Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Institut Carnot France Futur Elevage (projeto "OrganoPig") e pelo INRAE HOLOFLUX (projeto "Holopig"). Os autores agradecem às instalações centrais de Genotoul (TRI). Agradecemos a Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) pela revisão cuidadosa.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método utilizado para criopreservar criptas epiteliais do intestino de leitões para o armazenamento a longo prazo e posterior cultura de organoides 3D. Este protocolo utiliza uma solução de congelamento contendo DMSO, FBS, inibidor Y27632 ROCK, DMEM e antibióticos. Outro estudo em suínos obteve organoides de criptas criopreservadas em solução de congelamento semelhante, porém sem o inibidor de ROCK15. O inibidor Y27632 ROCK foi incluído para prevenir a apoptose e manter o pool de células-tronco, uma vez que, após o descongelamento, as células epiteliais das criptas são dissociadas, o que pode levar à morte celular ('anoikis')27,28. Curiosamente, enteróides equinos foram obtidos de criptas epiteliais congeladas em meio de cultura contendo apenas DMEM e DMSO16; Este método simples ainda não foi testado para criptas epiteliais de suínos. Outros métodos foram publicados para cultivar organoides humanos e suínos a partir de tecidos congelados ou biópsias em vez de criptas epiteliais 4,17. A vantagem deste método é a capacidade de criopreservar diretamente os tecidos intestinais sem realizar o procedimento de isolamento de criptas, o que requer tempo e equipamentos de laboratório. Isso pode ser conveniente quando os tecidos precisam ser coletados longe do laboratório. No entanto, ao isolar as criptas imediatamente após o abate, grandes segmentos do intestino podem ser processados para obter um número muito alto de criptas, o que não é o caso quando se inicia a partir de pequenos fragmentos de tecido congelado. Após o descongelamento das criptas epiteliais, organoides foram observados de 3 a 4 dias pós-semeadura e divididos após 10 dias. Esta é uma taxa de crescimento mais lenta do que quando se inicia a cultura a partir de criptas epiteliais frescas, para as quais os organoides foram obtidos a partir do 1º dia pós-semeadura, e geralmente pode ser dividida por volta do dia 511. Khalil e col. também relataram um crescimento retardado de enteróides suínos quando se iniciam a partir de criptas congeladas15, sugerindo que as células-tronco podem requerer tempo para recuperar sua capacidade proliferativa. Também obtivemos um número menor de organoides quando partimos de criptas congeladas em comparação com criptas frescas, o que pode ser devido à morte de células-tronco durante o processo de congelamento. Em algumas tentativas de descongelamento de criptas (<20%), não obtivemos organoides de criptas congeladas, provavelmente devido a um procedimento de criopreservação subótimo (por exemplo, congelamento tardio após isolamento de criptas provavelmente mais de 1 h). Assim, recomendamos manter as criptas no gelo até a contagem e congelá-las o mais rápido possível.
Para organoides 3D, optou-se por utilizar um meio de cultura organoide comercial formulado para humanos. De fato, relatos prévios mostraram que organoides intestinais de suínos crescem eficientemente com este meio 8,11,14,19,25,26,29,30. É de interesse que este meio de cultura esteja pronto para uso e tenha uma concentração padronizada de fatores de crescimento dentro de um lote. No entanto, esse meio de cultura é caro, sua composição não é revelada e, portanto, não é possível modular sua composição. Em contrapartida, outros estudos cultivaram organoides intestinais de suínos em meios personalizados contendo inibidores farmacológicos, fator de crescimento recombinante e/ou meios condicionados 5,6,7,21. Embora altamente flexível e mais barato, este método é demorado para a produção de meios condicionados e pode carecer de reprodutibilidade devido à potencial variabilidade na concentração de fatores de crescimento em meios condicionados. Assim, a qualidade de cada lote de meio condicionado deve ser validada pela medida do crescimento organoide ou da expressão gênica do marcador31.
