Name: simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

We willen de leden van het Institut Curie Flow Facility bedanken voor hun hulp bij het opzetten van de flowcytometrie-experimenten. We willen ook de bijdragen van de andere leden van het Team Perié bedanken, tijdens meerdere discussies. We bedanken Dr. Julia Marchingo en Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) voor het delen van hun protocol van de multiplexing van celdelingskleurstoffen op lymfocyten. Wij danken de biobank van het Saint Louis ziekenhuisbloed voor het verstrekken van de biologische middelen die nodig zijn voor de ontwikkeling van dit protocol. De studie werd ondersteund door een ATIP-Avenir-subsidie van CNRS en Bettencourt-Schueller Foundation (aan L.P.), subsidies van de Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (aan L.P. en A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (aan L.P.), de Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, aan L.P.), en de ITMO MIIC-subsidie (21CM044, aan L.P.). Naast financiering van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma ERC StG 758170-Microbar (naar L.P.) van de Europese Unie, werd a.d. ondersteund door een fellowship van de Fondation de France.

<ol>
	<li>Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+immunology:+Past,+present,+and+future.">Single-cell immunology: Past, present, and future.</a> Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).</li><li>Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA-sequencing:+A+powerful+yet+still+challenging+technology+to+study+cellular+heterogeneity.">Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity.</a> Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).</li><li>Regev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cell+atlas.">The human cell atlas.</a> Elife. 6, 27041 (2017).</li><li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity.">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li><li>Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+commitment+of+hematopoietic+stem+cells+and+progenitors:+insights+from+recent+single+cell+and+lineage+tracing+technologies.">Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies.</a> Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).</li><li>Peri&#233;, L., Duffy, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retracing+the+in+vivo+haematopoietic+tree+using+single-cell+methods.">Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods.</a> FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).</li><li>Yu, V. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+underlies+cell-autonomous+heterogeneous+behavior+of+hematopoietic+stem+cells.">Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells.</a> Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).</li><li>Ganuza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+haematopoiesis+is+established+by+hundreds+of+precursors+throughout+mammalian+ontogeny.">Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).</li><li>Naik, S. H., Schumacher, T. N., Peri&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+barcoding:+A+technical+appraisal.">Cellular barcoding: A technical appraisal.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).</li><li>Quek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+distinct+leukemic+stem+cells+in+human+CD34+&#8722;+acute+myeloid+leukemia+are+arrested+at+a+hemopoietic+precursor-like+stage.">Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 &#8722; acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).</li><li>Karamitros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+the+continuum+of+human+lympho-myeloid+progenitor+cells.">Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells.</a> Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Delaney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-mediated+expansion+of+human+cord+blood+progenitor+cells+capable+of+rapid+myeloid+reconstitution.">Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution.</a> Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+PPAR-&#947;+3+signaling+expands+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+enhancing+glycolysis.">Antagonism of PPAR-&#947; 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis.</a> Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-booster+nicotinamide+riboside+potently+stimulates+hematopoiesis+through+increased+mitochondrial+clearance.">The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nov/CCN3+enhances+cord+blood+engraftment+by+rapidly+recruiting+latent+human+stem+cell+activity.">Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).</li><li>Horwitz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omidubicel+vs+standard+myeloablative+umbilical+cord+blood+transplantation:+results+of+a+phase+3+randomized+study.">Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study.</a> Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).</li><li>Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+on+transcriptional+landscapes+links+state+to+fate+during+differentiation.">Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.</a> Science. 367 (6479), 3381 (2020).</li><li>Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell+fate+control+by+continuous+single-cell+quantification.">Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification.</a> Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).</li><li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes.">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).</li><li>Marchingo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+stimuli+independently+sum+to+regulate+an+inherited+clonal+division+fate.">T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate.</a> Nature Communications. 7, 13540 (2016).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+division+tracking+dyes+for+proliferation-based+clonal+lineage+tracing.">Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing.</a> Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).</li><li>Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Testing statistical hypotheses. , 784 (2005).</li><li>Tak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSPCs+display+within-family+homogeneity+in+differentiation+and+proliferation+despite+population+heterogeneity.">HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity.</a> Elife. 10, 360624 (2021).</li><li>Sommerkamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+multipotent+progenitor+5+cells+are+located+at+the+interphase+between+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).</li><li>Kato, K., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+CD34++hematopoietic+stem+cells+from+human+peripheral+blood+by+high-gradient+magnetic+cell+sorting.">Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting.</a> Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).</li><li>Miltenyi, S., M&#252;ller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS.">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).</li><li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development.">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li><li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li><li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells.">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li><li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome.">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151 (2013).</li><li>Davison, A. C., Hinkley, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bootstrap Methods and their Application. , (1997).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+B+cell+antibody+class+switching+is+stochastic,+cell-autonomous,+and+tuneable.">Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable.</a> Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+routes+of+lineage+development+reshape+the+human+blood+hierarchy+across+ontogeny.">Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116 (2016).</li><li>Grinenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+restricted+myeloid+progenitors+before+cell+division+in+mice.">Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).</li><li>Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+flow+cytometry:+Helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data.">Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict dat relevant is voor dit werk. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en interpreteren van gegevens, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.

