Name: simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Vi vil gerne takke medlemmerne af Institut Curie Flow Facility for deres hjælp med at oprette flowcytometrieksperimenterne. Vi vil også gerne anerkende bidragene fra de andre medlemmer af Team Perié under flere diskussioner. Vi takker Dr. Julia Marchingo og Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) for at dele deres protokol for multiplexing af celledelingsfarvestoffer på lymfocytter. Vi takker Saint Louis hospitals navlestrengsblodbiobank for at have tilvejebragt de biologiske ressourcer, der er nødvendige for udviklingen af denne protokol. Undersøgelsen blev støttet af et ATIP-Avenir-tilskud fra CNRS og Bettencourt-Schueller Foundation (til LP), tilskud fra Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (til LP og AD), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (til LP), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, til LP) og ITMO MIIC-tilskuddet (21CM044, til LP). Ud over finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram ERC StG 758170-Microbar (til LP) blev AD støttet af et stipendium fra Fondation de France.

<ol>
	<li>Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+immunology:+Past,+present,+and+future.">Single-cell immunology: Past, present, and future.</a> Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).</li><li>Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA-sequencing:+A+powerful+yet+still+challenging+technology+to+study+cellular+heterogeneity.">Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity.</a> Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).</li><li>Regev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cell+atlas.">The human cell atlas.</a> Elife. 6, 27041 (2017).</li><li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity.">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li><li>Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+commitment+of+hematopoietic+stem+cells+and+progenitors:+insights+from+recent+single+cell+and+lineage+tracing+technologies.">Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies.</a> Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).</li><li>Peri&#233;, L., Duffy, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retracing+the+in+vivo+haematopoietic+tree+using+single-cell+methods.">Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods.</a> FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).</li><li>Yu, V. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+underlies+cell-autonomous+heterogeneous+behavior+of+hematopoietic+stem+cells.">Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells.</a> Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).</li><li>Ganuza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+haematopoiesis+is+established+by+hundreds+of+precursors+throughout+mammalian+ontogeny.">Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).</li><li>Naik, S. H., Schumacher, T. N., Peri&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+barcoding:+A+technical+appraisal.">Cellular barcoding: A technical appraisal.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).</li><li>Quek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+distinct+leukemic+stem+cells+in+human+CD34+&#8722;+acute+myeloid+leukemia+are+arrested+at+a+hemopoietic+precursor-like+stage.">Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 &#8722; acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).</li><li>Karamitros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+the+continuum+of+human+lympho-myeloid+progenitor+cells.">Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells.</a> Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Delaney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-mediated+expansion+of+human+cord+blood+progenitor+cells+capable+of+rapid+myeloid+reconstitution.">Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution.</a> Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+PPAR-&#947;+3+signaling+expands+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+enhancing+glycolysis.">Antagonism of PPAR-&#947; 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis.</a> Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-booster+nicotinamide+riboside+potently+stimulates+hematopoiesis+through+increased+mitochondrial+clearance.">The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nov/CCN3+enhances+cord+blood+engraftment+by+rapidly+recruiting+latent+human+stem+cell+activity.">Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).</li><li>Horwitz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omidubicel+vs+standard+myeloablative+umbilical+cord+blood+transplantation:+results+of+a+phase+3+randomized+study.">Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study.</a> Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).</li><li>Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+on+transcriptional+landscapes+links+state+to+fate+during+differentiation.">Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.</a> Science. 367 (6479), 3381 (2020).</li><li>Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell+fate+control+by+continuous+single-cell+quantification.">Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification.</a> Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).</li><li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes.">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).</li><li>Marchingo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+stimuli+independently+sum+to+regulate+an+inherited+clonal+division+fate.">T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate.</a> Nature Communications. 7, 13540 (2016).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+division+tracking+dyes+for+proliferation-based+clonal+lineage+tracing.">Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing.</a> Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).</li><li>Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Testing statistical hypotheses. , 784 (2005).</li><li>Tak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSPCs+display+within-family+homogeneity+in+differentiation+and+proliferation+despite+population+heterogeneity.">HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity.</a> Elife. 10, 360624 (2021).</li><li>Sommerkamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+multipotent+progenitor+5+cells+are+located+at+the+interphase+between+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).</li><li>Kato, K., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+CD34++hematopoietic+stem+cells+from+human+peripheral+blood+by+high-gradient+magnetic+cell+sorting.">Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting.</a> Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).</li><li>Miltenyi, S., M&#252;ller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS.">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).</li><li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development.">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li><li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li><li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells.">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li><li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome.">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151 (2013).</li><li>Davison, A. C., Hinkley, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bootstrap Methods and their Application. , (1997).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+B+cell+antibody+class+switching+is+stochastic,+cell-autonomous,+and+tuneable.">Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable.</a> Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+routes+of+lineage+development+reshape+the+human+blood+hierarchy+across+ontogeny.">Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116 (2016).</li><li>Grinenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+restricted+myeloid+progenitors+before+cell+division+in+mice.">Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).</li><li>Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+flow+cytometry:+Helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data.">Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt, der er relevant for dette arbejde. Bidragyderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at indsende værket til offentliggørelse.