Um estudo mostrou que organoides jejunais de suínos cultivados no mesmo meio de cultura organoide comercial aqui utilizado cresceram mais rapidamente e pareceram menos diferenciados, em comparação com enteroides cultivados com meios contendo fator de crescimento recombinante e/ou meios condicionados23. Um alto estado proliferativo facilita a cultura de organoides 3D, mas pode exigir a indução da diferenciação para ser mais representativa das características fisiológicas intestinais. Neste protocolo, para a passagem de organoides 3D, as células são totalmente dissociadas para contagem, permitindo controlar o número de células semeadas na MEC. Isso aumenta a reprodutibilidade do fenótipo dos organoides, que é altamente influenciado por sua densidade. Além disso, a contagem das células evita a obtenção de uma cultura muito baixa ou superlotada, o que requer a adaptação do cronograma de cultura. A maioria dos outros estudos preparou fragmentos organoides não totalmente dissociados de células isoladas e usou uma razão de diluição para a passagem. Este método é mais simples, mas pode induzir variabilidade de acordo com a densidade organoide da cultura.
Para o cultivo em monocamadas, as células organoides são semeadas em pastilhas de cultura pré-revestidas com uma fina camada de MEC, que permite a fixação das células, mas evita o crescimento de organoides em 3D. Esse protocolo utilizou colágeno tipo IV como proteína da MEC, como descrito anteriormente em suínos23. Outros estudos com monocamadas organoides de suínos utilizaram a mesma MEC derivada do tumor aqui utilizada para cultura de organoides 3D 6,8,9,21,25,30. A vantagem do uso do colágeno é a capacidade de padronizar a concentração proteica com uma composição totalmente definida, o que não é o caso da MEC derivada do tumor. Um passo crítico para o sucesso da cultura de monocamadas celulares é prestar atenção à aparência visual dos organoides precursores 3D, que devem ter bordas bem definidas e um lúmen vazio sem detritos pretos. De fato, organoides com alto nível de maturação e baixa taxa proliferativa não são uma fonte apropriada de células para cultura 2D. Assim, o momento da dissociação dos organoides 3D em células isoladas é crucial para o sucesso desta etapa.
O cultivo de monocamadas 2D a partir de células isoladas permite padronizar o número de células semeadas, o que é mais difícil quando se inicia a partir de fragmentos organoides, como realizado em alguns outros métodos. Semeamos 7,6 x 10 5 células por cm 2, o que é alto em comparação com a maioria dos outros estudos 21,22,23 em suínos que utilizaram uma densidade celular menor, variando de 0,25 x 10 5 células por cm 2 a 1,78 x 10 5 células por cm 2. A exigência de um número elevado de células organoides constitui uma limitação deste protocolo, mas nos permitiu obter rapidamente uma monocamada confluente, cobrindo totalmente a inserção da cultura após 1 dia. Em contraste, Vermeire et al.23 obtiveram confluência após 4-7 dias com menor densidade de células semeadas (de 0,25 x10 5 células/cm 2 a 0,4 x 105 células/cm2). Alguns estudos também utilizaram monocamadas de células organoides de suínos que não cobriam totalmente a superfície de cultura para infecções por vírus 8,30. Nessas condições, o lado apical das células epiteliais é acessível para tratamentos, mas monocamadas totalmente confluentes são necessárias se o objetivo for estudar a absorção de nutrientes ou a permeabilidade epitelial.