De MultiGen-test is een high-throughput, gemakkelijk uit te voeren en niet-dure test, die instrumenteel is geweest voor het bestuderen van lymfocyten 23,24,35 en murine hematopoietische cellen 26,27. Hier presenteren we een nieuwe ontwikkeling van de aanpak die het mogelijk maakt om ex vivo de vroege fase van menselijke HSPC-toewijding te ontcijferen, op het niveau van één cel met behulp van kortetermijncultuur (figuur 6). Eencellige ex vivo kweeksystemen worden meestal gebruikt om het lot op lange termijn van HSPC's in volwassen cellen te beoordelen, maar sommige lotgevallen treden eerder op dan andere36, waardoor de analyse mogelijk naar minder lotgevallen wordt vertekend. Bovendien missen deze cultuursystemen meestal informatie over verdeeldheid tijdens het lot van het lot. Het is aangetoond dat de eerste verbintenisstappen al aan het begin van de cultuur plaatsvinden, soms zonder divisie26,37, waardoor kortetermijncultuur en het volgen van divisie essentieel zijn om vroege lotsverbintenis te bestuderen. Door tegelijkertijd het lot, de verdeling en de verwantschap te volgen, maakt deze test het mogelijk om de rol van de eerste divisie en de beslissing over het lot in menselijke HSPC's te begrijpen. Met behulp van de test is het mogelijk om af te leiden na hoeveel delingen het verbintenisproces plaatsvindt, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie voor die vroege voorlopers, en hoe die eigenschappen van generatie op generatie worden geërfd. Voor zover wij weten, is dit de enige test die dit soort metingen voor menselijke HSPC's mogelijk maakt, met een eencellige resolutie. Daarnaast hebben we met behulp van verschillende combinaties van celdelingskleurstoffen de doorvoer van de analyse verhoogd, waardoor deze test een waardevol hulpmiddel is om snel grote datasets te genereren. De kleurstofcombinaties maken het mogelijk om verschillende families in dezelfde putten te volgen, waardoor het aantal cellen dat beschikbaar is voor analyse in kortetermijncultuur toeneemt. Het aantal combinaties kan mogelijk nog meer worden verhoogd, door de toevoeging van andere kleurstoffen (bijvoorbeeld gele kleurstof) of door de verhouding tussen CFSE en CTV te wijzigen. Dit vermindert echter het aantal andere parameters dat kan worden geanalyseerd.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> Figuur 6: Schematische weergave van het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om de analyse met succes uit te voeren, vanwege het grote aantal putten en het verminderde aantal te analyseren cellen, is het noodzakelijk om de flowcytometrie-analyse uit te voeren op een analysator die is uitgerust met een plaatlezer. De nieuwe generatie bench analyzers is bijzonder aangepast aan deze test, omdat de meeste van hen een kleiner dood volume hebben om het percentage celverlies te verminderen. Dit garandeert op zijn beurt een hogere efficiëntie bij het terugwinnen van het geheel van elke put, wat leidt tot een geschatte efficiëntie in het bereik van 70%26. Het schatten van het celverlies tijdens de flowcytometrie-acquisitie is cruciaal voor de analyse van elke individuele familie. Bijvoorbeeld, uitgaande van geen celdood en het tellen van het aantal delingen, is het mogelijk om het aantal cellen per familie te schatten. Niettemin is het wenselijk enkele bevestigende experimenten uit te voeren, met name bij de schatting van de celdood in de geteste kweekomstandigheden en het experimenteel meten van de herstelsnelheid met behulp van een bepaald aantal cellen.
