Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Este trabajo contó con el apoyo del Institut Carnot France Futur Elevage (proyecto "OrganoPig") y del INRAE HOLOFLUX (proyecto "Holopig"). Los autores están agradecidos a las instalaciones centrales de Genotoul (TRI). Agradecemos a Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) por su cuidadosa revisión.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método utilizado para criopreservar criptas epiteliales del intestino del lechón para el almacenamiento a largo plazo y el posterior cultivo de organoides 3D. Este protocolo utiliza una solución de congelación que contiene DMSO, FBS, el inhibidor de ROCK Y27632, DMEM y antibióticos. Otro estudio en cerdos obtuvo organoides de criptas criopreservadas en una solución de congelación similar pero sin el inhibidor ROCK15. El inhibidor ROCK Y27632 fue incluido para prevenir la apoptosis y mantener el conjunto de células madre ya que, después de la descongelación, las células de la cripta epitelial se disocian, lo que puede conducir a la muerte celular ('anoikis')27,28. Curiosamente, los enteroides equinos se han obtenido de criptas epiteliales congeladas en un medio de cultivo que contiene solo DMEM y DMSO16; Este método simple aún no ha sido probado para criptas epiteliales de cerdo. Se han publicado otros métodos para cultivar organoides humanos y porcinos a partir de tejidos congelados o biopsias en lugar de criptas epiteliales 4,17. La ventaja de este método es la capacidad de criopreservar directamente los tejidos intestinales sin realizar el procedimiento de aislamiento de cripta, que requiere tiempo y equipo de laboratorio. Esto puede ser conveniente cuando los tejidos tienen que ser recolectados lejos del laboratorio. Sin embargo, al aislar las criptas inmediatamente después del sacrificio, se pueden procesar grandes segmentos del intestino para obtener un número muy alto de criptas, lo que no es el caso cuando se parte de pequeños fragmentos de tejido congelado. Después de la descongelación de las criptas epiteliales, se observaron organoides de 3 a 4 días después de la siembra y se dividieron después de 10 días. Esta es una tasa de crecimiento más lenta que cuando se inicia el cultivo a partir de criptas epiteliales frescas, para las cuales los organoides se obtuvieron desde el día 1 después de la siembra, y generalmente se pueden dividir alrededor del día 511. Khalil et al. también informaron un retraso en el crecimiento de enteroides porcinos al partir de criptas congeladas15, lo que sugiere que las células madre podrían requerir tiempo para recuperar su capacidad proliferativa. También obtuvimos un menor número de organoides al partir de criptas congeladas en comparación con criptas frescas, lo que podría deberse a la muerte de células madre durante el proceso de congelación. En algunos intentos de descongelación de criptas (<20%), no obtuvimos organoides de criptas congeladas, probablemente debido a un procedimiento de criopreservación subóptimo (por ejemplo, congelación retrasada después del aislamiento de criptas de probablemente más de 1 h). Por lo tanto, recomendamos mantener las criptas en hielo hasta que se cuenten, y congelarlas lo más rápido posible.
Para los organoides 3D, elegimos utilizar un medio de cultivo de organoides comercial formulado para humanos. De hecho, informes anteriores han demostrado que los organoides intestinales de cerdo crecen eficientemente con este medio 8,11,14,19,25,26,29,30. Es de interés que este medio de cultivo esté listo para usar y tenga una concentración estandarizada de factores de crecimiento dentro de un lote. Sin embargo, este medio de cultivo es costoso, su composición no se revela y, por lo tanto, no es posible modular su composición. En contraste, otros estudios han cultivado organoides intestinales de cerdo en medios personalizados que contienen inhibidores farmacológicos, factor de crecimiento recombinante y/o medios acondicionados 5,6,7,21. Aunque es altamente flexible y más barato, este método requiere mucho tiempo para la producción de medios acondicionados y puede carecer de reproducibilidad debido a la posible variabilidad en la concentración de factores de crecimiento en medios acondicionados. Por lo tanto, la calidad de cada lote de medios acondicionados debe validarse midiendo el crecimiento de organoides o la expresión génica marcador31.
