Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Эта работа была поддержана Institut Carnot France Futur Elevage (проект OrganoPig) и INRAE HOLOFLUX (проект Holopig). Авторы выражают благодарность Генотульскому керну (TRI). Выражаем благодарность Кристель Кнудсен (GenPhySE, INRAE, Тулуза) за тщательную корректуру.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

Авторам раскрывать нечего.

В этом протоколе описывается метод, используемый для криоконсервации эпителиальных крипт из кишечника поросенка для длительного хранения и последующего культивирования 3D-органоидов. В этом протоколе используется замораживающий раствор, содержащий ДМСО, FBS, ингибитор Y27632 ROCK, DMEM и антибиотики. В другом исследовании на свиньях были получены органоиды из криоконсервированных крипт в аналогичном замораживающем растворе, но без ингибитора ROCK15. Ингибитор Y27632 ROCK был включен для предотвращения апоптоза и поддержания пула стволовых клеток, поскольку после размораживания эпителиальные криптовые клетки диссоциируют, что может привести к гибели клеток («анойкис»)27,28. Интересно, что конские энтероиды были получены из эпителиальных крипт, замороженных в питательной среде, содержащей только DMEM и DMSO16; Этот простой метод еще не был протестирован на эпителиальных криптах свиней. Были опубликованы другие методы выращивания органоидов человека и свиньи из замороженных тканей или биопсий вместо эпителиальных крипт 4,17. Преимуществом данного метода является возможность непосредственно криоконсервировать ткани кишечника без проведения процедуры выделения крипты, что требует времени и лабораторного оборудования. Это может быть удобно, когда ткани нужно собирать далеко от лаборатории. Однако при выделении крипт сразу после убоя большие сегменты кишечника могут быть обработаны для получения очень большого количества крипт, чего нельзя сказать, когда речь идет о небольших замороженных фрагментах тканей. После оттаивания эпителиальных крипт органоиды наблюдались через 3-4 дня после посева и расщеплялись через 10 дней. Это более медленная скорость роста, чем при запуске культуры из свежих эпителиальных крипт, для которых органоиды были получены с 1-го дня после посева, и обычно могут быть разделены примерно на 5-й день11. Khalil et al. также сообщили об отсроченном росте энтероидов свиньи при запуске из замороженных крипт15, предполагая, что стволовым клеткам может потребоваться время для восстановления их пролиферативной способности. Мы также получили меньшее количество органоидов при запуске из замороженных крипт по сравнению со свежими криптами, что может быть связано с гибелью стволовых клеток в процессе замораживания. В некоторых попытках размораживания крипт (<20%) мы не получали органоиды из замороженных крипт, вероятно, из-за неоптимальной процедуры криоконсервации (например, отложенное замораживание после выделения крипты, вероятно, более 1 часа). Таким образом, мы рекомендуем хранить склепы на льду до подсчета и замораживать их как можно быстрее.
Для 3D-органоидов мы решили использовать коммерческую среду для культивирования органоидов, разработанную для людей. Действительно, предыдущие отчеты показали, что органоиды кишечника свиньи эффективно растут в этой среде 8,11,14,19,25,26,29,30. Интересно, чтобы эта питательная среда была готова к использованию и имела стандартизированную концентрацию факторов роста в партии. Однако эта питательная среда является дорогостоящей, ее состав не раскрыт, и, таким образом, невозможно модулировать ее состав. Напротив, в других исследованиях культивировались органоиды кишечника свиньи в специализированных средах, содержащих фармакологические ингибиторы, рекомбинантный фактор роста и/или кондиционированные среды 5,6,7,21. Несмотря на высокую гибкость и дешевизну, этот метод требует много времени для производства кондиционированных сред и может не иметь воспроизводимости из-за потенциальной изменчивости концентрации факторов роста в кондиционированных средах. Таким образом, качество каждой партии кондиционированных сред должно быть подтверждено путем измерения роста органоидов или экспрессии маркерных генов31.