Een van de cruciale stappen van dit protocol is de piektoewijzing. Zoals gezegd is een kwalitatief goede piekverdeling sterk afhankelijk van de isolatie van zeer smalle pieken bij celsortering. Toch is het nog steeds moeilijk om het juiste aantal divisies toe te wijzen op basis van de verdeling. Omdat celsortering en flowcytometrie-analyse op twee verschillende machines worden uitgevoerd, is het niet mogelijk om de intensiteit van elk signaal direct te vergelijken, dus het kan moeilijk zijn om te weten of de eerste piek die aan de rechterkant van het histogram wordt waargenomen, piek 0 of piek 1 is. In dit opzicht zijn er weinig oplossingen mogelijk; Een manier is om een orthogonaal experiment uit te voeren om het aantal delingen dat door deze cellen wordt uitgevoerd nauwkeurig te meten (bijv. Live-cell Imaging). Een andere mogelijkheid is om eenvoudig het aantal cellen in de put te tellen onder een omgekeerde brightfield-microscoop, voordat de flowcytometrie-analyse wordt uitgevoerd. Dit zal een gemiddeld aantal delingen afleiden (ervan uitgaande dat er geen celdood is). Ten slotte is een post-hoc oplossing voor piektoewijzing de detectie van een ongewoon aantal "onmogelijke gezinnen"; Deze families zijn samengesteld uit een groter dan mogelijk aantal cellen per generatie (bijvoorbeeld vijf cellen in generatie 2, of twee cellen in generatie 1 en één cel in generatie 2). De mogelijkheid om onmogelijke families uit te sluiten wordt gecodeerd in de statistische analysestap en markeert de onmogelijke familie. Als het voorkomen van deze fouten te hoog is, is het redelijk om aan te nemen dat de piektoewijzing moet worden herzien.
In dit protocol hebben we enkele voorbeelden van gegevensrepresentatie en -analyse voor de test opgenomen, omdat dit een essentiële stap is geworden in het genereren en interpreteren van grote datasets38. Het eerste voorbeeld is de heatmap met de totaliteit van alle geanalyseerde cellen, georganiseerd per familie. Dit is een efficiënt hulpmiddel om de algemene eigenschappen van de gegevens en mogelijke conclusies te onderzoeken: zijn families samengesteld uit meerdere celtypen of hebben ze de neiging homogeen van samenstelling te zijn? Zijn families verspreid over meerdere generaties, of delen ze meestal hetzelfde aantal keren? Deze verkennende analyse moet vervolgens worden aangevuld met meer specifieke waarnemingspunten en statistische tests. Het kan worden gebruikt om symmetrische en asymmetrische lotsverbintenis, differentiatie zonder deling, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie en het aantal divisies voor een bepaald lot te beoordelen. Het is van fundamenteel belang om tijdens de experimentele planning de lengte van de celkweek in te stellen op basis van het type vraag dat wordt gesteld; Bijvoorbeeld, voor de eerste twee vragen (symmetrisch / asymmetrisch evenwicht en differentiatie zonder deling), maakt het plannen van zeer korte culturen stappen de isolatie mogelijk van een groot aantal families die slechts één of helemaal geen delingen hebben uitgevoerd26. Omgekeerd maken langere experimenten het mogelijk om het aantal delingen te onderzoeken dat nodig is voor een specifieke celverbintenis, omdat ze families in verschillende stadia van differentiatie bemonsteren. Toch is deze methode niet ontworpen voor langdurige culturen (2-3 weken), omdat celkleurstofverdunning niet in staat is om meer dan zeven of acht delingen nauwkeurig te volgen22. Als gevolg hiervan is deze tool meestal aangepast om de vroege betrokkenheid van hematopoietische voorlopercellen te bestuderen en is niet ontworpen om robuuste conclusies te trekken over de differentiatie-eigenschappen van deze cellen op lange termijn.