Un estudio ha demostrado que los organoides yeyunales de cerdo cultivados en el mismo medio de cultivo de organoides comercial utilizado aquí crecieron más rápido y parecían menos diferenciados, en comparación con los enteroides cultivados con medios que contienen factor de crecimiento recombinante y / o medios condicionados23. Un alto estado proliferativo facilita el cultivo de organoides 3D, pero podría requerir una diferenciación inductora para ser más representativa de las características fisiológicas intestinales. En este protocolo, para el paso de organoides 3D, las células se disocian completamente para el conteo, lo que permite controlar el número de células sembradas en ECM. Esto aumenta la reproducibilidad del fenotipo de los organoides, que está muy influenciado por su densidad. Además, el conteo de las células evita obtener un cultivo demasiado bajo o saturado, que requiere adaptar el programa de cultivo. La mayoría de los otros estudios prepararon fragmentos de organoides no completamente disociados a células individuales, y utilizaron una relación de dilución para el paso. Este método es más sencillo, pero podría inducir variabilidad según la densidad organoide del cultivo.
Para el cultivo en monocapas, las células organoides se siembran en insertos de cultivo prerecubiertos con una capa delgada de ECM, que permite la unión de células pero evita el crecimiento de organoides en 3D. Este protocolo utilizó colágeno tipo IV como proteína ECM, como se describió previamente en cerdos23. Otros estudios con monocapas organoides de cerdo utilizaron la misma ECM derivada de tumores utilizada aquí para cultivar organoides 3D 6,8,9,21,25,30. La ventaja de usar colágeno es la capacidad de estandarizar la concentración de proteínas con una composición completamente definida, lo que no es el caso en la ECM derivada del tumor. Un paso crítico para el éxito del cultivo de monocapas celulares es prestar atención a la apariencia visual de los organoides 3D precursores, que deben tener bordes bien definidos y una luz vacía sin restos negros. De hecho, los organoides con un alto nivel de maduración y una baja tasa proliferativa no son una fuente apropiada de células para el cultivo 2D. Por lo tanto, el momento de la disociación de los organoides 3D en células individuales es crucial para el éxito de este paso.
El cultivo de monocapas 2D a partir de células individuales permite estandarizar el número de células sembradas, lo cual es más difícil cuando se parte de fragmentos de organoides, como se realiza en algunos otros métodos. Sembramos 7.6 x 10 5 células por cm 2, lo cual es alto en comparación con la mayoría de los otros estudios 21,22,23 en cerdos que utilizaron una densidad celular más baja, que varió de 0.25 x 10 5 células por cm 2 a 1.78 x 10 5 células por cm 2. El requerimiento de un alto número de células organoides constituye una limitación de este protocolo, pero nos permitió obtener rápidamente una monocapa confluente, cubriendo completamente el inserto de cultivo después de 1 día. En contraste, Vermeire et al.23 obtuvieron confluencia después de 4-7 días con una menor densidad de células sembradas (de 0,25 x 105 células/cm 2 a 0,4 x 105 células/cm2). Algunos estudios también han utilizado monocapas de células organoides de cerdo que no cubrieron completamente la superficie de cultivo para infecciones con virus 8,30. En estas condiciones, el lado apical de las células epiteliales es accesible para los tratamientos, pero se requieren monocapas totalmente confluentes si el objetivo es estudiar la absorción de nutrientes o la permeabilidad epitelial.
