Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" -projektet) och av INRAE HOLOFLUX ("Holopig" -projektet). Författarna är tacksamma för Genotoul core facilities (TRI). Vi tackar Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) för noggrann korrekturläsning.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Detta protokoll beskriver en metod som används för att kryokonservera epitelkrypter från gristarmen för långvarig lagring och efterföljande odling av 3D-organoider. Detta protokoll använder en fryslösning innehållande DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hämmaren, DMEM och antibiotika. En annan studie på grisar erhöll organoider från krypter kryokonserverade i en liknande fryslösning men utan ROCK-hämmaren15. Y27632 ROCK-hämmaren inkluderades för att förhindra apoptos och upprätthålla stamcellspoolen eftersom epiteliala kryptceller dissocieras efter upptining, vilket kan leda till celldöd ("anoikis")27,28. Intressant nog har hästenteroider erhållits från epitelkrypter frysta i ett odlingsmedium innehållande endast DMEM och DMSO16; Denna enkla metod har inte testats för grisepitelkrypter ännu. Andra metoder har publicerats för att odla humana och grisorganoider från frysta vävnader eller biopsier istället för epitelkrypter 4,17. Fördelen med denna metod är förmågan att direkt kryokonservera tarmvävnaderna utan att utföra kryptisoleringsproceduren, vilket kräver tid och laboratorieutrustning. Detta kan vara praktiskt när vävnaderna måste samlas långt från labbet. Vid isolering av krypterna omedelbart efter slakt kan emellertid stora delar av tarmen bearbetas för att erhålla ett mycket stort antal krypter, vilket inte är fallet när man utgår från små frysta vävnadsfragment. Efter upptining av epitelkrypter observerades organoider från 3-4 dagar efter sådd och delades efter 10 dagar. Detta är en långsammare tillväxthastighet än vid start av kulturen från färska epitelkrypter, för vilka organoiderna erhölls från dag 1 efter sådd, och kan vanligtvis delas runt dag 511. Khalil et al. rapporterade också en fördröjd tillväxt av grisenteroider vid start från frysta krypter15, vilket tyder på att stamceller kan kräva tid för att återställa sin proliferativa kapacitet. Vi fick också ett lägre antal organoider när vi startade från frysta krypter jämfört med färska krypter, vilket kan bero på att stamceller dör under frysningsprocessen. I vissa försök att tina krypter (<20%) fick vi inte organoider från frysta krypter, troligen på grund av en suboptimal kryokonserveringsprocedur (t.ex. fördröjd frysning efter kryptisolering på förmodligen mer än 1 h). Därför rekommenderar vi att du håller krypterna på is tills du räknar och fryser dem så snabbt som möjligt.
För 3D-organoider valde vi att använda ett kommersiellt organoidodlingsmedium formulerat för människor. Faktum är att tidigare rapporter har visat att grisintestinala organoider växer effektivt med detta medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Det är av intresse för detta odlingsmedium att vara färdigt att använda och ha en standardiserad koncentration av tillväxtfaktorer inom en sats. Detta odlingsmedium är emellertid dyrt, dess sammansättning är inte avslöjad och det är därför inte möjligt att modulera dess sammansättning. Däremot har andra studier odlat gristarmorganoider i skräddarsydda medier innehållande farmakologiska hämmare, rekombinant tillväxtfaktor och / eller konditionerade medier 5,6,7,21. Även om den är mycket flexibel och billigare, är denna metod tidskrävande för produktion av konditionerade medier och kan sakna reproducerbarhet på grund av potentiell variation i koncentrationen av tillväxtfaktorer i konditionerade medier. Således bör kvaliteten på varje sats av konditionerade medier valideras genom mätning av organoidtillväxt eller markörgenuttryck31.