Het statistisch kader is speciaal ontwikkeld voor de analyse van dit soort gegevens en gebaseerd op het concept van permutaties26. Dit was nodig vanwege de waarneming van een familiale afhankelijkheid van de celtypeverdeling en van het aantal uitgevoerde delingen. Met andere woorden, cellen die deel uitmaken van dezelfde familie hebben ook meer kans om vergelijkbare fenotypen te vertonen en hetzelfde aantal keren te delen. Hoewel een diepgaande analyse buiten het bestek van deze werkzaamheden valt, moet de verstrekte reeks statistische tests voldoende zijn bij de beoordeling van verschillende omstandigheden.
Kortom, dit protocol vormt een waardevol hulpmiddel om de cellulaire dynamiek van hematopoëtische stam- en voorlopercellen ex vivo te beoordelen, op een snelle en goedkope manier. Vanwege de flexibiliteit en veelzijdigheid met betrekking tot het tijdspunt, de kweekomstandigheden en het type geanalyseerde HSPC's, maakt het het mogelijk om een verscheidenheid aan experimentele omstandigheden te testen. Als een op flowcytometrie gebaseerde test kan het in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd en vereist het geen uitgebreide voorkennis, waardoor het een goede kandidaat is voor screenings en pilotexperimenten.

Het afgelopen decennium werd gekenmerkt door de wereldwijde verspreiding van eencellige benaderingen van cellulaire en moleculaire biologie. In navolging van de single-cell genomics1,2 is het tegenwoordig mogelijk om veel componenten van een enkele cel (bijv. DNA, RNA, eiwitten) te bestuderen, met nieuwe single cell -omics-technieken die elk jaar ontluiken. Deze technieken hebben licht geworpen op oude en nieuwe vragen op het gebied van immunologie, neurobiologie, oncologie en andere, zowel met behulp van menselijke als modelorganismecellen3. Door de verschillen tussen individuele cellen te benadrukken, leidde single cell -omics tot de definitie van een nieuw model van hematopoiese, gericht op de heterogeniteit van hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) en weg van het klassieke model van discrete homogene populaties 4,5.
Een van de weinige nadelen van alle -omics-technieken is de vernietiging van de cel van belang, waardoor de mogelijkheid om de functionaliteit ervan te beoordelen wordt uitgesloten. Omgekeerd bieden andere eencellige methoden, zoals eencellige transplantatietest en afstammingstraceringstechnologieën, een uitlezing van de functionaliteit van de vooroudercel door het lot van individuele cellen in vivote beoordelen 6,7. Lineage tracing-technologieën omvatten het labelen van de cel van belang met een erfelijke genetische7 of een fluorescerend label8,9, waardoor het lot van meerdere afzonderlijke cellen tegelijkertijd kan worden gevolgd. De karakterisering van de startcellen is echter meestal beperkt tot een beperkt aantal parameters, zoals de expressie van enkele oppervlakte-eiwitten beoordeeld door flowcytometrie10. Bovendien vereisen single-cell lineage tracing-technologieën een moeizame detectie van het cellulaire label, meestal via DNA / RNA-sequencing of beeldvorming. Met name dit laatste punt beperkt het aantal omstandigheden dat in één experiment kan worden getest.