MultiGen-analysen er et højt gennemløb, let at udføre og billigt assay, der har været medvirkende til at studere lymfocyt 23,24,35 og murin hæmatopoietiske celler 26,27. Her præsenterer vi en ny udvikling af tilgangen, der gør det muligt ex vivo at dechiffrere den tidlige fase af menneskelig HSPC-forpligtelse på enkeltcelleniveau ved hjælp af kortvarig kultur (figur 6). Enkeltcelle ex vivo-kultursystemer bruges typisk til at vurdere HSPC'ernes langsigtede skæbne i modne celler, men nogle skæbner forekommer tidligere end andre36, hvilket potentielt fordrejer analysen mod færre skæbner. Derudover savner disse kultursystemer normalt information om opdelinger under skæbneforpligtelse. De første forpligtelsestrin har vist sig at forekomme så tidligt som i starten af kulturen, nogle gange uden division26,37, hvilket gør kortsigtet kultur og sporingsopdeling afgørende for at studere tidlig skæbneforpligtelse. Ved samtidig at følge skæbnen, opdelingen og slægtskabet giver dette assay mulighed for at forstå rollen som den første division og skæbnebeslutningen i humane HSPC'er. Ved hjælp af analysen er det muligt at udlede, efter hvor mange opdelinger forpligtelsesprocessen finder sted, balancen mellem selvfornyelse og differentiering for de tidlige forfædre, og hvordan disse egenskaber arves på tværs af generationer. Så vidt vi ved, er dette det eneste assay, der tillader disse typer målinger for humane HSPC'er ved enkeltcelleopløsning. Derudover øgede vi analysens gennemløb ved hjælp af forskellige kombinationer af celledelingsfarvestoffer, hvilket gør dette assay til et værdifuldt værktøj til hurtigt at generere store datasæt. Farvekombinationerne gør det muligt at følge flere familier i de samme brønde, hvilket øger antallet af celler, der er tilgængelige til analyse i kortvarig kultur. Antallet af kombinationer kan potentielt øges endnu mere ved tilsætning af andre farvestoffer (f.eks. gult farvestof) eller ændring af forholdet mellem CFSE og CTV. Dette reducerer dog antallet af andre parametre, der kan analyseres.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> Figur 6: Skematisk gengivelse af protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For at udføre analysen med succes er det på grund af det store antal brønde og det reducerede antal celler, der skal analyseres, nødvendigt at køre flowcytometrianalysen på en analysator udstyret med en pladelæser. Den nye generation af bænkanalysatorer er specielt tilpasset dette assay, da de fleste af dem har et mindre dødvolumen for at reducere procentdelen af celletab. Dette garanterer igen en højere effektivitet ved genvinding af hele hver brønd, hvilket giver anledning til en effektivitet, der anslås til 70% -området26. Estimering af celletabet under flowcytometrioptagelsen er afgørende for analysen af hver enkelt familie. For eksempel, forudsat at der ikke er celledød og tæller antallet af divisioner, er det muligt at estimere antallet af celler pr. Hver familie. Ikke desto mindre er det ønskeligt at gennemføre nogle konfirmatoriske forsøg, især i estimering af celledød under de testede dyrkningsbetingelser og måling af genfindingshastigheden eksperimentelt ved hjælp af et defineret antal celler.