En studie har visat att gris jejunala organoider odlade i samma kommersiella organoidodlingsmedium som används här växte snabbare och verkade mindre differentierade jämfört med enteroider odlade med media innehållande rekombinant tillväxtfaktor och / eller konditionerade medier23. Ett högt proliferativt tillstånd underlättar odlingen av 3D-organoider, men kan kräva inducerande differentiering för att vara mer representativ för tarmfysiologiska egenskaper. I detta protokoll, för passage av 3D-organoider, dissocieras cellerna fullständigt för räkning, vilket gör det möjligt att kontrollera antalet celler som ympas i ECM. Detta ökar reproducerbarheten av fenotypen av organoider, vilket påverkas starkt av deras densitet. Dessutom undviker man genom att räkna cellerna att få för låg eller en överfull kultur, vilket kräver anpassning av odlingsschemat. De flesta andra studier förberedde organoidfragment som inte var helt dissocierade till enskilda celler och använde ett utspädningsförhållande för passaging. Denna metod är enklare, men kan inducera variation beroende på kulturens organoiddensitet.
För odlingen i monolager sås organoidceller i odlingsinsatser förbelagda med ett tunt lager ECM, som möjliggör bindning av celler men undviker tillväxt av organoider i 3D. Detta protokoll använde kollagen typ IV som ett ECM-protein, som beskrivits tidigare hos grisar23. Andra studier med grisorganoidmonolager använde samma tumörhärledda ECM som används här för att odla 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fördelen med att använda kollagen är förmågan att standardisera proteinkoncentrationen med en fullständigt definierad komposition, vilket inte är fallet i tumör-härledd ECM. Ett kritiskt steg för framgången med kulturen av cellmonolager är att uppmärksamma det visuella utseendet hos föregångaren 3D-organoider, som ska ha väldefinierade kanter och en tom lumen utan svarta skräp. Faktum är att organoider med hög mognadsnivå och låg proliferativ hastighet inte är en lämplig källa till celler för 2D-odling. Således är tidpunkten för dissociationen av 3D-organoider i enskilda celler avgörande för framgången med detta steg.
Kulturen av 2D-monolager från enskilda celler möjliggör standardisering av antalet celler som utsädes, vilket är svårare när man börjar från organoidfragment, som utförs i vissa andra metoder. Vi sådde 7,6 x 10 5 celler per cm 2, vilket är högt jämfört med de flesta andra studier 21,22,23 hos grisar som använde en lägre celldensitet, allt från0,25 x 10 5 celler per cm 2 till 1,78 x 10 5 celler per cm2. Kravet på ett stort antal organoidceller utgör en begränsning av detta protokoll, men det gjorde det möjligt för oss att snabbt få ett konfluent monolager som helt täcker odlingsinsatsen efter 1 dag. Däremot erhöll Vermeire et al.23 sammanflöde efter 4-7 dagar med en lägre densitet av celler sådda (från 0,25 x 10 5 celler / cm 2 till 0,4 x 105 celler / cm2). Vissa studier har också använt monolager av organoidceller från gris som inte helt täckte odlingsytan för infektioner med virus 8,30. Under dessa förhållanden är den apikala sidan av epitelceller tillgänglig för behandlingar, men helt sammanflytande monolager krävs om målet är att studera näringsabsorption eller epitelpermeabilitet.
För organoidcellmonolager användes ett kommersiellt organoidodlingsmedium kompletterat med 20% FBS, baserat på en nyligen genomförd studie på bovina enteroid-härledda monolager32. I våra tester var tillskottet med 20% FBS nödvändigt för att erhålla helt sammanflytande monolager, troligen på grund av ett högt tillväxtfaktorkrav. Tvärtom har andra studier som använder samma kommersiella medium etablerat monolager utan ytterligare FBS 8,25,30, men utan att nå full sammanflöde. Andra studier har också använt tillskott med 20% FBS i ett anpassat medium för odling av grisorganoidcellmonolager21,22. I våra experiment är TEER hög 1 dag efter sådd (cirka 700 Ω cm 2) och förblir hög fram till dag 3 (cirka 1 500 Ω cm2; detta överensstämmer med bildandet av snäva korsningar, vilket indikeras av uttrycket av ockludin. Van der Hee et al. erhöll liknande TEER-värden över 72 timmar för jejunumorganoidcellmonolager21. De visade också att monolager kan bibehållas fram till dag 12-15 med dagliga medieförändringar. Däremot har andra studier rapporterat mycket lägre TEER-värden (cirka 200 Ω·cm2) för grisorganoidcellmonolager 6,22. Dessa skillnader mellan studier kan vara relaterade till det studerade tarmsegmentet eller till de medier som används som påverkar epiteldifferentiering.