Een andere klasse van methoden die worden gebruikt om de functionaliteit van afzonderlijke cellen te bestuderen, zijn ex vivo celkweeksystemen van enkele HSPC's. Eenvoudig uit te voeren, deze gouden standaardtests omvatten het sorteren van individuele cellen in 96-wells celkweekvaten en na kweek, waarbij het fenotype van het celnageslacht wordt gekarakteriseerd, meestal door flowcytometrie of morfologische analyse. Deze testen zijn meestal gebruikt om de langetermijndifferentiatie van HSPC's in volwassen cellen te karakteriseren, meestal na 2-3 weken kweek11,12. Als alternatief zijn ze gebruikt om te proberen ex vivo HSPC's 13,14,15,16,17,18 te behouden en uit te breiden, met de belofte van medisch voordeel voor menselijke stamceltransplantatie 19. Ten slotte zijn ze gebruikt om de vroege inzet van HSPC's te bestuderen met behulp van kortetermijncultuur20, waarbij het lage aantal cellen dat in deze cultuur wordt gegenereerd de belangrijkste beperkende factor is. Een nadeel van deze verschillende soorten ex vivo assays is dat ze slechts gedeeltelijk de in vivo complexiteit weerspiegelen; toch zijn ze een van de zeldzame manieren om menselijke HSPC-differentiatie te bestuderen.
Een ontbrekend stukje informatie van bestaande eencellige methoden (single cell-omics, lineage tracing en ex vivo cultuur) is de nauwkeurige detectie van celdelingen, een essentiële parameter om te overwegen bij het bestuderen van HSPC dynamics21. Een eenvoudige manier om het aantal delingen via flowcytometrie te beoordelen is het gebruik van oplosbare "eiwitkleurstoffen", zoals de 5-(en 6)-carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFSE)22. Deze delingskleurstoffen diffunderen in het cytoplasma van de gekleurde cellen en worden met de helft verdund en bij elke celdeling doorgegeven aan de twee dochtercellen, waardoor tot 10 delingen kunnen worden opgesomd. Door verschillende divisiekleurstoffen te combineren, is het mogelijk om meerdere individuele voorlopers in dezelfde put te zaaien, omdat elke individuele kleurstof scheiding van de verschillende afstammelingen mogelijk maakt. Dit is het principe achter het gebruik van celkleurstoffen voor multiplex klonale en delingstracking dat voor het eerst werd geïntroduceerd voor muriene lymfocyten23,24.
Hier presenteren we de ontwikkeling van de MultiGen-test voor gebruik met murine en menselijke HSPC's. Het maakt het mogelijk om veel afzonderlijke cellen tegelijkertijd te testen op hun eigenschappen van differentiatie, deling en verwantschap ex vivo. Deze high-throughput, eenvoudig uit te voeren en goedkope test maakt het mogelijk om het cellulaire fenotype, het aantal uitgevoerde delingen en de celverwantschap en klonale relatie met de andere cellen in de put te meten, allemaal tegelijkertijd. Het kan worden gebruikt om symmetrische en asymmetrische lotsverbintenis, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie en het aantal divisies dat nodig is voor een bepaald lot van het lot van een verbintenis kwantitatief te beoordelen. Het protocol vereist een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder (FACS) en een flowcytometer met een plaatlezer, plus de apparatuur die nodig is om celkweek uit te voeren. Naast het technische protocol voor de uitvoering van de test op menselijke HSPC's, bieden we ook het gedetailleerde analysekader, inclusief de statistische tests die nodig zijn om cellulaire eigenschappen met betrekking tot het concept van celfamilie25 te beoordelen. Dit protocol is al met succes gebruikt om het murine HSPC-compartiment26,27 te beschrijven.