Para as monocamadas de células organoides, foi utilizado meio de cultura organoide comercial suplementado com SFB a 20%, baseado em estudo recente sobre monocamadas derivadas de enteróides bovinos32. Em nossos testes, a suplementação com 20% de SFB foi necessária para a obtenção de monocamadas totalmente confluentes, provavelmente devido à alta exigência de fator de crescimento. Ao contrário, outros estudos utilizando o mesmo meio comercial estabeleceram monocamadas sem FBS adicional 8,25,30, mas sem atingir confluência completa. Outros estudos também utilizaram a suplementação com SFB a 20% em meio personalizado para cultura de monocamadas de células organoides suínas21,22. Em nossos experimentos, o TEER é alto 1 dia após a semeadura (em torno de 700 Ω·cm 2), e permanece alto até o dia 3 (em torno de 1.500 Ω·cm2; isso é consistente com a formação de tight junctions, como indicado pela expressão de occludina. obtiveram valores TEER semelhantes ao longo de 72 h para monocamadas de células organoides do jejuno21. Eles também demonstraram que as monocamadas podem ser mantidas até o dia 12-15 com trocas diárias de meio. Em contraste, outros estudos relataram valores TEER muito mais baixos (em torno de 200 Ω·cm2) para monocamadas de células organoides de suínos 6,22. Essas diferenças entre os estudos podem estar relacionadas ao segmento intestinal estudado ou aos meios utilizados que influenciam a diferenciação epitelial.
Em conclusão, o protocolo acima para o cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais congeladas facilita a organização do trabalho de cultura. Reduz a necessidade de obter tecidos frescos de animais vivos. Também explicamos como estabelecer monocamadas celulares totalmente confluentes derivadas de organoides suínos em menos de 3 dias. Assim, nossos protocolos poderiam ser recursos úteis para cientistas que estudam o epitélio intestinal de suínos para pesquisas veterinárias ou biomédicas.

O epitélio intestinal é formado por uma monocamada de células que recobre a mucosa digestiva na interface com o meio luminal. Essa posição está associada a diversas funções, como absorção de nutrientes e função de barreira, que são suportadas pela presença de células-tronco e múltiplos tipos de células epiteliais diferenciadas (absortivas, enteroendócrinas, paneth e caliciformes)1. Linhagens celulares imortalizadas tradicionalmente utilizadas para o estudo de células epiteliais apresentam grandes limitações, pois não refletem a complexidade celular do epitélio intestinal e apresentam anormalidadesgenômicas2. O desenvolvimento de organoides tridimensionais (3D) por Sato et al.3 forneceu um novo modelo para o estudo do epitélio intestinal com melhor relevância fisiológica. De fato, os organoides intestinais são derivados de células-tronco não transformadas, são compostos por vários tipos celulares e recapitulam a funcionalidade do epitélio intestinal. Os organoides intestinais estão sendo cada vez mais utilizados para compreender o desenvolvimento e as funções do epitélio intestinal e suas interações com patógenos, nutrientes, toxinas, fármacos, microbiota e seus metabólitos2.
Inicialmente desenvolvidos para humanos e camundongos, os métodos utilizados para cultivo de organoides intestinais foram recentemente adaptados para outras espécies, incluindosuínos4. Gonzales et al.5 foram os primeiros a cultivar organoides de suínos a partir do jejuno; Desde então, organoides suínos têm sido descritos para outros segmentos intestinais (duodeno, íleo e cólon)6,7,8 e demonstraram manter um fenótipo local-específico9,10,11. Organoides 3D intestinais de suínos são atualmente comumente utilizados para estudar o efeito de nutrientes 12,13 ou infecções entéricas 6,8,14.
A maioria dos estudos descreveu a cultura de organoides intestinais a partir de criptas epiteliais recém-isoladas. No entanto, isso nem sempre é viável por razões logísticas, principalmente quando se trabalha com animais de grande porte, como porcos. De fato, as instalações para animais para suínos podem ser localizadas longe do laboratório onde os organoides são cultivados, o que dificulta a organização do trabalho. Além disso, a cultura de organoides é demorada; Assim, não é prático cultivar simultaneamente múltiplas linhas organoides, por exemplo, a partir de diferentes segmentos intestinais ou vários animais. Para contornar essas questões, poucos estudos em humanos, equinos e suínos descreveram métodos para cultura de organoides a partir de tecidos intestinais congelados (ou biópsias) ou de criptas epiteliais isoladas 4,15,16,17. Esses métodos permitem a criopreservação de células-tronco epiteliais intestinais de múltiplos segmentos intestinais de um único animal, que podem ser usadas para cultivar organoides quando necessário. Além disso, isso permite uma forte redução no número de animais vivos utilizados como doadores de células-tronco, uma vez que grandes estoques de criptas criopreservadas podem ser criados (princípios do 3R). Outra vantagem deste método é o crescimento de organoides intestinais apenas a partir de animais de interesse após a obtenção de resultados fenotípicos ou genotípicos, o que é altamente custo-efetivo.