Sammanfattningsvis underlättar ovanstående protokoll för att odla gristarm 3D-organoider från frysta epitelkrypter organisationen av kulturarbetet. Det minskar behovet av färska vävnader som ska erhållas från levande djur. Vi förklarar också hur man etablerar helt sammanflytande cellmonolager härledda från grisorganoider på mindre än 3 dagar. Således kan våra protokoll vara användbara resurser för forskare som studerar gristarmepitelet för veterinärmedicinsk eller biomedicinsk forskning.

Tarmepitelet bildas av ett monolager av celler som täcker matsmältningsslimhinnan vid gränssnittet med den luminala miljön. Denna position är förknippad med olika funktioner, såsom näringsabsorption och barriärfunktion, som stöds av närvaron av stamceller och flera differentierade epitelcelltyper (absorptiva, enteroendokrina, Paeth- och bägarceller)1. Odödliga cellinjer som traditionellt används för att studera epitelceller har stora begränsningar, eftersom de inte återspeglar tarmepitelets cellulära komplexitet och uppvisar genomiska abnormiteter2. Utvecklingen av tredimensionella (3D) organoider av Sato et al.3 gav en ny modell för att studera tarmepitelet med förbättrad fysiologisk relevans. Faktum är att intestinala organoider härrör från icke-transformerade stamceller, består av flera celltyper och rekapitulerar funktionaliteten hos tarmepitelet. Intestinala organoider används alltmer för att förstå utvecklingen och funktionerna i tarmepitelet och dess interaktioner med patogener, näringsämnen, toxiner, läkemedel, mikrobioten och dess metaboliter2.
Ursprungligen utvecklades för människor och möss, de metoder som används för att odla tarmorganoider har nyligen anpassats till andra arter, inklusive grisar4. Gonzales et al.5 var de första som odlade grisorganoider från jejunum; Sedan dess har svinorganoider beskrivits för andra tarmsegment (tolvfingertarmen, ileum och kolon)6,7,8, och har visat sig behålla en platsspecifik fenotyp 9,10,11. Gristarm 3D-organoider används nu ofta för att studera effekten av näringsämnen 12,13 eller enteriska infektioner 6,8,14.
De flesta av studierna har beskrivit kulturen av intestinala organoider som börjar från nyligen isolerade epitelkryptor. Detta är dock inte alltid möjligt av logistiska skäl, särskilt när man arbetar med stora djur som grisar. Faktum är att djuranläggningar för grisar kan placeras långt ifrån laboratoriet där organoider odlas, vilket komplicerar arbetsorganisationen. Dessutom är organoidkulturen tidskrävande; Således är det inte praktiskt att samtidigt odla flera organoidlinjer, till exempel från olika tarmsegment eller flera djur. För att kringgå dessa problem har några studier på människor, hästar och grisar beskrivit metoder för att odla organoider från frysta tarmvävnader (eller biopsier) eller från isolerade epitelkrypter 4,15,16,17. Dessa metoder möjliggör kryokonservering av tarmepitelstamceller från flera tarmsegment av ett enda djur, som sedan kan användas för att odla organoider vid behov. Dessutom möjliggör detta en kraftig minskning av antalet levande djur som används som donatorer av stamceller, eftersom stora lager av kryokonserverade krypter kan skapas (principerna för 3R). En annan fördel med denna metod är tillväxten av intestinala organoider endast från djur av intresse efter att ha erhållit fenotypiska eller genotypiska resultat, vilket är mycket kostnadseffektivt.