Para las monocapas de células organoides, se utilizó un medio de cultivo de organoides comercial suplementado con 20% de FBS, basado en un estudio reciente sobre monocapas derivadas de enteroides bovinos32. En nuestras pruebas, la suplementación con FBS al 20% fue necesaria para obtener monocapas totalmente confluentes, probablemente debido a un alto requerimiento de factor de crecimiento. Por el contrario, otros estudios que utilizan el mismo medio comercial han establecido monocapas sin FBS adicionales 8,25,30, pero sin llegar a la confluencia completa. Otros estudios también han utilizado la suplementación con 20% de FBS en un medio personalizado para el cultivo de monocapas de células organoides de cerdo21,22. En nuestros experimentos, TEER es alto 1 día después de la siembra (alrededor de 700 Ω·cm 2), y permanece alto hasta el día 3 (alrededor de 1,500 Ω·cm2; esto es consistente con la formación de uniones estrechas, como lo indica la expresión de ocludina. Van der Hee et al. obtuvieron valores TEER similares a lo largo de 72 h para monocapas de células organoides yeyunum21. También demostraron que las monocapas se pueden mantener hasta el día 12-15 con cambios diarios de medios. En contraste, otros estudios han reportado valores de TEER mucho más bajos (alrededor de 200 Ω·cm2) para monocapas de células organoides de cerdo 6,22. Estas diferencias entre los estudios podrían estar relacionadas con el segmento intestinal estudiado o con los medios utilizados que influyen en la diferenciación epitelial.
En conclusión, el protocolo anterior para cultivar organoides 3D intestinales de cerdo a partir de criptas epiteliales congeladas facilita la organización del trabajo de cultivo. Reduce la necesidad de obtener tejidos frescos de animales vivos. También explicamos cómo establecer monocapas celulares totalmente confluentes derivadas de organoides porcinos en menos de 3 días. Por lo tanto, nuestros protocolos podrían ser recursos útiles para los científicos que estudian el epitelio intestinal del cerdo para la investigación veterinaria o biomédica.

El epitelio intestinal está formado por una monocapa de células que cubren la mucosa digestiva en la interfaz con el ambiente luminal. Esta posición está asociada a diversas funciones, como la absorción de nutrientes y la función barrera, que son apoyadas por la presencia de células madre y múltiples tipos de células epiteliales diferenciadas (absorción, enteroendocrina, Paneth y células caliciformes)1. Las líneas celulares inmortalizadas utilizadas tradicionalmente para estudiar las células epiteliales tienen grandes limitaciones, ya que no reflejan la complejidad celular del epitelio intestinal y presentan anomalías genómicas2. El desarrollo de organoides tridimensionales (3D) por Sato et al.3 proporcionó un nuevo modelo para estudiar el epitelio intestinal con una mayor relevancia fisiológica. De hecho, los organoides intestinales se derivan de células madre no transformadas, están compuestos de múltiples tipos de células y recapitulan la funcionalidad del epitelio intestinal. Los organoides intestinales se utilizan cada vez más para comprender el desarrollo y las funciones del epitelio intestinal y sus interacciones con patógenos, nutrientes, toxinas, medicamentos, la microbiota y sus metabolitos2.
Inicialmente desarrollados para humanos y ratones, los métodos utilizados para cultivar organoides intestinales se han adaptado recientemente a otras especies, incluidos los cerdos4. Gonzales et al.5 fueron los primeros en cultivar organoides porcinos del yeyuno; Desde entonces, se han descrito organoides porcinos para otros segmentos intestinales (duodeno, íleon y colon)6,7,8, y se ha demostrado que conservan un fenotipo específico de la ubicación9,10,11. Los organoides 3D intestinales de cerdo ahora se usan comúnmente para estudiar el efecto de los nutrientes 12,13 o las infecciones entéricas 6,8,14.
La mayoría de los estudios han descrito el cultivo de organoides intestinales a partir de criptas epiteliales recién aisladas. Sin embargo, esto no siempre es factible por razones logísticas, especialmente cuando se trabaja con animales grandes como los cerdos. De hecho, las instalaciones para animales para cerdos pueden ubicarse lejos del laboratorio donde se cultivan los organoides, lo que complica la organización del trabajo. Además, el cultivo de organoides requiere mucho tiempo; Por lo tanto, no es práctico cultivar simultáneamente múltiples líneas de organoides, por ejemplo, de diferentes segmentos intestinales o varios animales. Para eludir estos problemas, algunos estudios en humanos, caballos y cerdos han descrito métodos para cultivar organoides a partir de tejidos intestinales congelados (o biopsias) o de criptas epiteliales aisladas 4,15,16,17. Estos métodos permiten la criopreservación de células madre epiteliales intestinales de múltiples segmentos intestinales de un solo animal, que luego se pueden usar para cultivar organoides cuando sea necesario. Además, esto permite una fuerte reducción en el número de animales vivos utilizados como donantes de células madre, ya que se pueden crear grandes reservas de criptas criopreservadas (principios de 3R). Otra ventaja de este método es el crecimiento de organoides intestinales solo de animales de interés después de obtener resultados fenotípicos o genotípicos, lo cual es altamente rentable.
