Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" -prosjektet) og av INRAE HOLOFLUX ("Holopig" -prosjektet). Forfatterne er takknemlige for Genotouls kjernefasiliteter (TFI). Vi anerkjenner Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) for nøye korrekturlesing.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen beskriver en metode som brukes til å kryobevare epitelkrypter fra gristarmen for langtidslagring og påfølgende kultur av 3D-organoider. Denne protokollen bruker en fryseløsning som inneholder DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hemmeren, DMEM og antibiotika. En annen studie hos griser oppnådde organoider fra krypter kryopreservert i en lignende fryseløsning, men uten ROCK-hemmeren15. Y27632 ROCK-hemmeren ble inkludert for å forhindre apoptose og opprettholde stamcellebassenget siden epitelkryptceller dissosieres etter tining, noe som kan føre til celledød ('anoikis')27,28. Interessant nok har hesteenteroider blitt hentet fra epitelkrypter frosset i et kulturmedium som bare inneholder DMEM og DMSO16; Denne enkle metoden er ikke testet for grisepitelkrypter ennå. Andre metoder har blitt publisert for å dyrke humane og grisorganoider fra frosne vev eller biopsier i stedet for epitelkrypter 4,17. Fordelen med denne metoden er evnen til direkte kryokonservering av tarmvevet uten å utføre kryptisolasjonsprosedyren, noe som krever tid og laboratorieutstyr. Dette kan være praktisk når vevet må samles langt fra laboratoriet. Men når man isolerer kryptene umiddelbart etter slakting, kan store tarmsegmenter behandles for å oppnå et meget høyt antall krypter, noe som ikke er tilfelle når man starter fra små frosne vevfragmenter. Etter tining av epitelkrypter ble organoider observert fra 3-4 dager etter såing og splittet etter 10 dager. Dette er en langsommere vekstrate enn når man starter kulturen fra ferske epitelkrypter, hvor organoidene ble oppnådd fra dag 1 etter såing, og kan vanligvis splittes rundt dag 511. Khalil et al. rapporterte også en forsinket vekst av grisenteroider når de startet fra frosne krypter15, noe som tyder på at stamceller kan trenge tid til å gjenopprette sin proliferative kapasitet. Vi fikk også et lavere antall organoider når vi startet fra frosne krypter sammenlignet med ferske krypter, noe som kan skyldes død av stamceller under fryseprosessen. I noen forsøk på opptining av krypter (<20 %) fikk vi ikke organoider fra frosne krypter, sannsynligvis på grunn av en suboptimal kryopreserveringsprosedyre (f.eks. forsinket frysing etter kryptisolering på sannsynligvis mer enn 1 time). Derfor anbefaler vi å holde kryptene på is til du teller, og fryse dem så raskt som mulig.
For 3D-organoider valgte vi å bruke et kommersielt organoid kulturmedium formulert for mennesker. Faktisk har tidligere rapporter vist at gristarmorganoider vokser effektivt med dette mediet 8,11,14,19,25,26,29,30. Det er av interesse for dette kulturmediet å være klar til bruk og ha en standardisert konsentrasjon av vekstfaktorer i en batch. Imidlertid er dette kulturmediet kostbart, dets sammensetning er ikke avslørt, og det er derfor ikke mulig å modulere sammensetningen. I motsetning til dette har andre studier dyrket gristarmorganoider i tilpassede medier som inneholder farmakologiske hemmere, rekombinant vekstfaktor og / eller betinget media 5,6,7,21. Selv om den er svært fleksibel og billigere, er denne metoden tidkrevende for produksjon av betingede medier og kan mangle reproduserbarhet på grunn av potensiell variabilitet i konsentrasjonen av vekstfaktorer i betingede medier. Dermed bør kvaliteten på hver batch av betingede medier valideres ved å måle organoid vekst eller markørgenuttrykk31.