Het volgende protocol gebruikt magnetisch verrijkte CD34+ cellen als uitgangsmateriaal28. Op deze manier is het mogelijk om de menselijke HSPC's efficiënt te kleuren en te isoleren van verschillende bloedbronnen (bijv. Navelstrengbloed, beenmerg, perifeer bloed). Het is belangrijk om de CD34-fractie niet weg te gooien, omdat deze als onderdeel van het protocol zal worden gebruikt om verschillende soorten experimentele controles in te stellen. De genoemde celhoeveelheden en -volumes kunnen omhoog of omlaag worden geschaald, afhankelijk van de experimentele workflow en benodigdheden. Op dezelfde manier kan het protocol worden aangepast aan de studie van verschillende soorten voorlopercellen, simpelweg door de antilichamen te wijzigen die worden gebruikt voor de celsortering en flowcytometriestappen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom culture plate&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Lin APC</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-7776-72</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA III</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace Violet (CTV)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62948-36</td>
			<td>Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block Fc1.3216</td>
			<td>BD</td>
			<td>564220</td>
			<td>Dilution 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>S1900-500C</td>
			<td>Batch S00CH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.1</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312216</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3</td>
			<td>BD</td>
			<td>564195</td>
			<td>Dilution 1/15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343513</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>356620</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560673</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560675</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory prepared</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells

Weinig technieken kunnen fenotype en lot voor dezelfde cel tegelijkertijd beoordelen. De meeste van de huidige protocollen die worden gebruikt om het fenotype te karakteriseren, hoewel ze in staat zijn om grote datasets te genereren, vereisen de vernietiging van de cel van belang, waardoor het onmogelijk is om het functionele lot ervan te beoordelen. Heterogene biologische differentiërende systemen zoals hematopoiese zijn daarom moeilijk te beschrijven. Voortbouwend op celdelingsvolgkleurstoffen hebben we verder een protocol ontwikkeld om tegelijkertijd verwantschap, delingsaantal en differentiatiestatus te bepalen voor veel enkelvoudige hematopoietische voorlopers. Dit protocol maakt de beoordeling mogelijk van het ex vivo differentiatiepotentieel van muizen en menselijke hematopoëtische voorlopercellen, geïsoleerd uit verschillende biologische bronnen. Bovendien, omdat het gebaseerd is op flowcytometrie en een beperkt aantal reagentia, kan het snel een grote hoeveelheid gegevens genereren, op het niveau van één cel, op een relatief goedkope manier. We bieden ook de analytische pijplijn voor eencellige analyse, gecombineerd met een robuust statistisch kader. Omdat dit protocol de koppeling van celdeling en differentiatie op eencellig niveau mogelijk maakt, kan het worden gebruikt om symmetrische en asymmetrische lotsverbintenis, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie en het aantal delingen voor een bepaald lot kwantitatief te beoordelen. Al met al kan dit protocol worden gebruikt in experimentele ontwerpen die gericht zijn op het ontrafelen van de biologische verschillen tussen hematopoietische voorlopers, vanuit een eencellig perspectief.