Et af de afgørende trin i denne protokol er toptildelingen. Som allerede nævnt er en topfordeling af god kvalitet stærkt afhængig af isoleringen af meget smalle toppe ved cellesortering. Ikke desto mindre er det stadig vanskeligt at tildele det korrekte antal divisioner baseret entydigt på fordelingen. Da cellesortering og flowcytometrianalyse udføres på to forskellige maskiner, er det ikke muligt direkte at sammenligne intensiteten af hvert signal, så det kan være svært at vide, om den første top, der observeres i højre ende af histogrammet, er top 0 eller top 1. I denne henseende er få løsninger mulige; En måde er at udføre et ortogonalt eksperiment for nøjagtigt at måle antallet af divisioner udført af disse celler (f.eks. Levende cellebilleddannelse). En anden mulighed er blot at tælle antallet af celler i brønden under et omvendt brightfield-mikroskop, før flowcytometrianalysen køres. Dette vil udlede et gennemsnitligt antal divisioner (forudsat at der ikke er celledød). Endelig er en post-hoc løsning til spidsbelastning påvisning af et usædvanligt antal "umulige familier"; Disse familier består af et større antal celler end muligt pr. generation (f.eks. fem celler i generation 2 eller to celler i generation 1 og en celle i generation 2). Muligheden for at udelukke umulige familier kodes i det statistiske analysetrin og markerer den umulige familie. Hvis forekomsten af disse fejl er for høj, er det rimeligt at antage, at spidsbelastningstildelingen skal revideres.
I denne protokol inkluderede vi et par eksempler på datarepræsentation og analyse til analysen, da dette er blevet et vigtigt skridt i genereringen og fortolkningen af store datasæt38. Det første eksempel er varmekortet, der viser totaliteten af alle analyserede celler, organiseret pr. Familie. Dette er et effektivt værktøj til at udforske de generelle egenskaber ved dataene og potentielle konklusioner: er familier sammensat af flere celletyper, eller har de tendens til at være homogene i sammensætning? Er familier spredt over flere generationer, eller deler de for det meste det samme antal gange? Denne sonderende analyse skal derefter suppleres med mere specifikke observationsområder og statistiske undersøgelser. Det kan bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, differentiering uden division, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner for en given forpligtelsesskæbne. Det er grundlæggende under den eksperimentelle planlægning at indstille cellekulturlængden i overensstemmelse hermed til den type spørgsmål, der stilles; For eksempel for de to første spørgsmål (symmetrisk/asymmetrisk balance og differentiering uden division) tillader planlægning af meget korte kulturtrin isolering af et stort antal familier, der kun har udført en eller ingen opdelinger overhovedet26. Omvendt tillader længere eksperimenter udforskning af antallet af divisioner, der kræves for en bestemt celleforpligtelse, da de prøver familier på forskellige stadier af differentiering. Ikke desto mindre er denne metode ikke designet til langsigtede kulturer (2-3 uger), da cellefarvestoffortynding ikke er i stand til nøjagtigt at spore mere end syv eller otte divisioner22. Som følge heraf er dette værktøj for det meste tilpasset til at studere den tidlige forpligtelse hos hæmatopoietiske forfædre og er ikke designet til at drage robuste konklusioner om disse cellers langsigtede differentieringsegenskaber.
Den statistiske ramme blev udviklet specielt til analyse af denne type data og baseret på begrebet permutationer26. Dette var nødvendigt på grund af observationen af en familiær afhængighed af celletypefordelingen og antallet af udførte divisioner. Med andre ord er celler, der er en del af den samme familie, også mere tilbøjelige til at vise lignende fænotyper og opdele det samme antal gange. Selv om en tilbundsgående analyse ligger uden for rammerne af dette arbejde, bør det leverede sæt statistiske test være tilstrækkeligt til vurdering af forskellige forhold.
Afslutningsvis udgør denne protokol et værdifuldt værktøj til vurdering af den cellulære dynamik i hæmatopoietiske stamceller og stamceller ex vivo på en hurtig og billig måde. På grund af sin fleksibilitet og alsidighed med hensyn til tidspunkt, kulturbetingelser og type analyserede HSPC'er giver det mulighed for at teste en række eksperimentelle forhold. Som et flowcytometribaseret assay kan det implementeres i de fleste laboratorier, og det kræver ikke omfattende forudgående viden, hvilket gør det til en god kandidat til screeninger og pilotforsøg.