En studie har vist at gris jejunale organoider dyrket i samme kommersielle organoid kultur medium som brukes her vokste raskere og virket mindre differensiert, sammenlignet med enteroider dyrket med medier som inneholder rekombinant vekstfaktor og / eller betinget media23. En høy proliferativ tilstand letter kulturen til 3D-organoider, men kan kreve indusering av differensiering for å være mer representativ for intestinale fysiologiske egenskaper. I denne protokollen, for passering av 3D-organoider, er cellene fullstendig dissosiert for telling, slik at man kan kontrollere antall celler som er sådd i ECM. Dette øker reproduserbarheten av fenotypen av organoider, som er sterkt påvirket av deres tetthet. Videre unngår telling av cellene å få for lav eller en overbefolket kultur, som krever tilpasning av kulturplanen. De fleste andre studier forberedte organoide fragmenter som ikke var fullstendig dissosiert til enkeltceller, og brukte et fortynningsforhold for passering. Denne metoden er enklere, men kan indusere variabilitet i henhold til kulturens organoide tetthet.
For kulturen i monolayers blir organoide celler sådd i kulturinnsatser forhåndsbelagt med et tynt lag ECM, som tillater vedlegg av celler, men unngår veksten av organoider i 3D. Denne protokollen brukte kollagen type IV som et ECM-protein, som beskrevet tidligere hos gris23. Andre studier med grisorganoide monolayers brukte samme tumoravledede ECM som brukes her til å dyrke 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fordelen med å bruke kollagen er evnen til å standardisere proteinkonsentrasjonen med en fullt definert sammensetning, noe som ikke er tilfelle i tumoravledet ECM. Et kritisk skritt for suksessen til kulturen av cellemonolayers er å være oppmerksom på det visuelle utseendet til forløperen 3D-organoider, som skal ha veldefinerte kanter og et tomt lumen uten svart rusk. Faktisk er organoider med høyt modningsnivå og lav proliferativ hastighet ikke en passende kilde til celler for 2D-kultur. Dermed er tidspunktet for dissosiasjon av 3D-organoider i enkeltceller avgjørende for suksessen til dette trinnet.
Kulturen av 2D-monolayers fra enkeltceller tillater standardisering av antall frøede celler, noe som er vanskeligere når man starter fra organoidfragmenter, som utført i noen andre metoder. Vi sådde 7,6 x 10 5 celler per cm 2, noe som er høyt sammenlignet med de fleste andre studier 21,22,23 hos griser som brukte en lavere celletetthet, fra0,25 x 10 5 celler per cm 2 til 1,78 x 10 5 celler per cm2. Kravet om et høyt antall organoidceller utgjør en begrensning av denne protokollen, men det tillot oss raskt å oppnå et sammenflytende monolag som dekker kulturinnsatsen fullt ut etter 1 dag. I kontrast oppnådde Vermeire et al.23 sammenløp etter 4-7 dager med en lavere tetthet av celler som ble sådd (fra 0,25 x 10 5 celler / cm 2 til 0,4 x 105 celler / cm2). Noen studier har også brukt grisorganoidcellemonolag som ikke fullt ut dekket kulturoverflaten for infeksjoner med virus 8,30. Under disse forholdene er den apikale siden av epitelceller tilgjengelig for behandlinger, men fullt konfluente monolayers er nødvendig hvis målet er å studere næringsopptak eller epitelpermeabilitet.
For organoidcellemonolag ble et kommersielt organoidkulturmedium supplert med 20% FBS brukt, basert på en nylig studie på bovine enteroid-avledede monolayers32. I våre tester var tilskuddet med 20% FBS nødvendig for å oppnå fullt konfluente monolayers, sannsynligvis på grunn av et høyt vekstfaktorkrav. Tvert imot har andre studier som bruker samme kommersielle medium etablert monolayers uten ytterligere FBS 8,25,30, men uten å nå full sammenløp. Andre studier har også brukt tilskudd med 20% FBS i et tilpasset medium for kulturen av grisorganoidcellemonolag21,22. I våre eksperimenter er TEER høy 1 dag etter såing (rundt 700 Ω · cm 2), og forblir høy til dag 3 (rundt 1,500 Ω · cm2; dette er konsistent med dannelsen av tette kryss, som indikert ved uttrykket av okkludin. Van der Hee et al. oppnådde lignende TEER-verdier over 72 timer for jejunum organoid cellemonolag21. De viste også at monolayers kan opprettholdes til dag 12-15 med daglige medieendringer. I motsetning til dette har andre studier rapportert mye lavere TEER-verdier (rundt 200 Ω · cm2) for grisorganoidcellemonolag 6,22. Disse forskjellene mellom studier kan være relatert til tarmsegmentet som studeres eller til mediet som brukes som påvirker epiteldifferensiering.
