンで染色した。オクルジン(緑色)をポリクローナル抗体で染色した。白い矢印は、タイトジャンクションに局在するオクルジンを示す。スケールバーは20μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

ここでは、凍結保存された上皮陰窩からブタ腸管3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルを記載する。また、3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜を確立し、上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にする方法についても説明します。

凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

私たちのプロトコルは、獣医学および生物医学研究のために豚の腸上皮を研究するためのツールを提供します。ブタ由来の腸内オルガノイドは、栄養素輸送、バリア機能、および宿主と微生物の相互作用の研究に使用できます。ブタの腸管上皮陰窩の保存により、後で3Dまたは2D単層でオルガノイドを培養するために使用できる幹細胞の大量のストックを作成することができます。このプロトコルは空腸について詳述されていますが、十二指腸、回腸、結腸などの他の腸のセグメントにも使用できます。はじめに、900個の凍結した陰窩が入っているバイアルを摂氏37度の水浴中で素早く解凍します。クリプト溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。室温で300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。冷却されたチップで150マイクロリットルの細胞外マトリックスまたはECMを追加して、25マイクロリットルのECMあたり150クリプトの最終濃度を取得します。ピペットを上下に10回使用して、ECM内の陰窩の均質な懸濁液を取得します。6つのウェルに、ウェルあたり25マイクロリットルの滴下を、事前に温めた48ウェルプレートに播種します。ECMの重合のために摂氏37度と5%二酸化炭素で30分間インキュベートします。室温で培地の培養液1ウェルあたり250マイクロリットルを加え、摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベートします。2〜3日ごとに培地を交換してください。播種後10日目に凍結陰窩由来の3Dオルガノイドを継代するには、培養液を取り出し、摂氏37度で予熱したPBS250マイクロリットルを加えます。インキュベーション後、PBSを、摂氏37度で10マイクロモルの岩石阻害剤を添加した250マイクロリットルの予め温めた酵素解離試薬と各ウェルに交換します。P-1000ピペットで削ってECM内のオルガノイドを分離し、5回ピペッティングして慎重にホモジナイズします。摂氏37度と5%の二酸化炭素で5分間インキュベートしてから、10回上下にピペッティングして細胞を解離させます。解離した細胞を含む各ウェルに500マイクロリットルのDMEMcを加え、3ミリリットルのコールドDMEMcを含む15ミリリットルの円錐管で最大12ウェルを引き上げます。500 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを1ミリリットルの冷DMEMcに再懸濁する。細胞カウンターでトリパンブルーで1〜2倍に希釈した細胞を数えます。ドームあたり3000個の生細胞を得るために必要な量の細胞溶液を遠心分離します。氷上で3000生細胞あたり17マイクロリットルのコールドDMEMcでペレットを再懸濁します。必要なウェル数に容量を調整します。3000生細胞あたり33マイクロリットルのコールドECMをゆっくりと加えます。必要なウェル数に容量を調整し、気泡を作らずに均質化します。次に、ウェルあたり50マイクロリットルのECM細胞懸濁液を予め温めた24ウェルプレートでウェルを確認し、ECMの重合のために30分間インキュベートします。ウェルあたり500マイクロリットルの培養液を追加します。その後、2〜3日ごとに培養液をインキュベートして交換します。培養インサートをコーティングするには、コールドPBSで50マイクログラム/ミリリットルに希釈したコラーゲンIVを含むコーティング溶液を調製します。150マイクロリットルの希釈コーティング溶液を各細胞培養インサートに加え、一晩または3時間インキュベートします。分割から5日後、オルガノイドをP-1000ピペットでこすってECMで剥離します。培養液中でピペッティングして注意深く均質化し、氷上で5ミリリットルのコールドDMEMcを含む15ミリリットルのコニカルチューブに移します。採取したオルガノイドを500 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を注意深く吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した1ミリリットルの予め温めた酵素解離試薬に細胞ペレットを再懸濁します。ピペットを上下に10回動かしてオルガノイドの解離を開始します。酵素消化のために摂氏37度の水浴中で5分間インキュベートします。10回ピペッティングしてオルガノイドを機械的に破壊し、4ミリリットルの氷冷DMEMcを加えます。遠心分離して上清を廃棄してから、オルガノイド細胞ペレットを1ミリリットルのDMEMcに再懸濁します。細胞カウンターでトリパンブルーの細胞をカウントし、培養インサートごとに10〜5番目の細胞を2.5倍播種するのに必要な量を計算します。培養インサートあたり第5の細胞の2.5倍10個に相当する必要量の細胞懸濁液を遠心分離する。遠心分離中は、培養インサートからコーティング溶液を慎重に吸引し、蓋なしでフードの下で5分間乾燥させます。遠心分離後、上清を廃棄し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した必要量の2D培地にペレットを再懸濁します。200マイクロリットルの細胞懸濁液をコーティングされた透過性膜上に播種する。10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した500マイクロリットルの2D培地を下部コンパートメントに追加し、インキュベートします。膜上に高密度の細胞が観察されるべきである。播種の1日後に、エピカル培地と基礎培地をROCK阻害剤を含まない新鮮な2D培地と交換します。メディアは毎日交換してください。単層は播種後1日でコンフルエントになり、その実験に使用できます。この研究では、ブタの腸から上皮陰窩を採取し、液体窒素中での長期保存のために凍結保存しました。融解後、陰窩幹細胞をECMに播種した。オルガノイドは3〜4日以内に観察され、急速に成長し、出芽構造を発達させました。解凍後約10日目に、培養を拡大するためにオルガノイドの継代を行った。培養を最適に維持するために、パッケージングに使用されるオルガノイドは、成熟オルガノイドで観察されるような、内腔に黒い破片がなく、明確で空の内腔と明確に定義されたエッジを提示する必要があります。細胞は1日以内に付着して完全にコンフルエントな単層を形成し、これは約700ドーム平方センチメートルの高い経上皮電気抵抗(TEER)によって確認されます。TEERは3日間高いままです。アクチン染色は、上皮細胞の頂端側が3Dオルガノイドの内腔に向いていることを示す。培養インサートに播種されたオルガノイド細胞は、頂端側が上部コンパートメントに向けられた上皮細胞のコンフルエントな単層を形成します。オクルージン染色は、3Dオルガノイドおよび細胞単層における上皮細胞の頂端側にタイトジャンクションが存在することを明らかにします。細胞の単層を播種するために使用されるオルガノイドは、死んだ細胞の蓄積に対応する黒い破片のない空の内腔で透明に見えるべきであることを覚えておくことが重要です。ブタ腸オルガノイドの単分子膜は、機能アッセイ、イメージング、および遺伝子発現解析を使用して、上皮バリア機能に対する代謝産物または微生物の影響を試験するために使用できます。

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

ゼノプス胚細胞由来粘膜上皮上オルガノイド:生成、培養、高解像度ライブイメージング

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

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Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

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3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...