In vivo, las células epiteliales intestinales están polarizadas, con el lado apical dirigido hacia la luz. In vitro, en organoides 3D, el lado apical de las células epiteliales también está orientado hacia el lumen (es decir, dentro de los organoides)4. Esta organización impide el acceso al lado apical, que es un problema cuando se estudian los efectos de los componentes luminales (por ejemplo, nutrientes, microbios, metabolitos) en las células epiteliales. Para sortear esta desventaja, se han desarrollado varios métodos, como el cultivo de células organoides como monocapas 2D, la microinyección y la inversión de polaridad ("organoides apicales")18,19. El cultivo de monocapas de células organoides está emergiendo como el sistema más eficiente y manejable. El principio es disociar organoides 3D en células individuales y sembrarlas en un recipiente de cultivo celular previamente recubierto con una capa delgada de matriz extracelular (ECM)20. En estas condiciones de cultivo, el lado apical de las células epiteliales está orientado hacia arriba, por lo que es accesible a los tratamientos experimentales20. El cultivo de monocapas de células organoides fue recientemente adaptado para el intestino porcino21,22; Las monocapas celulares derivadas de organoides 3D de cerdo se han utilizado para múltiples aplicaciones, incluyendo el estudio de infecciones entéricas 6,23,24,25, el transporte de nutrientes 9 y el modelado de enfermedades digestivas 26.
Aquí, este estudio presenta primero un protocolo detallado para el cultivo y mantenimiento de organoides 3D intestinales de cerdo derivados de criptas epiteliales criopreservadas (Figura 1). Luego, se describe un protocolo para establecer monocapas celulares a partir de organoides 3D intestinales de cerdo. Los métodos descritos aquí proporcionan herramientas experimentales que se pueden utilizar para estudiar el epitelio intestinal del cerdo para el transporte de nutrientes, la función de barrera y las interacciones huésped-microorganismo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Los organoides intestinales se utilizan cada vez más para estudiar el epitelio intestinal para el modelado de enfermedades digestivas, o para investigar interacciones con medicamentos, nutrientes, metabolitos, patógenos y la microbiota. Los métodos para cultivar organoides intestinales ahora están disponibles para múltiples especies, incluidos los cerdos, que es una especie de gran interés tanto como animal de granja como modelo traslacional para humanos, por ejemplo, para estudiar enfermedades zoonóticas. Aquí, damos una descripción en profundidad de un procedimiento utilizado para cultivar organoides 3D intestinales de cerdo a partir de criptas epiteliales congeladas. El protocolo describe cómo criopreservar criptas epiteliales del intestino de cerdo y los procedimientos posteriores para cultivar organoides intestinales 3D. Las principales ventajas de este método son (i) la disociación temporal del aislamiento de criptas del cultivo de organoides 3D, (ii) la preparación de grandes existencias de criptas criopreservadas derivadas de múltiples segmentos intestinales y de varios animales a la vez, y por lo tanto (iii) la reducción de la necesidad de tomar muestras de tejidos frescos de animales vivos. También detallamos un protocolo para establecer monocapas celulares derivadas de organoides 3D para permitir el acceso al lado apical de las células epiteliales, que es el sitio de interacciones con nutrientes, microbios o medicamentos. En general, los protocolos descritos aquí son un recurso útil para estudiar el epitelio intestinal del cerdo en la investigación veterinaria y biomédica.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, las criptas epiteliales se obtienen del intestino del cerdo y se criopreservan para su almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido (Figura 1 y Figura 2A). Después de la descongelación, las células madre de la cripta se siembran en la ECM (Figura 2B). La estructura de la cripta generalmente se pierde después de este paso, debido a la desintegración de la estructura de la cripta en el ECM. Los organoides se pueden observar en 3-4 días, y luego crecen rápidamente y desarrollan estructuras en gemación (Figura 2B). Obtuvimos con éxito organoides después de descongelar criptas congeladas en el >80% de los intentos. Aproximadamente 10 