Avslutningsvis letter ovennevnte protokoll for å dyrke gristarm 3D-organoider fra frosne epitelkrypter organisasjonen av kulturarbeidet. Det reduserer behovet for friskt vev som skal hentes fra levende dyr. Vi forklarer også hvordan man etablerer fullt konfluente cellemonolag avledet fra grisorganoider på mindre enn 3 dager. Dermed kan protokollene våre være nyttige ressurser for forskere som studerer tarmepitelet hos gris for veterinær eller biomedisinsk forskning.

Tarmepitelet dannes av et monolag av celler som dekker fordøyelsesslimhinnen ved grensesnittet med luminalmiljøet. Denne posisjonen er forbundet med ulike funksjoner, som næringsopptak og barrierefunksjon, som støttes av tilstedeværelsen av stamceller og flere differensierte epitelcelletyper (absorberende, enteroendokrine, Paneth og begerceller)1. Immortaliserte cellelinjer som tradisjonelt brukes til å studere epitelceller har store begrensninger, siden de ikke reflekterer tarmepitelets cellulære kompleksitet og presenterer genomiske abnormiteter2. Utviklingen av tredimensjonale (3D) organoider av Sato et al.3 ga en ny modell for å studere tarmepitelet med en forbedret fysiologisk relevans. Faktisk er intestinale organoider avledet fra ikke-transformerte stamceller, består av flere celletyper og rekapitulerer funksjonaliteten til tarmepitelet. Intestinale organoider blir i økende grad brukt til å forstå utviklingen og funksjonene til tarmepitelet og dets interaksjoner med patogener, næringsstoffer, toksiner, legemidler, mikrobiota og dets metabolitter2.
Opprinnelig utviklet for mennesker og mus, har metodene som brukes til å dyrke intestinale organoider nylig blitt tilpasset andre arter, inkludert griser4. Gonzales et al.5 var de første til å dyrke grisorganoider fra jejunum ; Siden da har svineorganoider blitt beskrevet for andre tarmsegmenter (duodenum, ileum og colon)6,7,8, og har vist seg å beholde en stedsspesifikk fenotype 9,10,11. Gris intestinal 3D organoider er nå ofte brukt til å studere effekten av næringsstoffer 12,13 eller enteriske infeksjoner 6,8,14.
De fleste studiene har beskrevet kulturen av intestinale organoider med utgangspunkt i ferskt isolerte epitelkrypter. Dette er imidlertid ikke alltid mulig av logistiske årsaker, spesielt når du arbeider med store dyr som griser. Faktisk kan dyrefasiliteter for griser ligge langt fra laboratoriet der organoider dyrkes, noe som kompliserer arbeidsorganisasjonen. Dessuten er organoidkultur tidkrevende; Dermed er det ikke praktisk å samtidig dyrke flere organoide linjer, for eksempel fra forskjellige tarmsegmenter eller flere dyr. For å omgå disse problemene har noen få studier på mennesker, hester og griser beskrevet metoder for å dyrke organoider fra frosne tarmvev (eller biopsier) eller fra isolerte epitelkrypter 4,15,16,17. Disse metodene tillater kryopreservering av tarmepitelstamceller fra flere tarmsegmenter av et enkelt dyr, som deretter kan brukes til å dyrke organoider når det trengs. Videre tillater dette en sterk reduksjon i antall levende dyr som brukes som donorer av stamceller, siden store lagre av kryopreserverte krypter kan opprettes (prinsipper for 3R). En annen fordel med denne metoden er veksten av intestinale organoider bare fra dyr av interesse etter å ha oppnådd fenotypiske eller genotypiske resultater, noe som er svært kostnadseffektivt.