In vivo polariseras intestinala epitelceller, med den apikala sidan riktad mot lumen. In vitro, i 3D-organoider, är den apikala sidan av epitelceller också vänd mot lumen (dvs inuti organoiderna)4. Denna organisation förhindrar åtkomst till den apikala sidan, vilket är ett problem när man studerar effekterna av luminala komponenter (t.ex. näringsämnen, mikrober, metaboliter) på epitelceller. För att kringgå denna nackdel har flera metoder utvecklats, såsom odling av organoidceller som 2D-monolager, mikroinjektion och polaritetsomvandling ("apikala organoider")18,19. Kulturen av organoidcellmonolager framträder som det mest effektiva och lätthanterliga systemet. Principen är att dissociera 3D-organoider i enskilda celler och frö dem på ett cellodlingskärl som tidigare belagts med ett tunt lager av extracellulär matris (ECM)20. Under dessa odlingsbetingelser är den apikala sidan av epitelcellerna vänd uppåt och är därmed tillgänglig för experimentella behandlingar20. Kulturen av organoidcellmonolager anpassades nyligen för gristarmen21,22; cellmonolager härrörande från gris 3D-organoider har använts för flera applikationer, inklusive studier av enteriska infektioner 6,23,24,25, transport av näringsämnen9 och modellering av matsmältningssjukdomar 26.
Här presenterar denna studie först ett detaljerat protokoll för odling och underhåll av gristarm 3D-organoider härrörande från kryokonserverade epitelkrypter (figur 1). Därefter beskrivs ett protokoll för att etablera cellmonolager från gristarmens 3D-organoider. Metoderna som beskrivs här ger experimentella verktyg som kan användas för att studera gristarmepitelet för näringstransport, barriärfunktion och värd-mikroorganisminteraktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

Intestinala organoider används alltmer för att studera tarmepitelet för modellering av matsmältningssjukdomar, eller för att undersöka interaktioner med läkemedel, näringsämnen, metaboliter, patogener och mikrobiotan. Metoder för att odla tarmorganoider finns nu tillgängliga för flera arter, inklusive grisar, vilket är en art av stort intresse både som husdjur och som en translationell modell för människor, till exempel för att studera zoonotiska sjukdomar. Här ger vi en fördjupad beskrivning av ett förfarande som används för att odla gristarm 3D-organoider från frysta epitelkrypter. Protokollet beskriver hur man kryokonserverar epitelkrypter från gristarmen och de efterföljande procedurerna för att odla 3D-tarmorganoider. De främsta fördelarna med denna metod är (i) den tidsmässiga dissociationen av isoleringen av krypter från kulturen av 3D-organoider, (ii) beredningen av stora lager av kryokonserverade krypter härrörande från flera tarmsegment och från flera djur samtidigt, och därmed (iii) minskningen av behovet av att ta prov på färsk vävnad från levande djur. Vi beskriver också ett protokoll för att etablera cellmonolager härledda från 3D-organoider för att möjliggöra åtkomst till den apikala sidan av epitelceller, vilket är platsen för interaktioner med näringsämnen, mikrober eller läkemedel. Sammantaget är de protokoll som beskrivs här en användbar resurs för att studera gristarmepitelet i veterinärmedicinsk och biomedicinsk forskning.

Enligt det ovan beskrivna protokollet erhålls epitelkrypter från gristarmen och fryses för långvarig lagring i flytande kväve (figur 1 och figur 2A). Efter upptining sås kryptstamcellerna i ECM (figur 2B). Kryptstrukturen går vanligtvis förlorad efter detta steg på grund av sönderdelningen av kryptstrukturen i ECM. Organoiderna kan observeras inom 3-4 dagar och växer sedan snabbt och utvecklar spirande strukturer (Figur 2B). Vi fick framgångsrikt organoider efter upptining av frysta krypter i >80% av försöken. Cirka 10 dagar efter upptining (enligt organoidernas tillväxthastighet) utförs en passage av organoider för att expandera kulturen (figur 3). Organoiderna växer snabbare efter delning, och de presenterar olika morfologier, med några cystiska och en majoritet av spirande organoider. För optimalt underhåll av kulturen måste organoiderna som används för passaging presentera en klar och tom lumen och väldefinierade kanter (exempel indikerade med gröna pilar) utan svart skräp i lumen (indikerat med röda pilar), vilket observeras i mogna organoider (figur 3). Vi fann att svarta blodkroppar börjar ackumuleras runt dag 6 efter passaging. Således rekommenderas delning eller frysning av organoiderna vid dag 4-5 efter passaging.