Det sidste årti var præget af den verdensomspændende spredning af enkeltcellede tilgange til cellulær og molekylærbiologi. Efter at have fulgt trinene i enkeltcellegenomik1,2 er det i dag muligt at studere mange komponenter i en enkelt celle (f.eks. DNA, RNA, proteiner), med nye enkeltcelle-omics-teknikker, der spirer hvert år. Disse teknikker har kastet lys over gamle og nye spørgsmål inden for immunologi, neurobiologi, onkologi og andre, både ved hjælp af humane og modelorganismeceller3. Ved at fremhæve forskellene mellem individuelle celler foranledigede enkeltcelle-omics definitionen af en ny model af hæmatopoiesis, centreret om heterogeniteten af hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) og bevægede sig væk fra den klassiske model af diskrete homogene populationer 4,5.
En af de få ulemper ved alle -omics-teknikkerne er ødelæggelsen af den relevante celle, hvilket udelukker muligheden for at vurdere dens funktionalitet. Omvendt giver andre enkeltcellemetoder, såsom enkeltcelletransplantationsanalyse og afstamningssporingsteknologier, en aflæsning af forfadercellens funktionalitet ved at vurdere individuelle cellers skæbne in vivo 6,7. Afstamningssporingsteknologier involverer mærkning af den interessante celle med en arvelig genetisk7 eller en fluorescerende etiket8,9, hvilket gør det muligt at følge skæbnen for flere enkeltceller på samme tid. Imidlertid er karakteriseringen af startcellerne typisk begrænset til et begrænset antal parametre, såsom ekspressionen af nogle få overfladeproteiner vurderet ved flowcytometri10. Derudover kræver enkeltcelle afstamningssporingsteknologier besværlig detektion af den cellulære etiket, typisk via DNA / RNA-sekventering eller billeddannelse. Dette sidste punkt begrænser især antallet af forhold, der kan testes i et enkelt eksperiment.
En anden klasse af metoder, der bruges til at studere funktionaliteten af enkeltceller, er ex vivo-celledyrkningssystemer af enkelte HSPC'er. Disse guldstandardassays er nemme at udføre og involverer sortering af individuelle celler i cellekulturbeholdere med 96 brønde og efter dyrkning karakteriserer celleafkomfænotypen, typisk ved flowcytometri eller morfologisk analyse. Disse analyser er for det meste blevet brugt til at karakterisere den langsigtede differentiering af HSPC'er i modne celler, typisk efter 2-3 ugers dyrkning 11,12. Alternativt er de blevet brugt til at forsøge at opretholde og udvide ex vivo HSPC'er 13,14,15,16,17,18 med løftet om medicinsk fordel ved transplantation af humane stamceller 19. Endelig er de blevet brugt til at studere HSPC'ers tidlige engagement ved hjælp af kortvarig kultur20, hvor det lave antal celler, der genereres i denne kultur, er den vigtigste begrænsende faktor. En ulempe ved disse forskellige former for ex vivo-assays er, at de kun delvist afspejler in vivo-kompleksiteten; Alligevel er de en af de sjældne måder at studere menneskelig HSPC-differentiering på.
Et manglende stykke information fra eksisterende enkeltcellemetoder (enkeltcelle-omics, afstamningssporing og ex vivo-kultur) er den nøjagtige detektion af celledelinger, en vigtig parameter at overveje, når man studerer HSPC-dynamik21. En enkel måde at vurdere antallet af divisioner via flowcytometri er brugen af opløselige "proteinfarvestoffer", som 5-(og 6)-carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE)22. Disse divisionsfarvestoffer diffunderer inde i cytoplasmaet i de farvede celler og fortyndes med halvdelen og overføres til de to datterceller ved hver celledeling, hvilket gør det muligt at opregne op til 10 divisioner. Ved at kombinere flere divisionsfarvestoffer er det muligt at frø flere individuelle forfædre i samme brønd, da hvert enkelt farvestof tillader adskillelse af de forskellige efterkommere. Dette er princippet bag brugen af cellefarvestoffer til multiplex klonal og divisionssporing, der først blev introduceret for murine lymfocytter23,24.