Исследование показало, что органоиды тощей кишки свиньи, культивируемые в той же коммерческой среде для культивирования органоидов, которые использовались здесь, росли быстрее и казались менее дифференцированными по сравнению с энтероидами, культивируемыми со средами, содержащими рекомбинантный фактор роста и/или кондиционированные среды23. Высокое пролиферативное состояние облегчает культивирование 3D-органоидов, но может потребовать индуцирования дифференцировки, чтобы быть более репрезентативным для физиологических характеристик кишечника. В этом протоколе для прохождения 3D-органоидов клетки полностью диссоциируют для подсчета, что позволяет контролировать количество клеток, засеянных в ECM. Это повышает воспроизводимость фенотипа органоидов, на что сильно влияет их плотность. Кроме того, подсчет клеток позволяет избежать получения слишком низкой или переполненной культуры, что требует адаптации графика культивирования. В большинстве других исследований были подготовлены фрагменты органоидов, не полностью диссоциированные на отдельные клетки, и использовался коэффициент разбавления для пассажа. Этот метод более прост, но может вызвать изменчивость в зависимости от плотности органоидов культуры.
Для культивирования в монослоях органоидные клетки засеваются в культуральные вставки, предварительно покрытые тонким слоем ECM, что позволяет прикреплять клетки, но позволяет избежать роста органоидов в 3D. В этом протоколе в качестве белка ECM использовался коллаген IV типа, как описано ранее у свиней23. В других исследованиях с монослоями органоидов свиньи использовался тот же ECM, полученный из опухоли, который использовался здесь для культивирования 3D-органоидов 6,8,9,21,25,30. Преимуществом использования коллагена является возможность стандартизировать концентрацию белка с полностью определенным составом, чего нет в ECM, полученном из опухоли. Критическим шагом для успеха культуры клеточных монослоев является обращение внимания на внешний вид 3D-органоидов-предшественников, которые должны иметь четко очерченные края и пустой просвет без черного мусора. Действительно, органоиды с высоким уровнем созревания и низкой скоростью пролиферации не являются подходящим источником клеток для 2D-культивирования. Таким образом, время диссоциации 3D-органоидов на отдельные клетки имеет решающее значение для успеха этого шага.
Культивирование 2D-монослоев из одиночных клеток позволяет стандартизировать количество высеваемых клеток, что сложнее при отталкивании от органоидных фрагментов, как это делается в некоторых других методах. Мы посеяли 7,6 х 10,5 клеток на см 2 , что является высоким показателем по сравнению с большинством других исследований 21,22,23 у свиней, которые использовали более низкую плотность клеток, в диапазоне от 0,25 х 10,5 клеток на см 2 до 1,78 х 10 клеток на см 2 . Требование большого количества органоидных клеток является ограничением этого протокола, но это позволило нам быстро получить сливающийся монослой, полностью покрывающий культуральную вставку через 1 день. Напротив, Vermeire et al.23 получили слияние через 4-7 дней с более низкой плотностью посеянных клеток (от 0,25 x 10,5 клеток/см2 до 0,4 x10,5 клеток/см2). В некоторых исследованиях также использовались монослои органоидных клеток свиньи, которые не полностью покрывали поверхность культуры для инфекций вирусами 8,30. В этих условиях апикальная сторона эпителиальных клеток доступна для лечения, но для изучения абсорбции питательных веществ или проницаемости эпителия требуются полностью сливающиеся монослои.
Для монослоев органоидных клеток использовали коммерческую среду для культивирования органоидов, дополненную 20% FBS, на основе недавнего исследования монослоев крупного рогатого скота, полученных из энтероидов32. В наших тестах добавка с 20% FBS была необходима для получения полностью сливающихся монослоев, вероятно, из-за высокой потребности в факторе роста. Напротив, другие исследования с использованием той же коммерческой среды установили монослои без дополнительных FBS 8,25,30, но без достижения полного слияния. В других исследованиях также использовались добавки с 20% FBS в специализированной среде для культивирования монослоев органоидных клеток свиньи21,22. В наших экспериментах TEER высокий через 1 день после посева (около 700 Ω · см 2 ) и остается высоким до 3 дня (около 1 500 Ω · см2; это согласуется с образованием плотных соединений, на что указывает экспрессия окклюдина. Van der Hee et al. получили аналогичные значения TEER в течение 72 ч для монослоев органоидных клеток тощей кишки21. Они также продемонстрировали, что монослои могут сохраняться до 12-15 дня с ежедневной сменой среды. Напротив, в других исследованиях сообщалось о гораздо более низких значениях TEER (около 200 Ω·см2) для монослоев органоидных клеток свиньи 6,22. Эти различия между исследованиями могут быть связаны с изучаемым сегментом кишечника или с используемыми средами, которые влияют на дифференцировку эпителия.