Organoidernas mognadsstadium är också en viktig punkt för att erhålla cellmonolager. Organoider med avancerad mognad (indikeras av närvaron av svarta cellskräp i lumen) är inte optimala för frömonolager. Vi dissocierar vanligtvis 3D-organoider 4 dagar efter passage för att samla celler för 2D-odling. Ungefär en till tre brunnar av 3D-organoider odlade vid 3 000 celler per 50 μL kupol av ECM behövs för sådd av en kulturinsats med 2,5 x 105 celler. Celler fäster och bildar ett helt sammanflytande monolager inom 1 dag (figur 4A), vilket bekräftas av den höga TEER på cirka 700 Ω cm2 (figur 4B). Cellkanterna är dock svåra att visualisera med ljusfältmikroskopi vid denna tidiga tidpunkt, troligen på grund av en låg differentieringsnivå. TEER förblir hög i 3 dagar (figur 4B).
Aktinfärgning indikerar att den apikala sidan av epitelcellerna är orienterad mot lumen i 3D-organoider (figur 5A). Organoidceller sådda i odlingsinsats bildar ett sammanflytande enda lager av epitelceller, med den apikala sidan orienterad mot det övre facket (figur 4B, C). Ockludinfärgning avslöjar närvaron av täta korsningar vid epitelcellernas apikala sida i 3D-organoider och i cellmonolager (figur 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av de metoder som används för att odla 3D-organoider och cellmonolager härledda från organoider. Epitelkrypter isoleras från gristarmen. Dessa kryptor kan i) användas omedelbart för att odla 3D-organoider eller ii) frysas och lagras i en biobank i flytande kväve. Kryokonserverade krypter kan tinas och användas för att odla 3D-organoider. 3D-organoidkulturen kan bibehållas med successiv klyvning, eller frysas och lagras i biobanken. Cellmonolager kan erhållas från 3D-organoidkulturen för att möjliggöra åtkomst till den apikala sidan av cellerna och studera epitelbarriärfunktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Figur 2: Odling av 3D-organoider från grisintestinala epitelkrypter. (A) Representativ mikroskopisk bild av nyligen isolerade jejunala krypter. (B) Representativa mikroskopiska bilder av 3D-organoider erhållna efter upptining av jejunalkrypterna. Organoiderna odlades i en 25 μL kupol av ECM i en 48-brunnsplatta. Figuren visar bilder av 3D-organoiderna vid 4, 7, 8, 9 och 10 dagar efter sådd. Skalstapeln representerar 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Figur 3: Morfologi hos 3D-organoider i gristarmar härledda från kryokonserverade epitelkrypter efter den första passagen. Representativa mikroskopiska bilder som visar utvecklingen av organoider härrörande från kryokonserverade jejunumkryptor efter den första passagen från dag 4 till dag 7. Gröna pilar indikerar tydliga organoider som är lämpliga för passage eller sådd av monolager. Röda pilar indikerar mogna organoider som inte är lämpliga för splittring eller sådd av monolager; Således bör brunnar användas före uppenbarelsen av denna morfologi. Skalstapeln representerar 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Figur 4: Egenskaper hos cellmonolager härledda från 3D-organoider i gristarmen . (A) Representativa mikroskopiska bilder av monolagermorfologin under 3 dagar. Jejunum organoidceller såddes vid 2,5 x 105 celler i 0,33 cm2 cellodlingsinsatser belagda med kollagen IV vid 50 ng / ml. Skalstapeln representerar 500 μm. (B) Transepitelialt elektriskt motstånd (TEER) hos organoidcellmonolager under 3 dagar. Prickar anslutna med en linje motsvarar samma brunn vid olika tidpunkter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Figur 5: Avbildning av gris jejunum organoider odlade i 3D eller 2D. Konfokalmikroskopiavbildning av (A) 3D-organoider 5 dagar efter klyvning och (B,C) monolager av organoidceller 3 dagar efter sådd (B: XZ-sektion; C: XY avsnitt). DNA (blått) färgades med DAPI. Actin (röd) färgades med falloidin. Occludin (grön) färgades med en polyklonal antikropp. Vita pilar indikerar ockludin lokaliserad vid den snäva korsningen. Skalstapeln representerar 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Här beskriver vi ett protokoll för att odla gristarm 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter. Vi beskriver också en metod för att etablera cellmonolager härledda från 3D-organoider, vilket möjliggör åtkomst till den apikala sidan av epitelceller.