In vivo er intestinale epitelceller polariserte, med den apikale siden rettet mot lumen. In vitro, i 3D-organoider, vender den apikale siden av epitelceller også mot lumen (dvs. inne i organoidene)4. Denne organisasjonen forhindrer tilgang til den apikale siden, noe som er et problem når man studerer effekten av luminale komponenter (f.eks. Næringsstoffer, mikrober, metabolitter) på epitelceller. For å omgå denne ulempen har flere metoder blitt utviklet, for eksempel kulturen av organoide celler som 2D-monolag, mikroinjeksjon og polaritetsreversering ("apical-out organoids")18,19. Kulturen av organoidcellemonolayers fremstår som det mest effektive og håndterbare systemet. Prinsippet er å dissosiere 3D-organoider til enkeltceller og frø dem på et cellekulturfartøy som tidligere var belagt med et tynt lag ekstracellulær matriks (ECM)20. Ved disse kulturbetingelsene vender epitelcellenes apikale side oppover, og er dermed tilgjengelig for eksperimentell behandling20. Kulturen av organoidcellemonolag ble nylig tilpasset gristarmen21,22; cellemonolag avledet fra gris 3D-organoider har blitt brukt til flere applikasjoner, inkludert studiet av enteriske infeksjoner 6,23,24,25, transport av næringsstoffer9 og modellering av fordøyelsessykdommer 26.
Her presenterer denne studien først en detaljert protokoll for dyrkning og vedlikehold av 3D-organoider fra gris intestinal avledet fra kryopreserverte epitelkrypter (figur 1). Deretter beskrives en protokoll for å etablere cellemonolayers fra gris intestinal 3D-organoider. Metodene beskrevet her gir eksperimentelle verktøy som kan brukes til å studere grisens tarmepitel for næringstransport, barrierefunksjon og vertsmikroorganismeinteraksjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Intestinale organoider blir i økende grad brukt til å studere tarmepitelet for modellering av fordøyelsessykdommer, eller for å undersøke interaksjoner med legemidler, næringsstoffer, metabolitter, patogener og mikrobiota. Metoder for å dyrke intestinale organoider er nå tilgjengelige for flere arter, inkludert griser, som er en art av stor interesse både som husdyr og som en translasjonsmodell for mennesker, for eksempel for å studere zoonotiske sykdommer. Her gir vi en grundig beskrivelse av en prosedyre som brukes til å dyrke gris intestinal 3D-organoider fra frosne epitelkrypter. Protokollen beskriver hvordan man kryokonserverer epitelkrypter fra gristarmen og de påfølgende prosedyrene for å dyrke 3D-intestinale organoider. De viktigste fordelene ved denne metoden er (i) den tidsmessige dissosiasjonen av isoleringen av krypter fra kulturen av 3D-organoider, (ii) utarbeidelse av store lagre av kryopreserverte krypter avledet fra flere tarmsegmenter og fra flere dyr samtidig, og dermed (iii) reduksjonen i behovet for å prøve ferskt vev fra levende dyr. Vi beskriver også en protokoll for å etablere cellemonolag avledet fra 3D-organoider for å gi tilgang til den apikale siden av epitelceller, som er stedet for interaksjoner med næringsstoffer, mikrober eller legemidler. Samlet sett er protokollene beskrevet her en nyttig ressurs for å studere tarmepitelet gris i veterinær og biomedisinsk forskning.

Etter protokollen beskrevet ovenfor oppnås epitelkrypter fra gristarmen og kryopreservert for langtidslagring i flytende nitrogen (figur 1 og figur 2A). Etter tining blir kryptstamcellene sådd i ECM (figur 2B). Kryptstrukturen går vanligvis tapt etter dette trinnet, på grunn av oppløsningen av kryptstrukturen i ECM. Organoidene kan observeres innen 3-4 dager, og deretter vokse raskt og utvikle spirende strukturer (figur 2B). Vi oppnådde organoider etter tining av frosne krypter i >80% av forsøkene. Ca. 10 dager etter tining (i henhold til organoiders veksthastighet) utføres en passasje av organoider for å utvide kulturen (figur 3). Organoidene vokser raskere etter splitting, og de presenterer forskjellige morfologier, med noen cystiske og et flertall av spirende organoider. For optimal vedlikehold av kulturen må organoidene som brukes til passasjering presentere et klart og tomt lumen og veldefinerte kanter (eksempler indikert med grønne piler) uten svart rusk i lumen (indikert med røde piler), som observert i modne organoider (figur 3). Vi fant at svart celleavfall begynner å samle seg rundt dag 6 etter passasje. Det anbefales derfor å splitte eller fryse organoidene på dag 4-5 etter passasje.