В заключение, приведенный выше протокол выращивания 3D-органоидов кишечника свиньи из замороженных эпителиальных крипт облегчает организацию работы по выращиванию. Это снижает потребность в свежих тканях, которые можно получить от живых животных. Мы также объясняем, как создать полностью сливающиеся клеточные монослои, полученные из органоидов свиньи, менее чем за 3 дня. Таким образом, наши протоколы могут быть полезными ресурсами для ученых, изучающих эпителий кишечника свиньи для ветеринарных или биомедицинских исследований.

Кишечный эпителий образован монослоем клеток, покрывающих слизистую оболочку пищеварительного тракта на границе с просветной средой. Эта позиция связана с различными функциями, такими как поглощение питательных веществ и барьерная функция, которые поддерживаются присутствием стволовых клеток и нескольких дифференцированных типов эпителиальных клеток (абсорбционные, энтероэндокринные, панетские и бокаловидные клетки)1. Иммортализированные клеточные линии, традиционно используемые для изучения эпителиальных клеток, имеют серьезные ограничения, поскольку они не отражают клеточную сложность кишечного эпителия и представляют геномные аномалии2. Разработка трехмерных (3D) органоидов Sato et al.3 предоставила новую модель для изучения кишечного эпителия с улучшенной физиологической значимостью. Действительно, кишечные органоиды получены из нетрансформированных стволовых клеток, состоят из нескольких типов клеток и повторяют функциональность кишечного эпителия. Кишечные органоиды все чаще используются для понимания развития и функций кишечного эпителия и его взаимодействия с патогенами, питательными веществами, токсинами, лекарствами, микробиотой и ее метаболитами2.
Первоначально разработанные для людей и мышей, методы, используемые для культивирования кишечных органоидов, недавно были адаптированы к другим видам, включая свиней4. Gonzales et al.5 были первыми, кто культивировал органоиды свиньи из тощей кишки; С тех пор органоиды свиньи были описаны для других сегментов кишечника (двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и толстой кишки)6,7,8, и было показано, что они сохраняют специфический для местоположения фенотип 9,10,11. 3D-органоиды кишечника свиньи в настоящее время широко используются для изучения влияния питательных веществ 12,13 или кишечных инфекций 6,8,14.
В большинстве исследований описана культура кишечных органоидов, начиная со свежевыделенных эпителиальных крипт. Однако это не всегда возможно по логистическим причинам, особенно при работе с крупными животными, такими как свиньи. Действительно, животноводческие помещения для свиней могут располагаться далеко от лаборатории, где культивируются органоиды, что усложняет организацию работы. Кроме того, культивирование органоидов отнимает много времени; Таким образом, нецелесообразно одновременно выращивать несколько органоидных линий, например, из разных сегментов кишечника или нескольких животных. Чтобы обойти эти проблемы, в нескольких исследованиях на людях, лошадях и свиньях были описаны методы культивирования органоидов из замороженных тканей кишечника (или биопсий) или из изолированных эпителиальных крипт 4,15,16,17. Эти методы позволяют криоконсервировать эпителиальные стволовые клетки кишечника из нескольких сегментов кишечника одного животного, которые затем могут быть использованы для выращивания органоидов при необходимости. Более того, это позволяет сильно сократить количество живых животных, используемых в качестве доноров стволовых клеток, поскольку могут быть созданы большие запасы криоконсервированных крипт (принципы 3R). Еще одним преимуществом этого метода является выращивание кишечных органоидов только у интересующих животных после получения фенотипических или генотипических результатов, что является высокорентабельным.