Her præsenterer vi udviklingen af MultiGen-analysen til brug med murin og humane HSPC'er. Det tillader test af mange enkeltceller samtidigt for deres egenskaber ved differentiering, opdeling og slægtskab ex vivo. Denne høje gennemstrømning, let at udføre og billig analyse gør det muligt at måle den cellulære fænotype, antallet af udførte divisioner og celleslægtskabet og klonforholdet med de andre celler i brønden, alt sammen på samme tid. Det kan bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner, der er nødvendige for en given forpligtelsesskæbne. Protokollen kræver en fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og et flowcytometer med en pladelæser plus det nødvendige udstyr til at udføre cellekultur. Ud over den tekniske protokol til udførelse af analysen på humane HSPC'er leverer vi også den detaljerede analyseramme, herunder den statistiske test, der er nødvendig for at vurdere cellulære egenskaber relateret til begrebet cellefamilie25. Denne protokol er allerede blevet brugt med succes til at beskrive murine HSPC-rummet26,27.
Følgende protokol bruger magnetisk berigede CD34+-celler som udgangsmateriale28. På denne måde er det muligt effektivt at plette og isolere de humane HSPC'er fra forskellige blodkilder (f.eks. Navlestrengsblod, knoglemarv, perifert blod). Det er vigtigt ikke at kassere CD34-fraktionen, da den vil blive brugt som en del af protokollen til at indstille forskellige typer eksperimentelle kontroller. De nævnte cellemængder og volumener kan skaleres op eller ned i henhold til den eksperimentelle arbejdsgang og fornødenheder. På samme måde kan protokollen tilpasses undersøgelsen af forskellige typer forfædre, blot ved at ændre de antistoffer, der anvendes til cellesortering og flowcytometritrin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom culture plate&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Lin APC</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-7776-72</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA III</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace Violet (CTV)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62948-36</td>
			<td>Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block Fc1.3216</td>
			<td>BD</td>
			<td>564220</td>
			<td>Dilution 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>S1900-500C</td>
			<td>Batch S00CH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.1</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312216</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3</td>
			<td>BD</td>
			<td>564195</td>
			<td>Dilution 1/15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343513</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>356620</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560673</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560675</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory prepared</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells

Få teknikker kan vurdere fænotype og skæbne for den samme celle samtidigt. De fleste af de nuværende protokoller, der bruges til at karakterisere fænotype, selvom de er i stand til at generere store datasæt, nødvendiggør ødelæggelsen af cellen af interesse, hvilket gør det umuligt at vurdere dens funktionelle skæbne. Heterogene biologiske differentierende systemer som hæmatopoiesis er derfor vanskelige at beskrive. Med udgangspunkt i celledelingssporingsfarvestoffer videreudviklede vi en protokol til samtidig bestemmelse af slægtskab, divisionsnummer og differentieringsstatus for mange enkelte hæmatopoietiske forfædre. Denne protokol gør det muligt at vurdere ex vivo-differentieringspotentialet hos murine og humane hæmatopoietiske forfædre, isoleret fra forskellige biologiske kilder. Da det desuden er baseret på flowcytometri og et begrænset antal reagenser, kan det hurtigt generere en stor mængde data på enkeltcelleniveau på en relativt billig måde. Vi leverer også den analytiske pipeline til enkeltcelleanalyse kombineret med en robust statistisk ramme. Da denne protokol tillader sammenkædning af celledeling og differentiering på enkeltcelleniveau, kan den bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner for en given forpligtelsesskæbne. Alt i alt kan denne protokol bruges i eksperimentelle designs, der sigter mod at optrævle de biologiske forskelle mellem hæmatopoietiske forfædre fra et enkeltcelleperspektiv.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Præsenteret her er en flowcytometribaseret teknik, der giver mulighed for samtidig måling af antallet af celledelinger, overfladecellefænotype og cellulært slægtskab. Disse egenskaber kan testes statistisk ved hjælp af en permutationsbaseret ramme.