días después de la descongelación (según la tasa de crecimiento de los organoides), se realiza un paso de organoides para expandir el cultivo (Figura 3). Los organoides crecen más rápido después de la división, y presentan diversas morfologías, con algunos organoides quísticos y la mayoría de los que inciden. Para un mantenimiento óptimo del cultivo, los organoides utilizados para el paso deben presentar una luz clara y vacía y bordes bien definidos (ejemplos indicados por flechas verdes) sin restos negros en el lumen (indicados por flechas rojas), como se observa en organoides maduros (Figura 3). Encontramos que los restos de células negras comienzan a acumularse alrededor del día 6 después del fallecimiento. Por lo tanto, se recomienda dividir o congelar los organoides en el día 4-5 después del fallecimiento.
La etapa de madurez de los organoides también es un punto importante en la obtención de monocapas celulares. Los organoides con madurez avanzada (indicada por la presencia de restos de células negras en la luz) no son óptimos para sembrar monocapas. Por lo general, disociamos los organoides 3D 4 días después del paso para recolectar células para el cultivo 2D. Se necesitan aproximadamente de uno a tres pocillos de organoides 3D cultivados a 3.000 células por cúpula de 50 μL de la ECM para sembrar un inserto de cultivo con 2,5 x 105 células. Las células se unen y forman una monocapa totalmente confluente en 1 día (Figura 4A), lo que se confirma por el alto TEER de alrededor de 700 Ω · cm2 (Figura 4B). Sin embargo, los bordes celulares son difíciles de visualizar mediante microscopía de campo claro en este punto de tiempo temprano, probablemente debido a un bajo nivel de diferenciación. El TEER permanece alto durante 3 días (Figura 4B).
La tinción de actina indica que el lado apical de las células epiteliales está orientado hacia la luz en los organoides 3D (Figura 5A). Las células organoides sembradas en el inserto de cultivo forman una sola capa confluente de células epiteliales, con el lado apical orientado hacia el compartimiento superior (Figura 4B, C). La tinción de occludina revela la presencia de uniones estrechas en el lado apical de las células epiteliales en organoides 3D y en monocapas celulares (Figura 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de los métodos utilizados para cultivar organoides 3D y monocapas celulares derivadas de organoides. Las criptas epiteliales se aíslan del intestino del lechón. Estas criptas pueden i) ser utilizadas inmediatamente para cultivar organoides 3D o ii) ser congeladas y almacenadas en un biobanco en nitrógeno líquido. Las criptas criopreservadas se pueden descongelar y usar para cultivar organoides 3D. El cultivo de organoides 3D puede mantenerse con división sucesiva, o congelarse y almacenarse en el biobanco. Las monocapas celulares se pueden obtener del cultivo de organoides 3D para permitir el acceso al lado apical de las células y estudiar la función de barrera epitelial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figura 2: Cultivo de organoides 3D intestinales de cerdo a partir de criptas epiteliales criopreservadas. (A) Imagen microscópica representativa de criptas yeyunales recién aisladas. (B) Imágenes microscópicas representativas de organoides 3D obtenidas después del deshielo de las criptas yeyuales. Los organoides se cultivaron en una cúpula de 25 μL de ECM en una placa de 48 pocillos. La figura muestra imágenes de los organoides 3D a los 4, 7, 8, 9 y 10 días después de la siembra. La barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figura 3: Morfología de organoides 3D intestinales de cerdo derivados de criptas epiteliales criopreservadas después del primer paso. Imágenes microscópicas representativas que muestran el desarrollo de organoides derivados de criptas de yeyuno criopreservadas después del primer paso del día 4 al día 7. Las flechas verdes indican organoides claros apropiados para el paso o la siembra de monocapas. Las flechas rojas indican organoides maduros no adecuados para dividir o sembrar monocapas; Por lo tanto, los pocillos deben usarse antes de la aparición de esta morfología. La barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figura 4: Características de las monocapas celulares derivadas de organoides 3D intestinales de cerdo . (A) Imágenes microscópicas representativas de la