Odling av Piglet Intestinal 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter och etablering av cellmonolager

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Vårt protokoll tillhandahåller verktyg för att studera gristarmepitelet för veterinärmedicinsk och biomedicinsk forskning. Intestinala organoider från grisar kan användas för att studera näringstransport, barriärfunktion och värd-mikrobinteraktioner. Genom bevarande av gris intestinala epitelkrypter tillåter att skapa ett stort lager av stamceller som senare kan användas för att odla organoid i 3D eller 2D monolayers.Detta protokoll är detaljerat för jejunum, men det kan också användas för andra tarmsegment som tolvfingertarmen, ileum och tjocktarmen. För att börja, tina snabbt en injektionsflaska som innehåller 900 frusna krypter i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Överför kryptlösningen till ett 15 ml koniskt rör.Centrifugera vid 300 x g i fem minuter vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten. Tillsätt 150 mikroliter av den extracellulära matrisen eller ECM med en kyld spets för att erhålla en slutlig koncentration av 150 krypter per 25 mikroliter ECM. Pipettera upp och ner 10 gånger för att erhålla en homogen suspension av krypter i ECM.Frö sex brunnar med en 25 mikroliter droppe per brunn i en förvärmd 48-brunnsplatta. Inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för polymerisation av ECM. Tillsätt en 250 mikroliter per brunn av mediekultur vid rumstemperatur och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Byt odlingsmedium varannan till var tredje dag. För att passera 3D-organoider härrörande från frysta krypter 10 dagar efter sådd, ta bort odlingsmediet och tillsätt 250 mikroliter förvärmd PBS vid 37 grader Celsius. Efter inkubation, ersätt PBS med 250 mikroliter förvärmt enzymdissociationsreagens kompletterat med 10 mikromolära bergartshämmare vid 37 grader Celsius i varje brunn.Lossa organoiderna i ECM genom att skrapa med en P-1000-pipett och homogenisera försiktigt genom pipettering fem gånger. Inkubera i fem minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid innan cellerna dissocieras genom pipettering upp och ner 10 gånger. Tillsätt 500 mikroliter DMEMc i varje brunn som innehåller dissocierade celler och dra upp till 12 brunnar i ett 15 ml koniskt rör innehållande tre milliliter kall DMEMc.Centrifugera vid 500 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i en milliliter kall DMEMc. Räkna cellerna med en utspädning av en till två i trypanblått med en cellräknare.Centrifugera den nödvändiga volymen av celllösningen för att ha 3000 levande celler per kupol. Återsuspendera pelleten med 17 mikroliter kall DMEMc per 3000 levande celler på is. Justera volymen till önskat antal brunnar.Tillsätt långsamt 33 mikroliter kall ECM per 3000 levande celler. Justera volymen till önskat antal brunnar och homogenisera utan att göra bubblor. Se sedan brunnarna med 50 mikroliter ECM-cellsuspension per brunn i en förvärmd 24-brunnsplatta och inkubera i 30 minuter för polymerisation av ECM.Tillsätt 500 mikroliter odlingsmedium per brunn. Inkubera sedan och byt odlingsmedium varannan tre till tre dagar. För att belägga odlingsinsatsen, förbered beläggningslösningen innehållande kollagen IV utspädd vid 50 mikrogram per milliliter i kall PBS.Tillsätt 150 mikroliter av den utspädda beläggningslösningen till varje cellodlingsinsats och inkubera över natten eller i tre timmar. Fem dagar efter delning, lossa organoiderna med ECM genom att skrapa dem med en P-1000-pipett. Homogeniseras försiktigt genom pipettering i odlingsmediet och överför till ett 15 ml koniskt rör innehållande fem ml kall DMEMc på is.Centrifugera de uppsamlade organoiderna vid 500 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera försiktigt supernatanten och resuspendera cellpelleten i en milliliter förvärmt