In vivo эпителиальные клетки кишечника поляризованы, апикальная сторона направлена к просвету. In vitro в 3D-органоидах апикальная сторона эпителиальных клеток также обращена к просвету (т.е. внутри органоидов)4. Эта организация предотвращает доступ к апикальной стороне, что является проблемой при изучении воздействия компонентов просвета (например, питательных веществ, микробов, метаболитов) на эпителиальные клетки. Чтобы обойти этот недостаток, было разработано несколько методов, таких как культивирование органоидных клеток в виде 2D-монослоев, микроинъекция и смена полярности («апикальные органоиды»)18,19. Культура монослоев органоидных клеток становится наиболее эффективной и управляемой системой. Принцип состоит в том, чтобы диссоциировать 3D-органоиды на отдельные клетки и помещать их в сосуд для клеточной культуры, предварительно покрытый тонким слоем внеклеточного матрикса (ECM)20. В этих условиях культивирования апикальная сторона эпителиальных клеток обращена вверх и, таким образом, доступна для экспериментальных методов лечения20. Культура монослоев органоидных клеток была недавно адаптирована для кишечника свиньи21,22; клеточные монослои, полученные из 3D-органоидов свиньи, использовались для различных применений, включая изучение кишечных инфекций 6,23,24,25, транспорта питательных веществ9 и моделирования заболеваний пищеварительной системы 26.
Здесь в этом исследовании впервые представлен подробный протокол культивирования и поддержания 3D-органоидов кишечника свиньи, полученных из криоконсервированных эпителиальных крипт (рис. 1). Затем описывается протокол для создания клеточных монослоев из 3D-органоидов кишечника свиньи. Описанные здесь методы предоставляют экспериментальные инструменты, которые могут быть использованы для изучения кишечного эпителия свиньи на предмет транспорта питательных веществ, барьерной функции и взаимодействия хозяина и микроорганизма.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Кишечные органоиды все чаще используются для изучения эпителия кишечника для моделирования заболеваний пищеварительной системы или для исследования взаимодействия с лекарствами, питательными веществами, метаболитами, патогенами и микробиотой. Методы культивирования кишечных органоидов в настоящее время доступны для нескольких видов, включая свиней, которые представляют большой интерес как для сельскохозяйственных животных, так и в качестве трансляционной модели для людей, например, для изучения зоонозных заболеваний. Здесь мы даем подробное описание процедуры, используемой для культивирования 3D-органоидов кишечника свиньи из замороженных эпителиальных крипт. В протоколе описывается, как криоконсервировать эпителиальные крипты из кишечника свиньи и последующие процедуры культивирования 3D-органоидов кишечника. Основными преимуществами этого метода являются: (i) временная диссоциация выделения крипт из культуры 3D-органоидов, (ii) получение больших запасов криоконсервированных крипт, полученных из нескольких сегментов кишечника и сразу от нескольких животных, и, таким образом, (iii) снижение потребности в отборе проб свежих тканей у живых животных. Мы также подробно описываем протокол создания клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов, чтобы обеспечить доступ к апикальной стороне эпителиальных клеток, которая является местом взаимодействия с питательными веществами, микробами или лекарствами. В целом, описанные здесь протоколы являются полезным ресурсом для изучения эпителия кишечника свиньи в ветеринарных и биомедицинских исследованиях.

В соответствии с протоколом, описанным выше, эпителиальные крипты получают из кишечника свиньи и криоконсервируют для длительного хранения в жидком азоте (рис. 1 и рис. 2А). После размораживания криптовые стволовые клетки высеваются в ECM (рис. 2B). Структура крипты обычно теряется после этого шага из-за распада структуры крипты в ECM. Органоиды можно наблюдать в течение 3-4 дней, а затем быстро растут и развивают почку (рис. 2Б). Мы успешно получили органоиды после размораживания замороженных крипт в >80% попыток. Примерно через 10 дней после оттаивания (по скорости роста органоидов) выполняется пассаж органоидов для расширения культуры (рис. 3). Органоиды растут быстрее после расщепления, и они имеют разнообразную морфологию, с некоторыми кистозными и большинством отпочковывающихся органоидов. Для оптимального поддержания культуры органоиды, используемые для пассажирования, должны иметь четкий и пустой просвет и четко очерченные края (примеры, обозначенные зелеными стрелками) без черного мусора в просвете (обозначены красными стрелками), как это наблюдается у зрелых органоидов (рис. 3). Мы обнаружили, что обломки черных клеток начинают накапливаться примерно на 6-й день после прохождения. Таким образом, рекомендуется расщепление или замораживание органоидов на 4-5 день после пассажа.