Samtidig vurdering af slægtskab, divisionsnummer og fænotype via flowcytometri for hæmatopoietiske stam- og stamceller

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Få metoder giver mulighed for hurtigt at vurdere funktionaliteten af hæmatopoietiske forfædre. Denne protokol måler virkningen af de første celledelinger på celleskæbne og engagement. Denne protokol gør det muligt at måle samtidig opdeling og differentiering på enkelt celleniveau og med høj gennemstrømning uden at kræve kompleks og omfattende manipulation.Denne metode er egnet til enhver hæmatopoietisk befolkning, der kan opretholdes i kultur. Så det kan let anvendes til kræftbiologi, immunologi og udviklingsbiologi. Til at begynde med alikvote 250 mikroliter CD34 + fraktion ligeligt i fire 15 ml polypropylenrør.Mærk rørene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Alikvote 250 mikroliter af CD34-fraktionen i yderligere fire 15 ml polypropylenrør og mærk rørene. Forbered CFSE høje og CSFE lave løsninger som beskrevet i tekstmanuskriptet.Tilsæt 250 mikroliter CFSE-højopløsning til CF- og CV-røret, 250 mikroliter CFSE-lavopløsning til VC-røret og 250 mikroliter Dulbeccos modificerede ørnemedium eller DMEM uden føtalt bovint serum eller FBS til VI-røret. For at sikre en effektiv blanding af cellesuspension i cellefarvestof skal du hælde røret 90 grader og deponere CFSE-opløsningerne på rørvæggen. Hold derefter røret lodret og bland tre eller fire gange for at sikre en hurtig blanding af CFSE-opløsningerne med de resuspenderede celler.Inkuber suspensionen ved 37 grader Celsius i otte minutter. Efter inkubation tilsættes fem ml DMEM indeholdende 10% FBS og anbringes rørene ved 37 grader Celsius i fem minutter. Drej rørene ved 300 G i fem minutter.Supernatanten fjernes via aspiration uden at forstyrre pelleten, og pelleten vaskes med fem ml PBS, ETDA. Drej glassene igen, og kassér supernatanten, inden pelletsen resuspenderes i 40 mikroliter PBS, ETDA. For at plette CD34 + cellerne skal du forberede en masterblanding af antistoffer i et enkelt 0.5 milliliter rør.Tilsæt syv mikroliter fra antistofmasterblandingen til hver af de fire CD34+betingelser. Resuspender cellerne i farvningsbuffer ved hjælp af ca. 500 mikroliter hver til perlerne i CD34 + celler og en milliliter til CD34-rørene. For cellesortering skal du indstille gating-strategien ved at oprette prikplotdiagrammer.Først skal du visualisere cellerne på et FSCA versus SSCA-punktplot og dobbeltklikke på Polygon-gating-værktøjet for at vælge populationen med lav sidespredning. Mærk denne nyoprettede port som celler. I det følgende prikplot, FSCA versus FSCH, højreklik på plottet og vælg portcellerne i rullemenuen ved at klikke på det.Brug det samme gatingværktøj til at vælge en tæt population på diagonalen mellem de to akser. Mærk denne port som enkeltceller. I det tredje prikplot, APC versus FSH-H, vises populationsenkeltcellerne og portcellerne negativt for ekspression af APC-afstamning.Mærk denne nyoprettede population som Lineage Negative. I det fjerde plot, CFSE versus CTV, skal du vise befolkningen Lineage Negative og oprette fire separate porte, en for hver farvekombination. Gate VI er vist her som et eksempel.Brug det femte og sjette plot til at identificere forfædrene af interesse. Generøst gate CD34 + CD38-befolkning og CD34 + CD38 + i det femte plot. Vælg derefter CD34+CD38-populationen i det sjette plot og tegn tre porte til LMPP, HSC og MPP.Kør CD34+fraktionerne, og optag mindst 5.000 hændelser i enkeltcelleporten. Juster porten for hver farvekombination, og indstil en stram port for at vælge en homogen population. Forbered skabelonen til sortering af plader ved hjælp af layoutet Eksperimentsortering.Brøndene ved navn CD34-indeholder 5.000 til 10.000 celler sorteret på CF, CV, VC, VI-porten. Bulkbrøndene indeholder 500 celler sorteret på porten CD34 + CD38 - Enkeltcellebrøndene indeholder kun en begivenhed pr. Celledelingsfarvekombination pr. Brønd, så fire begivenheder pr. Brønd i alt. Start derefter med at sortere CD34-CF i tilstanden Udbytte renhed.Klik på knappen Erhverv og derefter på knappen Sorter. Klik på Hent og derefter på knappen Sorter, og sørg for, at du har markeret 0160 som renhedsgrad. Til sidst skal du sortere cellerne af interesse, en celle pr. Brønd, i enkelt