Modenhetsstadiet av organoider er også et viktig punkt i å oppnå cellemonolag. Organoider med avansert modenhet (indikert ved tilstedeværelse av svartcelleavfall i lumen) er ikke optimale for frømonolag. Vi dissosierer vanligvis 3D-organoider 4 dager etter passering for å samle celler til 2D-kultur. Omtrent en til tre brønner av 3D-organoider dyrket ved 3000 celler per 50 μL kuppel av ECM er nødvendig for såing av en kulturinnsats med 2,5 x 105 celler. Celler fester seg og danner et fullt konfluent monolag innen 1 dag (figur 4A), som bekreftes av den høye TEER på rundt 700 Ω · cm2 (figur 4B). Cellekantene er imidlertid vanskelige å visualisere ved lysfeltmikroskopi på dette tidlige tidspunktet, sannsynligvis på grunn av et lavt differensieringsnivå. TEER forblir høy i 3 dager (figur 4B).
Aktinfarging indikerer at den apikale siden av epitelcellene er orientert mot lumen i 3D-organoider (figur 5A). Organoidceller sådd i kulturinnsats danner et konfluent enkeltlag av epitelceller, med den apikale siden orientert mot det øvre rommet (figur 4B,C). Okkludinfarging avslører tilstedeværelsen av tette kryss på den apikale siden av epitelcellene i 3D-organoider og i cellemonolag (figur 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av metodene som brukes til å dyrke 3D-organoider og cellemonolag avledet fra organoider. Epitelkrypter er isolert fra gristarmen. Disse kryptene kan i) brukes umiddelbart til å dyrke 3D-organoider eller ii) fryses og lagres i en biobank i flytende nitrogen. Kryopreserverte krypter kan tines og brukes til å dyrke 3D-organoider. 3D-organoidkulturen kan opprettholdes med suksessiv splitting, eller fryses og lagres i biobanken. Cellemonolag kan fås fra 3D-organoidkulturen for å gi tilgang til den apikale siden av cellene og studere epitelbarrierefunksjonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figur 2: Dyrkning av grisetarm 3D-organoider fra kryopreserverte epitelkrypter. (A) Representativt mikroskopisk bilde av nylig isolerte jejunale krypter. (B) Representative mikroskopiske bilder av 3D-organoider oppnådd etter tining av jejunalkryptene. Organoidene ble dyrket i en 25 μL kuppel av ECM i en 48-brønns plate. Figuren viser bilder av 3D-organoidene ved 4, 7, 8, 9 og 10 dager etter såing. Skalastangen representerer 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figur 3: Morfologi av grisetarm 3D-organoider avledet fra kryopreserverte epitelkrypter etter første passasje. Representative mikroskopiske bilder som viser utviklingen av organoider avledet fra kryopreserverte jejunumkrypter etter første passasje fra dag 4 til dag 7. Grønne piler indikerer klare organoider som passer for passasje eller såing av monolag. Røde piler indikerer modne organoider som ikke er egnet for splitting eller såing av monolag; Dermed bør brønner brukes før åpenbaringen av denne morfologien. Skalastangen representerer 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figur 4: Kjennetegn ved cellemonolag avledet fra 3D-organoider fra gris . (A) Representative mikroskopiske bilder av monolagsmorfologien over 3 dager. Jejunum organoide celler ble sådd ved 2,5 x 105 celler til 0,33 cm2 cellekulturinnsatser belagt med kollagen IV ved 50 ng/ml. Skalastangen representerer 500 μm. (B) Transepitelial elektrisk motstand (TEER) av organoidcellemonolag over 3 dager. Prikker forbundet med en linje tilsvarer den samme brønnen til forskjellige tider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figur 5: Avbildning av gris jejunum organoider dyrket i 3D eller 2D. Konfokalmikroskopiavbildning av (A) 3D-organoider 5 dager etter splitting og (B,C) organoidcellemonolag 3 dager etter sådd (B: XZ seksjon; C: XY-delen). DNA (blått) ble farget med DAPI. Aktin (rød) ble farget med falloidin. Okkludin (grønn) ble farget med et polyklonalt antistoff. Hvite piler indikerer okkludin lokalisert ved det stramme krysset. Skalastangen representerer 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Her beskriver vi en protokoll for å dyrke gris intestinal 3D-organoider fra kryopreserverte epitelkrypter. Vi beskriver også en metode for å etablere cellemonolag avledet fra 3D-organoider, noe som gir tilgang til den apikale siden av epitelceller.