morfología monocapa durante 3 días. Las células organoides de yeyuno se sembraron a 2,5 x 105 células en insertos de cultivo celular de 0,33 cm2 recubiertos con colágeno IV a 50 ng / ml. La barra de escala representa 500 μm. (B) Resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de monocapas de células organoides durante 3 días. Los puntos conectados por una línea corresponden al mismo pozo en diferentes momentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figura 5: Imágenes de organoides de yeyuno de cerdo cultivados en 3D o 2D. Imágenes de microscopía confocal de (A) organoides 3D 5 días después de la división y (B, C) monocapas de células organoides 3 días después de la siembra (B: sección XZ; C: sección XY). El ADN (azul) fue teñido con DAPI. La actina (rojo) se tiñó con faloidina. La occludina (verde) se tiñó con un anticuerpo policlonal. Las flechas blancas indican occludina localizada en la unión estrecha. La barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Aquí, describimos un protocolo para cultivar organoides 3D intestinales de cerdo a partir de criptas epiteliales criopreservadas. También describimos un método para establecer monocapas celulares derivadas de organoides 3D, permitiendo el acceso al lado apical de las células epiteliales.

Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Nuestro protocolo proporciona herramientas para estudiar el epitelio intestinal del cerdo para la investigación veterinaria y biomédica. Los organoides intestinales de los cerdos se pueden utilizar para estudiar el transporte de nutrientes, la función de barrera y las interacciones huésped-microbio. A través de la preservación de las criptas epiteliales intestinales del cerdo permiten crear un gran stock de células madre que luego se pueden utilizar para cultivar organoides en monocapas 3D o 2D.Este protocolo está detallado para el yeyuno, pero también se puede usar para otros segmentos intestinales como el duodeno, el íleon y el colon. Para comenzar, descongele rápidamente un frasco que contiene 900 criptas congeladas en un baño de agua a 37 grados centígrados. Transfiera la solución de cripta a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante. Añadir 150 microlitros de la matriz extracelular o ECM con una punta enfriada para obtener una concentración final de 150 criptas por cada 25 microlitros de ECM. Pipet arriba y abajo 10 veces para obtener una suspensión homogénea de criptas en el ECM.Siembre seis pocillos con una gota de 25 microlitros por pocillo en una placa de 48 pocillos precalentada. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para la polimerización de la ECM. Añadir un 250 microlitro por pocillo de cultivo de medio a temperatura ambiente e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Cambie el medio de cultivo cada dos o tres días. Para pasar organoides 3D derivados de criptas congeladas 10 días después de la siembra, retire los medios de cultivo y agregue 250 microlitros de PBS precalentado a 37 grados centígrados. Después de la incubación, reemplace el PBS con 250 microlitros de reactivo de disociación enzimática precalentado complementado con 10 inhibidores de roca micromolar a 37 grados centígrados en cada pocillo.Separar los organoides en el ECM raspando con una pipeta P-1000 y homogeneizar cuidadosamente pipeteando cinco veces. Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono antes de disociar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Agregue 500 microlitros de DMEMc en cada pocillo que contenga células disociadas y extraiga hasta 12 pocillos en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tres mililitros de DMEMc frío.Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de DMEMc frío. Cuente las células con una dilución de una a dos en azul de tripano con un contador de células.Centrifugar el volumen necesario de la solución celular para tener 3000 células vivas por domo. Resuspender el pellet con 17 microlitros de DMEMc frío por cada 3000 células vivas en hielo. Ajuste el volumen al número requerido de pozos.Agregue lentamente 33 microlitros de ECM fría por cada 3000 células vivas. Ajuste el volumen al número requerido de pocillos y homogeneice sin hacer burbujas. Luego vea los pocillos con 50 microlitros de la suspensión celular ECM por pozo en una placa precalentada de 24 pocillos e incube durante 30 minutos para la