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Weinig methoden maken het mogelijk om snel de functionaliteit van hematopoietische voorlopercellen te beoordelen. Dit protocol meet de impact van de eerste celdelingen op het lot en de inzet van cellen. Dit protocol maakt het mogelijk om gelijktijdig deling en differentiatie te meten op eencellig niveau en met een hoge doorvoer zonder complexe en uitgebreide manipulatie te vereisen.Deze methode is geschikt voor elke hematopoietische populatie die in cultuur kan worden gehouden. Het kan dus gemakkelijk worden toegepast op kankerbiologie, immunologie en ontwikkelingsbiologie. Om te beginnen, aliquot 250 microliter van de CD34 + fractie gelijkelijk in vier 15 milliliter polypropyleen buizen.Label de buizen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Aliquot 250 microliter van de CD34-fractie in nog eens vier polypropyleenbuizen van 15 milliliter en label de buizen. Bereid CFSE high en CSFE low oplossingen voor zoals beschreven in het manuscript van de tekst.Voeg 250 microliter van de CFSE-hoogoplossing toe aan de CF- en CV-buis, 250 microliter van de CFSE-laagoplossing aan de VC-buis en 250 microliter Dulbecco's Modified Eagle Medium, of DMEM, zonder foetaal runderserum, of FBS, aan de VI-buis. Om een efficiënte mix van celsuspensie in celkleurstof te garanderen, kantelt u de buis 90 graden en deponeert u de CFSE-oplossingen op de buiswand. Houd vervolgens de buis verticaal en meng drie of vier keer om een snelle menging van de CFSE-oplossingen met de geresuspendeerde cellen te garanderen.Incubeer de suspensie bij 37 graden Celsius gedurende acht minuten. Voeg na incubatie vijf milliliter DMEM met 10% FBS toe en plaats de buizen gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Draai de buisjes vijf minuten op 300 G.Verwijder het supernatant via aspiratie zonder de pellet te verstoren en was de pellet met vijf milliliter PBS, ETDA. Draai de buizen opnieuw en gooi het supernatant weg voordat u de pellet opnieuw in 40 microliter PBS, ETDA, suspenseert. Om de CD34+ cellen te kleuren, bereidt u een hoofdmengsel van antilichamen in een enkele buis van 0,5 milliliter.Voeg zeven microliter uit de antilichaammastermix toe aan elk van de vier CD34+-condities. Resuspendeer de cellen in kleurbuffer met elk ongeveer 500 microliter voor de kralen in CD34+cellen en één milliliter voor de CD34-buisjes. Voor het sorteren van cellen stelt u de gatingstrategie in door puntplotdiagrammen te maken.Visualiseer eerst de cellen op een FSCA versus SSCA dot plot en dubbelklik op de Polygon gating tool om de populatie met lage side scatter te selecteren. Label deze nieuw gemaakte poort als Cellen. Klik in de volgende dot plot, FSCA versus FSCH, met de rechtermuisknop op de plot en selecteer de gate Cells in het vervolgkeuzemenu door erop te klikken.Gebruik hetzelfde gating-gereedschap om een strakke populatie op de diagonaal tussen de twee assen te selecteren. Label deze poort als Enkele cellen. In de derde dot plot, APC versus FSH-H, worden de populatie Single Cells weergegeven en worden de cellen negatief gegate voor de expressie van APC-afstamming.Label deze nieuw gecreëerde populatie als Afstammingsnegatief. In de vierde plot, CFSE versus CTV, toont u de populatie Lineage Negative en maakt u vier afzonderlijke poorten, één voor elke kleurstofcombinatie. Gate VI wordt hier als voorbeeld getoond.Gebruik de vijfde en zesde plot om de voorlopers van belang te identificeren. Royaal poort CD34+CD38-bevolking en de CD34+CD38+in het vijfde perceel. Selecteer vervolgens de CD34 + CD38-populatie in de zesde plot en teken drie poorten voor LMPP, HSC en MPP.Voer de CD34+fracties uit en registreer ten minste 5.000 gebeurtenissen in de poort met één cel. Pas de poort aan voor elke kleurstofcombinatie en stel een strakke poort in om een homogene populatie te selecteren. Bereid de sjabloon Plaatsortering voor met de indeling Experimentsorteer.De putten met de naam CD34 bevatten 5.000 tot 10.000 cellen gesorteerd op de CF, CV, VC, VI poort. De bulkputten bevatten 500 cellen gesorteerd op de poort CD34+CD38-De eencellige putten bevatten slechts één gebeurtenis per celdelingskleurstofcombinatie per put, dus vier gebeurtenissen per put in totaal. Begin vervolgens met het sorteren van de CD34-CF in de yield purity-modus.Klik op de knop Verkrijgen en vervolgens op de knop Sorteren. Klik op Verwerven en vervolgens op de knop Sorteren, zodat u 0160 als zuiverheidsklasse hebt aangevinkt. Sorteer ten slotte de cellen van belang, één cel per put, in een enkele celzuiverheid, en zorg ervoor dat u de optie Index sorteren hebt aangevinkt.Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten op 300 G en verwijder het supernatant door de plaat onder de kap snel om te keren over een papieren handdoek. Voeg acht microliter staande buffer toe aan de putten A1 tot en met A4, gevolgd door acht microliter van het mengsel toe te voegen aan de andere putten. Was de cellen door 100 microliter kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een meerkanaals pipet.Centrifugeer en verwijder het supernatant voordat u de cellen opnieuw in 85 microliter kleuringsbuffer plaatst. Start de analyse op de flowcytometer in acquisitiemodus met behulp van de speciale sjabloon en klik op Aangepast. Nadat u de fluoroforen van belang in de lijst hebt geselecteerd, stelt u de plaatopstelling in volgens de plaatsjabloon gecorrigeerd voor het aantal putten met ten minste één cel.Vink de optie Agitatie aan en selecteer 100 microliter als de limiet voor het acquisitievolume. Stel vervolgens de acquisitiesnelheid niet hoger in dan één microliter per seconde, omdat een lagere snelheid het totale geanalyseerde volume per put verbetert. Voor representatieve gating, voeg de verschillende bulkputten samen in één bestand.Nadat u op de optie Populaties aaneenschakelen hebt geklikt, selecteert u Alle niet-gecompenseerde parameters in het menu Parameters en klikt u vervolgens op Aaneenschakelen. Upload het aaneengeschakelde bestand naar de werkruimte en pas vervolgens de compensatiematrix toe via slepen en neerzetten. Cellabels met CV en VC hebben een getransformeerde waarde nodig.Klik op Tools and Derive Parameter om de getransformeerde waarde te krijgen. Plak de aangegeven formule in het formulevak. Pas de gating toe op elke kleur afzonderlijk als een histogramplot.Stel voor CF en VI respectievelijk CFSE-A en CTV-A in op de X-as. Voor CV en VC stelt u de nieuw afgeleide parameter in op de X-as en stelt u vervolgens poorten in die overeenkomen met elke piek. Pas de gating toe op elke afzonderlijke afzonderlijke celput.Zorg ervoor dat u de afgeleide parameter aan elk geanalyseerd goed toevoegt. Controleer handmatig elke kleurpoort voor elke put om gebeurtenissen te detecteren die onjuist zijn toegewezen aan een bepaalde piek. De flowcytometrie-analyse na celkweek vereist nauwkeurige gating om de verwantschap van elke individuele cel vast te stellen, samen met de cellulaire fenotypering.Piekdefinitie en -toewijzing zijn cruciale aspecten van flowcytometrie-analyse. De histogrammen tonen twee voorbeelden van families verspreid over meerdere pieken, een van twee vergelijkbare intensiteitspieken en een met twee verschillende intensiteitspieken. Verschillende soorten gegevensrepresentatie en statistische tests worden hier getoond voor twee afzonderlijke experimenten die na 72 uur worden uitgevoerd voor HSC's en MPP's.De heatmap voor de aandoening HSC-differentiatie vertegenwoordigt verschillende celfamilies, zowel in celloten als celdelingen. Het histogram waarin het lot van HSC's en MPP's afgeleide celfamilies wordt vergeleken, wordt hier weergegeven. Voor beide celtypen wordt de vergelijking tussen de voorwaarde GT en de conditiedifferentiatie weergegeven samen met de statistische tests die zijn uitgevoerd voor MPP's.Histogrammen die het percentage celfamilies per generatie vergelijken met het type symmetrie of asymmetrie in het lot voor de eerste deling worden hier getoond. De verdeling van lotgevallen per generatie voor MPP's en de conditiedifferentiatie worden hier weergegeven. Deze procedure vereist dat cellen in bulk worden geïsoleerd om de juiste gating-strategie in te stellen.Het is daarom beter om de kleuring te starten met minstens 10.000 cellen. Het combineren van deze methode met continue meting, zoals levende cellen zich voorstellen, kan zeer krachtig zijn, omdat de twee samen een gedetailleerde beschrijving kunnen geven van de vroege voorlopers van celdynamica. Deze aanpak werd voor het eerst ontwikkeld voor T-celbiologie door de Hopkins Labs.Deze versie, aangepast voor bloedstamcellen, breidt zich nu uit naar kanker en stamcelbiologie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kwantitatieve beoordeling van immuuncellen in de gekwetste ruggenmergweefsel door flowcytometrie: een roman te gebruiken voor een cel zuiveringsmethode

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...