Kultur av Piglet Intestinal 3D Organoids fra kryopreserverte epitelkrypter og etablering av cellemonolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Vår protokoll gir verktøy for å studere grisens tarmepitel for veterinær og biomedisinsk forskning. Intestinale organoider fra griser kan brukes til å studere næringstransport, barrierefunksjon og vertsmikrobeinteraksjoner. Gjennom bevaring av gris intestinal epitel krypter tillate å skape et stort lager av stamcelle som senere kan brukes til å dyrke organoid i 3D eller 2D monolayers.Denne protokollen er detaljert for jejunum, men den kan også brukes til andre tarmsegmenter som tolvfingertarm, ileum og tykktarm. For å begynne, tine raskt et hetteglass som inneholder 900 frosne krypter i et vannbad ved 37 grader Celsius. Overfør kryptløsningen til et 15 milliliter konisk rør.Sentrifuger ved 300 x g i fem minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. Tilsett 150 mikroliter av den ekstracellulære matrisen eller ECM med en avkjølt spiss for å oppnå en endelig konsentrasjon på 150 krypter per 25 mikroliter ECM. Pipett opp og ned 10 ganger for å oppnå en homogen suspensjon av krypter i ECM.Frø seks brønner med et fall på 25 mikroliter per brønn i en forvarmet 48-brønnsplate. Inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for polymerisering av ECM. Tilsett en 250 mikroliter per brønn kultur av medium ved romtemperatur og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Bytt kulturmedium hver andre til tredje dag. For å passere 3D-organoider avledet fra frosne krypter 10 dager etter såing, fjern kulturmediet og tilsett 250 mikroliter forvarmet PBS ved 37 grader Celsius. Etter inkubering, erstatt PBS med 250 mikroliter forvarmet enzymdissosiasjonsreagens supplert med 10 mikromolar steininhibitor ved 37 grader Celsius i hver brønn.Løsne organoidene i ECM ved å skrape med en P-1000 pipette og homogeniseres forsiktig ved pipettering fem ganger. Inkuber i fem minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid før du dissosierer cellene ved å pipettere opp og ned 10 ganger. Tilsett 500 mikroliter DMEMc i hver brønn som inneholder dissosierte celler og trekk opp til 12 brønner i et 15 milliliter konisk rør som inneholder tre milliliter kald DMEMc.Sentrifuge ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten og resuspender pelleten i en milliliter kald DMEMc. Tell cellene med en fortynning av en til to i trypanblå med en celleteller.Sentrifuge det nødvendige volumet av celleløsningen for å ha 3000 levende celler per kuppel. Resuspender pelleten med 17 mikroliter kald DMEMc per 3000 levende celler på is. Juster volumet til ønsket antall brønner.Tilsett sakte 33 mikroliter kald ECM per 3000 levende celler. Juster volumet til ønsket antall brønner og homogeniser uten å lage bobler. Se deretter brønnene med 50 mikroliter ECM-cellesuspensjon per brønn i en forvarmet 24-brønnsplate og inkuber i 30 minutter for polymerisering av ECM.Tilsett 500 mikroliter av kulturmediet per brønn. Deretter inkuberer og endrer kulturmediet hver to til tre dager. For å belegge kulturinnsatsen, klargjør beleggoppløsningen som inneholder kollagen IV fortynnet ved 50 mikrogram per milliliter i kald PBS.Tilsett 150 mikroliter av den fortynnede beleggløsningen til hver cellekulturinnsats og inkuber over natten eller i tre timer. Fem dager etter splitting, løsne organoidene med ECM ved å skrape dem med en P-1000 pipette. Homogeniseres forsiktig ved pipettering i kulturmediet og overføres til et 15 milliliter konisk rør som inneholder fem milliliter kald DMEMc på is.Sentrifuge de oppsamlede organoider ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender cellepelleten i en milliliter forvarmet enzymdissosiasjonsreagens tilsatt 10 mikromolar ROCK-hemmer. Pipett opp og