polimerización de la ECM.Añadir 500 microlitros del medio de cultivo por pocillo. Luego incubar y cambiar el medio de cultivo cada dos o tres días. Para recubrir el prospecto de cultivo, prepare la solución de recubrimiento que contiene colágeno IV diluido a 50 microgramos por mililitro en PBS frío.Agregue 150 microlitros de la solución de recubrimiento diluida a cada inserto de cultivo celular e incube durante la noche o durante tres horas. Cinco días después de la división, separe los organoides con el ECM raspándolos con una pipeta P-1000. Homogeneizar cuidadosamente mediante pipeteo en el medio de cultivo y transferir a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de DMEMc frío en hielo.Centrifugar los organoides recolectados a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un mililitro de reactivo de disociación enzimática precalentado suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK. Pipet arriba y abajo 10 veces para iniciar la disociación de los organoides.Incubar durante cinco minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados para la digestión enzimática. Interrumpir mecánicamente los organoides pipeteando 10 veces y añadir cuatro mililitros de DMEMc helado. Centrifugar y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet de células organoides en un mililitro de DMEMc.Cuente las células en azul de tripano con un contador de células y calcule el volumen necesario para sembrar de 2,5 veces de 10 a la quinta celda por inserto de cultivo. Centrifugar el volumen necesario de la suspensión celular correspondiente a 2,5 veces 10 de las quintas células por inserto de cultivo. Durante la centrifugación, aspire cuidadosamente la solución de recubrimiento de los insertos de cultivo y deje que se seque debajo de la campana sin la tapa durante cinco minutos.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el volumen necesario de medio 2D suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK. Semilla 200 microlitros de la suspensión celular sobre la membrana permeable recubierta. Agregue 500 microlitros del medio 2D suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK al compartimento inferior e incube.Se debe observar una alta densidad de células en la membrana. Un día después de la siembra, reemplace los medios épicos y basales con medios 2D frescos sin el inhibidor ROCK. Cambie los medios de comunicación cada día.La monocapa se vuelve confluente un día después de la siembra y puede usarse para sus experimentos. En este estudio, se obtuvieron criptas epiteliales del intestino del cerdo y se criopreservaron para su almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. Después de la descongelación, las células madre de la cripta se sembraron en la ECM.Los organoides se observaron dentro de tres o cuatro días y rápidamente crecieron y desarrollaron estructuras en ciernes. Aproximadamente 10 días después de la descongelación, se realizó el paso de organoides para expandir el cultivo. Para un mantenimiento óptimo del cultivo, los organoides utilizados para el envasado deben presentar una luz clara y vacía y bordes bien definidos sin residuos negros en la luz como se observa en los organoides maduros.Las células se unen y forman una monocapa totalmente confluente en un día, lo que se confirma por la alta resistencia eléctrica transepitelial, o TEER, de alrededor de 700 cúpulas de centímetros cuadrados. El TEER permanece alto durante tres días. La tinción de actina indica que el lado apical de las células epiteliales está orientado hacia la luz en los organoides 3D.Las células organoides sembradas en inserciones de cultivo forman una sola capa confluente de células epiteliales con el lado apical orientado hacia el compartimiento superior. La tinción de occludina revela la presencia de uniones estrechas en el lado apical de las células epiteliales en organoides 3D y en monocapas celulares. Es importante recordar que el organoide utilizado para sembrar monocapas celulares debe aparecer claro con un lumen vacío sin restos negros correspondientes a una acumulación de células muertas.Las monocapas de organoides intestinales de cerdo se pueden usar para probar los efectos de metabolitos o microbios en la función de barrera epitelial mediante el uso de ensayos funcionales, imágenes y análisis de expresión génica.

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...