cellerenhed, og sørg for at have markeret indstillingen Indekssortering.Pladen centrifugeres ved 300 G i fem minutter, og supernatanten fjernes ved hurtigt at vende pladen under hætten over et køkkenrulle. Tilsæt otte mikroliter stående buffer til hul A1 til A4, efterfulgt af tilsætning af otte mikroliter af blandingen til de andre huller. Vask cellerne ved at tilsætte 100 mikroliter farvningsbuffer pr. brønd ved hjælp af en flerkanalpipette.Supernatanten centrifugeres og fjernes, inden cellerne resuspenderes i 85 mikroliter farvningsbuffer. Start analysen på flowcytometeret i anskaffelsestilstand ved hjælp af den dedikerede skabelon og klik på Brugerdefineret. Når du har valgt de interessante fluoroforer fra listen, skal du indstille pladeopsætningen efter pladeskabelonen korrigeret for antallet af huller, der indeholder mindst en celle.Marker indstillingen Omrøring, og vælg 100 mikroliter som grænse for anskaffelsesvolumen. Indstil derefter anskaffelseshastigheden ikke bedre end en mikroliter pr. Sekund, da lavere hastighed forbedrer det samlede analyserede volumen pr. Brønd. For repræsentativ gating sammenkædes de forskellige bulkbrønde i en enkelt fil.Når du har klikket på indstillingen Sammenkæd populationer, skal du vælge Alle ikke-kompenserede parametre i menuen Parametre og derefter klikke på Sammenkædning. Overfør den sammenkædede fil til arbejdsområdet, og anvend derefter kompensationsmatrixen via træk og slip. Celleetiketter med CV og VC har brug for en transformeret værdi.Klik på Værktøjer og Derive Parameter for at få den transformerede værdi. Indsæt den angivne formel i formelboksen. Anvend gatingen på hver farve individuelt som et histogramplot.For CF og VI skal du indstille CFSE-A og CTV-A på henholdsvis X-aksen. For CV og VC skal du indstille den nyligt afledte parameter på X-aksen og derefter indstille porte svarende til hver top. Påfør gatingen på hver enkelt cellebrønd.Sørg for at tilføje den afledte parameter til hver analyseret brønd. Kontroller manuelt hver farveport for hvert felt for at registrere hændelser, der er forkert tildelt til en given top. Flowcytometrianalysen efter cellekultur kræver præcis gating for at fastslå slægtskabet mellem hver enkelt celle sammen med den cellulære fænotypning.Topdefinition og tildeling er afgørende aspekter af flowcytometrianalyse. Histogrammerne viser to eksempler på familier spredt på flere toppe, en af to lignende intensitetstoppe og en med to forskellige intensitetstoppe. Forskellige typer datarepræsentation og statistisk test vises her for to separate eksperimenter udført efter 72 timer for HSC'er og MPP'er.Varmekortet for tilstanden HSC-differentiering repræsenterer forskellige cellefamilier, både i celleskæbner og celledelinger. Histogrammet, der sammenligner skæbnen HSC'er og MPP'er afledte cellefamilier, er vist her. For begge celletyper vises sammenligningen mellem betingelsen GT og betingelsesdifferentieringen sammen med de statistiske test, der udføres for MPP'er.Histogrammer, der sammenligner procentdelen af cellefamilier pr. Generation og typen af symmetri eller asymmetri i skæbnen for den første division, er vist her. Fordelingen af skæbner pr. generation for MPP'er og tilstandsdifferentieringen vises her. Denne procedure kræver at isolere celler i bulk for at indstille den passende gating-strategi.Det er derfor bedre at starte farvningen med mindst 10.000 celler. At kombinere denne metode med kontinuerlig måling, som levende celler forestiller sig, kan være meget kraftfuldt, da de to sammen kan give en detaljeret beskrivelse af de tidlige forfædre til celledynamik. Denne tilgang blev først udviklet til T-cellebiologi af Hopkins Labs.Denne version, tilpasset blodstamceller, udvides nu til kræft og stamcellebiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifikation DNA-mutationer i renset hæmatopoietisk stamcelletransplantation / stamceller

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk injektion af neurale stam / stamceller i mus med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri-baserede assay for Overvågning af NK cellefunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

En Flow flowcytometri-baserede cytotoksicitet analyse til vurdering af menneskers NK celleaktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...