Стадия зрелости органоидов также является важным моментом в получении клеточных монослоев. Органоиды с развитой зрелостью (на что указывает наличие черноклеточного мусора в просвете) не оптимальны для засева монослоев. Обычно мы диссоциируем 3D-органоиды через 4 дня после прохождения, чтобы собрать клетки для 2D-культуры. Приблизительно от одной до трех лунок 3D-органоидов, культивируемых при 3000 клетках на купол ECM 50 мкл, необходимы для посева одной культуральной вставки с ячейками 2,5 x 105. Клетки прикрепляются и образуют полностью сливающийся монослой в течение 1 дня (рис. 4A), что подтверждается высоким TEER около 700 Ω·cm2 (рис. 4B). Тем не менее, края клеток трудно визуализировать с помощью светлопольной микроскопии в этот ранний момент времени, вероятно, из-за низкого уровня дифференцировки. TEER остается высоким в течение 3 дней (рис. 4B).
Окрашивание актина указывает на то, что апикальная сторона эпителиальных клеток ориентирована на просвет в 3D-органоидах (рис. 5А). Органоидные клетки, посеянные в культуральную вставку, образуют сливающийся единый слой эпителиальных клеток с апикальной стороной, ориентированной к верхнему компартменту (рис. 4B, C). Окрашивание окклюдином выявляет наличие плотных соединений на апикальной стороне эпителиальных клеток в 3D-органоидах и в клеточных монослоях (рис. 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое изображение методов, используемых для культивирования 3D-органоидов и клеточных монослоев, полученных из органоидов. Эпителиальные крипты выделяют из кишечника поросенка. Эти крипты могут i) быть немедленно использованы для культивирования 3D-органоидов или ii) быть заморожены и храниться в биобанке в жидком азоте. Криоконсервированные крипты можно размораживать и использовать для культивирования 3D-органоидов. Культуру органоидов 3D можно поддерживать с помощью последовательного расщепления или замораживать и хранить в биобанке. Клеточные монослои могут быть получены из 3D-органоидной культуры, чтобы обеспечить доступ к апикальной стороне клеток и изучить функцию эпителиального барьера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Рисунок 2: Культура 3D-органоидов кишечника свиньи из криоконсервированных эпителиальных крипт. (A) Репрезентативное микроскопическое изображение свежеизолированных крипт тощей кишки. (B) Репрезентативные микроскопические изображения 3D-органоидов, полученных после оттаивания крипт тощей кишки. Органоиды культивировали в куполе ECM объемом 25 мкл в 48-луночном планшете. На рисунке показаны изображения 3D-органоидов через 4, 7, 8, 9 и 10 дней после посева. Масштабная линейка представляет 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Рисунок 3: Морфология 3D-органоидов кишечника свиньи, полученных из криоконсервированных эпителиальных крипт после первого прохождения. Репрезентативные микроскопические изображения, показывающие развитие органоидов, полученных из криоконсервированных крипт тощей кишки после первого прохождения с 4-го по 7-й день. Зелеными стрелками обозначены четкие органоиды, подходящие для прохождения или засева монослоев. Красными стрелками обозначены зрелые органоиды, не пригодные для расщепления или посева монослоев; Таким образом, колодцы следует использовать до появления этой морфологии. Масштабная линейка представляет 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Рисунок 4: Характеристики клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов кишечника свиньи . (A) Репрезентативные микроскопические изображения морфологии монослоя в течение 3 дней. Органоидные клетки тощей кишки засевали в 2,5 х 105 клеток в 0,33 см2 клеточных культуральных вставки, покрытых коллагеном IV в дозе 50 нг/мл. Шкала представляет собой 500 мкм. (B) Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) монослоев органоидных клеток в течение 3 дней. Точки, соединенные линией, соответствуют одному и тому же колодцу в разное время. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Рисунок 5: Визуализация органоидов тощей кишки свиньи, культивируемых в 3D или 2D. Конфокальная микроскопия (A) 3D-органоидов через 5 дней после расщепления и монослоев органоидных клеток (B, C) через 3 дня после посева (B: XZ; C: XY раздел). ДНК (синий) окрашивали DAPI. Актин (красный) окрашивали фаллоидином. Окклюдин (зеленый) окрашивали поликлональным антителом. Белыми стрелками обозначена окклюдин, локализованный в месте плотного соединения. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Здесь мы описываем протокол культивирования 3D-органоидов кишечника свиньи из криоконсервированных эпителиальных крипт. Мы также описываем метод создания клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов, позволяющих получить доступ к апикальной стороне эпителиальных клеток.