In vivo, as células epiteliais intestinais são polarizadas, com o lado apical direcionado para a luz. In vitro, em organoides 3D, o lado apical das células epiteliais também está voltado para o lúmen (ou seja, dentro dos organoides)4. Essa organização impede o acesso ao lado apical, o que é um problema ao estudar os efeitos de componentes luminais (por exemplo, nutrientes, micróbios, metabólitos) nas células epiteliais. Para contornar essa desvantagem, vários métodos têm sido desenvolvidos, como o cultivo de células organoides como monocamadas 2D, microinjeção e reversão de polaridade ("apical-out organoids")18,19. A cultura de monocamadas de células organoides vem emergindo como o sistema mais eficiente e tratável. O princípio é dissociar organoides 3D em células únicas e semeá-los em um vaso de cultura celular previamente revestido com uma fina camada de matriz extracelular (MEC)20. Nessas condições de cultura, a face apical das células epiteliais está voltada para cima, sendo, portanto, acessível a tratamentos experimentais20. A cultura de monocamadas de células organoides foi recentemente adaptada para o intestino desuínos 21,22; monocamadas celulares derivadas de organoides 3D de suínos têm sido utilizadas para múltiplas aplicações, incluindo o estudo de infecções entéricas 6,23,24,25, o transporte de nutrientes9 e a modelagem de doenças digestivas 26.
Aqui, este estudo apresenta primeiramente um protocolo detalhado para o cultivo e manutenção de organoides 3D intestinais de suínos derivados de criptas epiteliais criopreservadas (Figura 1). Em seguida, um protocolo é descrito para estabelecer monocamadas celulares a partir de organoides 3D intestinais de suínos. Os métodos aqui descritos fornecem ferramentas experimentais que podem ser usadas para estudar o epitélio intestinal de suínos quanto ao transporte de nutrientes, função de barreira e interações hospedeiro-microrganismo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Os organoides intestinais estão sendo cada vez mais usados para estudar o epitélio intestinal para modelagem de doenças digestivas, ou para investigar interações com drogas, nutrientes, metabólitos, patógenos e a microbiota. Métodos para cultivar organoides intestinais estão agora disponíveis para várias espécies, incluindo porcos, que é uma espécie de grande interesse tanto como animal de criação quanto como modelo translacional para humanos, por exemplo, para estudar doenças zoonóticas. Aqui, descrevemos em profundidade um procedimento usado para cultivar organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais congeladas. O protocolo descreve como criopreservar criptas epiteliais do intestino de suínos e os procedimentos subsequentes para cultura de organoides intestinais 3D. As principais vantagens deste método são (i) a dissociação temporal do isolamento de criptas da cultura de organoides 3D, (ii) a preparação de grandes estoques de criptas criopreservadas derivadas de múltiplos segmentos intestinais e de vários animais ao mesmo tempo e, portanto, (iii) a redução da necessidade de coletar amostras de tecidos frescos de animais vivos. Também detalhamos um protocolo para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D para permitir o acesso ao lado apical das células epiteliais, que é o local de interações com nutrientes, micróbios ou drogas. De modo geral, os protocolos aqui descritos são um recurso útil para o estudo do epitélio intestinal de suínos em pesquisas veterinárias e biomédicas.