enzymdissociationsreagens kompletterat med 10 mikromolära ROCK-hämmare. Pipet upp och ner 10 gånger för att initiera dissociation av organoiderna.Inkubera i fem minuter i ett 37 grader Celsius vattenbad för enzymatisk nedbrytning. Stör organoiderna mekaniskt genom pipettering 10 gånger och tillsätt fyra milliliter iskall DMEMc. Centrifugera och kassera supernatanten innan organoidcellpelleten suspenderas i en milliliter DMEMc.Räkna cellerna i trypanblått med en cellräknare och beräkna den nödvändiga volymen för att fröa 2,5 gånger 10 till de femte cellerna per odlingsinsats. Centrifugera den nödvändiga volymen av cellsuspensionen motsvarande 2,5 gånger 10 av de femte cellerna per odlingsinsats. Under centrifugering, sug försiktigt beläggningslösningen från odlingsinsatserna och låt den torka under huven utan lock i fem minuter.Efter centrifugering, kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i den nödvändiga volymen 2D-medium kompletterat med 10 mikromolar ROCK-hämmare. Frö 200 mikroliter av cellsuspensionen på det belagda permeabla membranet. Tillsätt 500 mikroliter av 2D-mediet kompletterat med 10 mikromolar ROCK-hämmare till det nedre facket och inkubera.En hög densitet av celler bör observeras på membranet. En dag efter sådd, ersätt det episka och basala mediet med färskt 2D-medium utan ROCK-hämmaren. Byt media varje dag.Monolagret blir sammanflytande en dag efter sådd och kan användas för sina experiment. I denna studie erhölls epitelkrypter från gristarmen och kryokonserverades för långvarig lagring i flytande kväve. Efter upptining såddes kryptstamcellerna i ECM.Organoiderna observerades inom tre till fyra dagar och växte snabbt och utvecklade spirande strukturer. Cirka 10 dagar efter upptining utfördes passagen av organoider för att expandera kulturen. För optimalt underhåll av kulturen måste organoiderna som används för förpackning presentera en klar och tom lumen och väldefinierade kanter utan svart skräp i lumen som observerats i mogna organoider.Celler fäster och bildar ett helt sammanflytande monolager inom en dag vilket bekräftas av det höga transepiteliala elektriska motståndet, eller TEER, på cirka 700 kupoler kvadratcentimeter. TEER förblir hög i tre dagar. Actinfärgning indikerar att den apikala sidan av epitelcellerna är orienterad mot lumen i 3D-organoider.Organoidceller sådda i odlingsinsatser bildar ett sammanflytande enda lager av epitelceller med den apikala sidan orienterad mot det övre facket. Ockludinfärgning avslöjar närvaron av täta korsningar vid epitelcellernas apikala sida i 3D-organoider och i cellmonolager. Det är viktigt att komma ihåg att organoid som används för att fröa cellmonolager ska visas klart med en tom lumen utan svart skräp som motsvarar en ackumulering av döda celler.Monolager från gristarmorganoid kan användas för att testa effekterna av metaboliter eller mikrober på epitelbarriärfunktionen med hjälp av funktionella analyser, avbildning och genuttrycksanalys.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary Epitelial Organoids från Xenopus embryonala celler: Generation, kultur och högupplösta Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-odling av organoider från intestinala Villi Epitel som genomgår dedifferentiering

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Generation av Murine Primary Colon Epitelial Monolayers från intestinala krypter

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering och genetisk manipulering av Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablera 3D-endometrieorganoider från musens livmoder

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-odling av organoider från murina tarmkrypter och en enda stamcell för organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studera epiteleffekterna av tarminflammation in vitro på etablerade murina kolonioider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...