Культура 3D-органоидов кишечника поросенка из криоконсервированных эпителиальных крипт и создание клеточных монослоев

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Наш протокол предоставляет инструменты для изучения эпителия кишечника свиньи для ветеринарных и биомедицинских исследований. Кишечные органоиды свиней могут быть использованы для изучения транспорта питательных веществ, барьерной функции и взаимодействия хозяина и микроба. Благодаря консервации эпителиальных крипт кишечника свиньи можно создать большой запас стволовых клеток, которые в дальнейшем могут быть использованы для культивирования органоидов в 3D или 2D монослоях.Этот протокол подробно описан для тощей кишки, но его также можно использовать для других сегментов кишечника, таких как двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка и толстая кишка. Для начала быстро разморозьте флакон, содержащий 900 замороженных крипт, на водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию. Перелейте раствор крипты в коническую трубку объемом 15 миллилитров.Центрифугу при 300 х г в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 150 микролитров внеклеточного матрикса или ECM с охлажденным наконечником для получения конечной концентрации 150 крипт на 25 микролитров ECM. Пипетка вверх и вниз 10 раз для получения однородной суспензии крипт в ECM.Засейте шесть лунок каплей 25 микролитров на лунку в предварительно разогретую тарелку на 48 лунок. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа для полимеризации ECM. Добавляют 250 микролитров на лунку культуры среды комнатной температуры и выдерживают при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Меняйте питательную среду каждые два-три дня. Для прохождения 3D-органоидов, полученных из замороженных крипт, через 10 дней после посева удалите питательную среду и добавьте 250 микролитров предварительно разогретого PBS при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации замените PBS 250 микролитрами предварительно подогретого реагента для диссоциации ферментов, дополненного 10 микромолярным ингибитором породы при 37 градусах Цельсия в каждой лунке.Отделите органоиды в ECM, соскабливая пипеткой P-1000, и осторожно гомогенизируйте, пипетируя пять раз. Инкубируйте в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, прежде чем диссоциировать клетки, пипеткой вверх и вниз 10 раз. Добавьте 500 микролитров DMEMc в каждую лунку, содержащую диссоциированные ячейки, и вытащите до 12 лунок в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую три миллилитра холодного DMEMc.Центрифуга при 500 x g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре холодного DMEMc. Посчитайте ячейки с разведением от одного до двух в трипановом синем с помощью счетчика клеток.Центрифугируйте необходимый объем клеточного раствора, чтобы иметь 3000 живых клеток на купол. Ресуспендируйте гранулу с 17 микролитрами холодного DMEMc на 3000 живых клеток на льду. Отрегулируйте объем до необходимого количества скважин.Медленно добавьте 33 микролитра холодного ECM на 3000 живых клеток. Отрегулируйте объем до необходимого количества лунок и гомогенизируйте, не образуя пузырьков. Затем увидеть лунки с 50 микролитрами суспензии ячейки ECM на лунку в предварительно разогретой 24-луночной пластине и инкубировать в течение 30 минут для полимеризации ECM.Добавьте 500 микролитров питательной среды на лунку. Затем инкубируют и меняют питательную среду каждые два-три дня. Чтобы покрыть культуральную вставку, приготовьте раствор для покрытия, содержащий коллаген IV, разбавленный до 50 мкг на миллилитр в холодном PBS.Добавьте 150 микролитров разбавленного раствора покрытия в каждую вставку для клеточной культуры и инкубируйте в течение ночи или в течение трех часов. Через пять дней после расщепления отделите органоиды с помощью ECM, соскоблив их пипеткой P-1000. Тщательно гомогенизируют пипеткой в питательной среде и переносят в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров холодного DMEMc на льду.