Seguindo o protocolo descrito acima, criptas epiteliais são obtidas do intestino de suínos e criopreservadas para armazenamento em nitrogênio líquido a longo prazo (Figura 1 e Figura 2A). Após o descongelamento, as células-tronco das criptas são semeadas na MEC (Figura 2B). A estrutura da cripta é geralmente perdida após esta etapa, devido à desintegração da estrutura da cripta no ECM. Os organoides podem ser observados dentro de 3-4 dias, e então crescem rapidamente e desenvolvem estruturas em brotamento (Figura 2B). Obtivemos organoides após o descongelamento de criptas congeladas em >80% das tentativas. Aproximadamente 10 dias após o descongelamento (de acordo com a taxa de crescimento dos organoides), é realizada a passagem dos organoides para expansão da cultura (Figura 3). Os organoides crescem mais rapidamente após a secundarização, e apresentam morfologias diversas, com alguns organoides císticos e a maioria de brotantes. Para uma ótima manutenção da cultura, os organoides utilizados para a passagem devem apresentar lúmen claro e vazio e bordas bem definidas (exemplos indicados por setas verdes) sem restos pretos no lúmen (indicados por setas vermelhas), como observado em organoides maduros (Figura 3). Descobrimos que os detritos de células pretas começam a se acumular por volta do 6º dia pós-passagem. Assim, recomenda-se dividir ou congelar os organoides no dia 4-5 pós-passagem.
O estágio de maturidade dos organoides também é um ponto importante na obtenção de monocamadas celulares. Organoides com maturidade avançada (indicada pela presença de restos de células pretas no lúmen) não são ideais para semear monocamadas. Costumamos dissociar organoides 3D 4 dias após a passagem para coletar células para cultura 2D. Aproximadamente um a três poços de organoides 3D cultivados a 3.000 células por cúpula de 50 μL da MEC são necessários para semear uma pastilha de cultura com 2,5 x 105 células. As células se ligam e formam uma monocamada totalmente confluente em 1 dia (Figura 4A), o que é confirmado pelo TEER alto de cerca de 700 Ω·cm2 (Figura 4B). No entanto, as bordas celulares são difíceis de visualizar por microscopia de campo claro neste momento inicial, provavelmente devido a um baixo nível de diferenciação. O TEER permanece elevado por 3 dias (Figura 4B).
A coloração de actina indica que a face apical das células epiteliais está orientada para o lúmen em organoides 3D (Figura 5A). As células organoides semeadas em cultura inserem uma única camada confluente de células epiteliais, com o lado apical orientado para o compartimento superior (Figura 4B,C). A coloração oclusal revela a presença de tight junctions na face apical das células epiteliais em organoides 3D e em monocamadas celulares (Figura 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática dos métodos utilizados para cultura de organoides 3D e monocamadas celulares derivadas de organoides. As criptas epiteliais são isoladas do intestino do leitão. Essas criptas podem i) ser usadas imediatamente para cultura de organoides 3D ou ii) ser congeladas e armazenadas em um biobanco em nitrogênio líquido. Criptas criopreservadas podem ser descongeladas e usadas para cultivar organoides 3D. A cultura organoide 3D pode ser mantida com bipartição sucessiva, ou congelada e armazenada no biobanco. Monocamadas celulares podem ser obtidas a partir da cultura organoide 3D para permitir o acesso ao lado apical das células e estudar a função de barreira epitelial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figura 2: Cultura de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. (A) Imagem microscópica representativa de criptas jejunais recém-isoladas. (B) Imagens microscópicas representativas de organoides 3D obtidas após o descongelamento das criptas jejunais. Os organoides foram cultivados em uma cúpula de 25 μL de MEC em uma placa de 48 poços. A figura mostra imagens dos organoides 3D aos 4, 7, 8, 9 e 10 dias pós-semeadura. A barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figura 3: Morfologia de organoides 3D intestinais de suínos derivados de criptas epiteliais criopreservadas após a primeira passagem. Imagens microscópicas representativas mostrando o desenvolvimento de organoides derivados de criptas criptas criopreservadas do jejuno após a primeira passagem do dia 4 para o dia 7. As setas verdes indicam organoides claros apropriados para a passagem