ned 10 ganger for å initiere dissosiasjon av organoider.Inkuber i fem minutter i et 37 grader Celsius vannbad for enzymatisk fordøyelse. Forstyrr organoidene mekanisk ved å pipettere 10 ganger og tilsett fire milliliter iskald DMEMc. Sentrifuge og kast supernatanten før resuspendering av organoidcellepelleten i en milliliter DMEMc.Tell cellene i trypanblå med en celleteller og beregne nødvendig volum til frø 2,5 ganger 10 til femte celle per kulturinnsats. Sentrifuge det nødvendige volumet av cellesuspensjonen tilsvarende 2, 5 ganger 10 av den femte cellen per kulturinnsats. Under sentrifugering, aspirer beleggløsningen forsiktig fra kulturinnsatsene og la den tørke under hetten uten lokket i fem minutter.Etter sentrifugering skal supernatanten kastes og pelleten resuspenderes i nødvendig volum av 2D-medium tilsatt 10 mikromolar ROCK-hemmer. Frø 200 mikroliter av cellesuspensjonen på den belagte permeable membranen. Tilsett 500 mikroliter av 2D-mediet supplert med 10 mikromolar ROCK-inhibitor til underrommet og inkuber.En høy tetthet av celler bør observeres på membranen. En dag etter såing, erstatt episke og basale medier med friske 2D-medier uten ROCK-hemmeren. Bytt media hver dag.Monolaget blir sammenflytende en dag etter sådd og kan brukes til sine eksperimenter. I denne studien ble epitelkrypter oppnådd fra gristarmen og kryopreservert for langtidslagring i flytende nitrogen. Etter tining ble kryptstamcellene sådd i ECM.Organoidene ble observert innen tre til fire dager og vokste raskt og utviklet spirende strukturer. Ca. 10 dager etter tining ble passasjen av organoider utført for å utvide kulturen. For optimalt vedlikehold av kulturen må organoidene som brukes til emballasje presentere et klart og tomt lumen og veldefinerte kanter uten svart rusk i lumen som observert i modne organoider.Celler fester seg og danner et fullt sammenflytende monolag innen en dag, noe som bekreftes av den høye transepiteliale elektriske motstanden, eller TEER, på rundt 700 kupler kvadratcentimeter. TEER forblir høy i tre dager. Aktinfarging indikerer at den apikale siden av epitelcellene er orientert mot lumen i 3D-organoider.Organoidceller sådd i kulturinnsatser danner et sammenflytende enkeltlag av epitelceller med den apikale siden orientert mot det øvre rommet. Okkludinfarging avslører tilstedeværelsen av tette kryss på den apikale siden av epitelcellene i 3D-organoider og i cellemonolag. Det er viktig å huske at organoid som brukes til å frø cellemonolag, skal virke klart med et tomt lumen uten svart rusk som tilsvarer en opphopning av døde celler.Monolayers fra gris intestinal organoid kan brukes til å teste effekten av metabolitter eller mikrober på epitelbarrierefunksjonen ved hjelp av funksjonelle analyser, avbildning og genuttrykksanalyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary Epitel Organoids fra Xenopus embryonale celler: Generasjon, kultur og høyoppløselig live imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Culturing av organoider fra Intestinal Villi Epithelium Gjennomgår Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generasjon murine primær kolon epitelial monolayers fra intestinale krypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering og genetisk manipulering av murin hepatocytt organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med høy gjennomstrømning for kultur og 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablering av 3D Endometrial Organoids fra Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrking av organoider fra murintestinale krypter og en enkelt stamcelle for organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studere epiteleffekter av tarmbetennelse in vitro på etablerte murinkolonoider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...