Центрифугируйте собранные органоиды при 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре предварительно подогретого ферментного реагента диссоциации с добавлением 10-микромолярного ингибитора ROCK. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы инициировать диссоциацию органоидов.Инкубируйте в течение пяти минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия для ферментативного пищеварения. Механически разрушают органоиды, пипетируя 10 раз и добавляя четыре миллилитра ледяного DMEMc. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость перед ресуспендированием гранулы органоидной клетки в одном миллилитре DMEMc.Подсчитайте ячейки в трипановом синем с помощью счетчика клеток и рассчитайте необходимый объем для посева 2,5 раза по 10 до пятых клеток на культурный вкладыш. Центрифугируют необходимый объем клеточной суспензии, соответствующий 2,5 раза 10 пятых клеток на культуральную вставку. Во время центрифугирования тщательно аспирируйте раствор покрытия из культуральных вкладышей и дайте ему высохнуть под колпаком без крышки в течение пяти минут.После центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу в необходимом объеме 2D-среды с добавлением 10-микромолярного ингибитора ROCK. Засейте 200 микролитров клеточной суспензии на проницаемую мембрану с покрытием. Добавьте 500 микролитров 2D-среды с добавлением 10-микромолярного ингибитора ROCK в нижний компартмент и инкубируйте.На мембране должна наблюдаться высокая плотность клеток. Через день после посева замените эпическую и базальную среду свежей 2D-средой без ингибитора ROCK. Меняйте носители каждый день.Монослой сливается через сутки после посева и может быть использован для его экспериментов. В этом исследовании эпителиальные крипты были получены из кишечника свиньи и криоконсервированы для длительного хранения в жидком азоте. После размораживания криптовые стволовые клетки были посеяны в ECM.Органоиды наблюдались в течение трех-четырех дней и быстро росли и развивали почку. Примерно через 10 дней после оттаивания проводили пассаж органоидов для расширения культуры. Для оптимального поддержания культуры органоиды, используемые для упаковки, должны иметь четкий и пустой просвет и четко очерченные края без черного мусора в просвете, как это наблюдается у зрелых органоидов.Клетки прикрепляются и образуют полностью сливающийся монослой в течение одного дня, что подтверждается высоким трансэпителиальным электрическим сопротивлением, или TEER, около 700 куполов квадратных сантиметров. TEER остается высоким в течение трех дней. Окрашивание актина указывает на то, что апикальная сторона эпителиальных клеток ориентирована на просвет в 3D-органоидах.Органоидные клетки, посеянные в культуральные вставки, образуют сливающийся единый слой эпителиальных клеток с апикальной стороной, ориентированной к верхнему компартменту. Окрашивание окклюдином выявляет наличие плотных соединений на апикальной стороне эпителиальных клеток в 3D-органоидах и в клеточных монослоях. Важно помнить, что органоид, используемый для засева монослоев клеток, должен казаться прозрачным с пустым просветом без черного мусора, соответствующего скоплению мертвых клеток.Монослои из органоида кишечника свиньи могут быть использованы для проверки влияния метаболитов или микробов на функцию эпителиального барьера с помощью функциональных анализов, визуализации и анализа экспрессии генов.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Мукоцилиальные эпителиальные органоиды из эмбриональных клеток Ксенопы: Поколение, Культура и живая визуализация высокого разрешения

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Генерация мышиных первичных эпителиальных монослоев толстой кишки из кишечных крипт

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Создание и генетическое манипулирование органоидами мышиных гепатоцитов

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Создание 3D-органоидов эндометрия из мышиной матки

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-культивирование органоидов из крипт кишечника мышей и одной стволовой клетки для исследования органоидов

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...