ou semeadura de monocamadas. As setas vermelhas indicam organoides maduros não adequados para dividir ou semear monocamadas; Assim, poços devem ser utilizados antes da aparição desta morfologia. A barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figura 4: Características das monocamadas celulares derivadas de organoides 3D intestinais de suínos . (A) Imagens microscópicas representativas da morfologia da monocamada ao longo de 3 dias. As células organoides do jejuno foram semeadas a 2,5 x 10,55 células em pastilhas de cultura de células de 0,33cm2 revestidas com colágeno IV a 50 ng/mL. A barra de escala representa 500 μm. (B) Resistência elétrica transepitelial (TEER) de monocamadas de células organoides durante 3 dias. Pontos conectados por uma linha correspondem ao mesmo poço em momentos diferentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figura 5: Imagem de organoides do jejuno de suínos cultivados em 3D ou 2D. Microscopia confocal de (A) organoides 3D 5 dias após a divisão e (B,C) monocamadas de células organoides 3 dias após a semeadura (B: secção XZ; C: seção XY). DNA (azul) foi corado com DAPI. Actina (vermelho) foi corada com faloidina. A ocludina (verde) foi corada com anticorpo policlonal. Setas brancas indicam ocludina localizada na junção apertada. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Nosso protocolo fornece ferramentas para o estudo do epitélio intestinal de suínos para pesquisas veterinárias e biomédicas. Organoides intestinais de suínos podem ser usados para estudar o transporte de nutrientes, a função de barreira e as interações hospedeiro-micróbio. Através da preservação de criptas epiteliais intestinais de suínos permitem criar um grande estoque de células-tronco que posteriormente podem ser usadas para cultura de organoides em monocamadas 3D ou 2D.Esse protocolo é detalhado para o jejuno, mas também pode ser usado para outros segmentos intestinais, como duodeno, íleo e cólon. Para começar, descongele rapidamente um frasco contendo 900 criptas congeladas em banho-maria a 37 graus Celsius. Transfira a solução da cripta para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente e retirar o sobrenadante. Adicionar 150 microlitros da matriz extracelular ou MEC com uma ponta resfriada para obter uma concentração final de 150 criptas por 25 microlitros de MEC. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes para obter uma suspensão homogênea de criptas na MEC.Semeando seis poços com uma gota de 25 microlitros por poço em uma placa pré-aquecida de 48 poços. Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para polimerização da MEC. Adicionar 250 microlitros por poço de cultura de meio à temperatura ambiente e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Para passar organoides 3D derivados de criptas congeladas 10 dias após a semeadura, remova o meio de cultura e adicione 250 microlitros de PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após a incubação, substituir o PBS por 250 microlitros de reagente de dissociação enzimática pré-aquecido suplementado com 10 inibidor de rocha micromolar a 37 graus Celsius em cada poço.Separar os organoides na MEC raspando com pipeta P-1000 e homogeneizar cuidadosamente por pipetagem cinco vezes. Incubar durante cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de dissociar as células pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione 500 microlitros de DMEMc em cada poço contendo células dissociadas e puxe até 12 poços em um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de DMEMc frio.Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de DMEMc frio. Conte as células com uma diluição de um a dois em azul de tripano com um contador de células.Centrifugar o volume necessário da solução celular para ter 3000 células vivas por cúpula. Ressuspender o pellet com 17 microlitros de DMEMc frio por 3000 células vivas no gelo. Ajuste o volume ao número necessário de poços.Adicione lentamente 33 microlitros de ECM frio por 3000 células vivas. Ajuste o volume ao número necessário de poços e homogeneize sem fazer bolhas. Em seguida, veja os poços com 50 microlitros da suspensão da célula ECM por poço em uma placa pré-aquecida de 24 poços e incube por 30 minutos para polimerização da MEC.Adicione 500 microlitros do meio de cultura por poço. Em seguida, incube e troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Para revestir a pastilha de cultura, prepare a solução de revestimento contendo colágeno IV diluído a 50 microgramas por mililitro em PBS frio.Adicionar 150 microlitros da solução de revestimento diluída a cada pastilha de cultura celular e incubar durante a noite ou durante três horas. Cinco dias após a bivisão, desprender os organoides com a MEC raspando-os com uma pipeta P-1000. Homogeneizado cuidadosamente por pipetagem no meio de cultura e transferido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DMEMc frio sobre gelo.Centrifugar os organoides recolhidos a 500 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em um mililitro de reagente de dissociação enzimática pré-aquecido suplementado com 10 inibidor de ROCK micromolares. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes para iniciar a dissociação dos organoides.Incubar por cinco minutos em banho-maria de 37 graus Celsius para digestão enzimática. Interrompa mecanicamente os organoides pipetando 10 vezes e adicione quatro mililitros de DMEMc gelado. Centrifugar e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet de células organoides em um mililitro de DMEMc.Contar as células em azul de tripano com um contador de células e calcular o volume necessário para semear 2,5 vezes 10 até a quinta célula por inserção de cultura. Centrifugar o volume necessário da suspensão celular correspondente a 2,5 vezes 10 das quintas células por inserção de cultura. Durante a centrifugação, aspirar cuidadosamente a solução de revestimento das pastilhas de cultura e deixá-la secar sob o capô sem a tampa por cinco minutos.Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet no volume necessário de meio 2D suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolares. Seme 200 microlitros da suspensão celular na membrana permeável revestida. Adicionar 500 microlitros do meio 2D suplementado com 10 inibidor de ROCK micromolar ao compartimento inferior e incubar.Uma alta densidade de células deve ser observada na membrana. Um dia após a semeadura, substituir o meio épico e basal por meios 2D frescos sem o inibidor de ROCK. Mude a mídia todos os dias.A monocamada torna-se confluente um dia após a semeadura e pode ser usada para seus experimentos. Neste estudo, criptas epiteliais foram obtidas do intestino de suínos e criopreservadas para armazenamento em nitrogênio líquido a longo prazo. Após o descongelamento, as células-tronco das criptas foram semeadas na MEC.Os organoides foram observados dentro de três a quatro dias e rapidamente cresceram e desenvolveram estruturas em brotamento. Aproximadamente 10 dias após o descongelamento, foi realizada a passagem dos organoides para ampliação da cultura. Para uma ótima manutenção da cultura, os organoides utilizados para embalagem devem apresentar lúmen claro e vazio e bordas bem definidas, sem restos pretos no lúmen, como observado em organoides maduros.As células se ligam e formam uma monocamada totalmente confluente dentro de um dia, o que é confirmado pela alta resistência elétrica transepitelial, ou TEER, de cerca de 700 cúpulas de centímetros quadrados. O TEER permanece alto por três dias. A coloração de actina indica que o lado apical das células epiteliais está orientado para o lúmen em organoides 3D.As células organoides semeadas em inserções de cultura formam uma camada única confluente de células epiteliais com o lado apical orientado para o compartimento superior. A coloração de ocludina revela a presença de tight junctions na face apical das células epiteliais em organoides 3D e em monocamadas celulares. É importante lembrar que os organoides usados para semear monocamadas celulares devem aparecer claros com um lúmen vazio sem detritos pretos correspondendo a um acúmulo de células mortas.Monocamadas de organoides intestinais de suínos podem ser usadas para testar os efeitos de metabólitos ou micróbios sobre a função de barreira epitelial usando ensaios funcionais, imagens e análise de expressão gênica.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Organoides epiteliais mucociliais de células embrionárias xenopus: geração, cultura e imagem ao vivo de alta resolução

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Biologia

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Culturação 3D de Organoides do Epitélio Intestinal Villi passando por Dediferente

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...