Name: simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות לחברי מכון קירי על עזרתם בהקמת ניסויי ציטומטריית הזרימה. אנו רוצים גם להכיר בתרומתם של חברי הצוות האחרים, במהלך דיונים מרובים. אנו מודים לד"ר ג'וליה מרצ'ינגו ולפרופ' פיל הודג'קין (מכון וולטר אנד אלייזה הול למחקר רפואי) על שיתוף הפרוטוקול שלהם של ריבוב צבעי חלוקת תאים על לימפוציטים. אנו מודים לביובנק הדם הטבורי של בית החולים סנט לואיס על אספקת המשאבים הביולוגיים הדרושים לפיתוח פרוטוקול זה. המחקר נתמך על ידי מענק ATIP-Avenir מ-CNRS ומקרן Bettencourt-Schueller (ל-L.P.), מענקים מ-Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (ל-L.P. ו-A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (ל-L.P.), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, ל-L.P.), ומענק ITMO MIIC (21CM044, ל-L.P). בנוסף למימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי ERC StG 758170-Microbar (ל- L.P.), A.D. נתמכה על ידי מלגה מקרן דה פראנס.

<ol>
	<li>Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+immunology:+Past,+present,+and+future.">Single-cell immunology: Past, present, and future.</a> Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).</li><li>Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA-sequencing:+A+powerful+yet+still+challenging+technology+to+study+cellular+heterogeneity.">Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity.</a> Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).</li><li>Regev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cell+atlas.">The human cell atlas.</a> Elife. 6, 27041 (2017).</li><li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity.">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li><li>Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+commitment+of+hematopoietic+stem+cells+and+progenitors:+insights+from+recent+single+cell+and+lineage+tracing+technologies.">Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies.</a> Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).</li><li>Peri&#233;, L., Duffy, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retracing+the+in+vivo+haematopoietic+tree+using+single-cell+methods.">Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods.</a> FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).</li><li>Yu, V. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+underlies+cell-autonomous+heterogeneous+behavior+of+hematopoietic+stem+cells.">Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells.</a> Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).</li><li>Ganuza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+haematopoiesis+is+established+by+hundreds+of+precursors+throughout+mammalian+ontogeny.">Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).</li><li>Naik, S. H., Schumacher, T. N., Peri&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+barcoding:+A+technical+appraisal.">Cellular barcoding: A technical appraisal.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).</li><li>Quek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+distinct+leukemic+stem+cells+in+human+CD34+&#8722;+acute+myeloid+leukemia+are+arrested+at+a+hemopoietic+precursor-like+stage.">Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 &#8722; acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).</li><li>Karamitros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+the+continuum+of+human+lympho-myeloid+progenitor+cells.">Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells.</a> Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Delaney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-mediated+expansion+of+human+cord+blood+progenitor+cells+capable+of+rapid+myeloid+reconstitution.">Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution.</a> Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+PPAR-&#947;+3+signaling+expands+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+enhancing+glycolysis.">Antagonism of PPAR-&#947; 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis.</a> Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-booster+nicotinamide+riboside+potently+stimulates+hematopoiesis+through+increased+mitochondrial+clearance.">The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nov/CCN3+enhances+cord+blood+engraftment+by+rapidly+recruiting+latent+human+stem+cell+activity.">Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).</li><li>Horwitz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omidubicel+vs+standard+myeloablative+umbilical+cord+blood+transplantation:+results+of+a+phase+3+randomized+study.">Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study.</a> Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).</li><li>Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+on+transcriptional+landscapes+links+state+to+fate+during+differentiation.">Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.</a> Science. 367 (6479), 3381 (2020).</li><li>Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell+fate+control+by+continuous+single-cell+quantification.">Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification.</a> Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).</li><li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes.">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).</li><li>Marchingo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+stimuli+independently+sum+to+regulate+an+inherited+clonal+division+fate.">T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate.</a> Nature Communications. 7, 13540 (2016).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+division+tracking+dyes+for+proliferation-based+clonal+lineage+tracing.">Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing.</a> Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).</li><li>Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Testing statistical hypotheses. , 784 (2005).</li><li>Tak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSPCs+display+within-family+homogeneity+in+differentiation+and+proliferation+despite+population+heterogeneity.">HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity.</a> Elife. 10, 360624 (2021).</li><li>Sommerkamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+multipotent+progenitor+5+cells+are+located+at+the+interphase+between+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).</li><li>Kato, K., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+CD34++hematopoietic+stem+cells+from+human+peripheral+blood+by+high-gradient+magnetic+cell+sorting.">Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting.</a> Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).</li><li>Miltenyi, S., M&#252;ller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS.">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).</li><li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development.">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li><li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li><li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells.">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li><li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome.">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151 (2013).</li><li>Davison, A. C., Hinkley, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bootstrap Methods and their Application. , (1997).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+B+cell+antibody+class+switching+is+stochastic,+cell-autonomous,+and+tuneable.">Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable.</a> Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+routes+of+lineage+development+reshape+the+human+blood+hierarchy+across+ontogeny.">Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116 (2016).</li><li>Grinenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+restricted+myeloid+progenitors+before+cell+division+in+mice.">Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).</li><li>Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+flow+cytometry:+Helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data.">Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים רלוונטי לעבודה זו. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובפרשנותם, או בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום.

בדיקת MultiGen היא בדיקה בעלת תפוקה גבוהה, קלה לביצוע ולא יקרה, שסייעה לחקור לימפוציטים 23,24,35 ותאים המטופויטיים מורין26,27. כאן אנו מציגים פיתוח חדש של הגישה המאפשרת לפענח ex vivo את השלב המוקדם של מחויבות HSPC אנושית, ברמת התא הבודד באמצעות תרבית לטווח קצר (איור 6). מערכות תרבית אקס-ויו של תא בודד משמשות בדרך כלל להערכת גורלם ארוך הטווח של HSPCs לתאים בוגרים, אך חלק מהגורלות מתרחשים מוקדם יותר מאחרים36, מה שעלול להטות את הניתוח לכיוון פחות גורלות. בנוסף, מערכות תרבות אלה בדרך כלל מפספסות מידע על מחלוקות במהלך מחויבות גורל. צעדי המחויבות הראשונים הוכחו כמתרחשים כבר בתחילת התרבות, לעתים ללא חלוקה26,37, מה שהופך את התרבות לטווח קצר ואת חלוקת המעקב לחיונית לחקר מחויבות הגורל המוקדם. על ידי מעקב בו זמנית אחר הגורל, החלוקה והקרבה, בדיקה זו מאפשרת להבין את תפקידה של החלוקה הראשונה והחלטת הגורל ב- HSPCs אנושיים. באמצעות הבדיקה ניתן להסיק לאחר כמה חלוקות מתרחש תהליך המחויבות, את האיזון בין התחדשות עצמית לבין בידול עבור אותם אבות מוקדמים, וכיצד תכונות אלה עוברות בירושה לאורך דורות. למיטב ידיעתנו, זהו המבחן היחיד המאפשר מדידות מסוג זה עבור HSPCs אנושיים, ברזולוציה של תא בודד. בנוסף, באמצעות שילובים שונים של צבעי חלוקת תאים, הגדלנו את התפוקה של הניתוח, מה שהופך את הבדיקה הזו לכלי רב ערך ליצירת מערכי נתונים גדולים במהירות. שילובי הצבעים מאפשרים לעקוב אחר מספר משפחות באותן בארות, ולהגדיל את מספר התאים הזמינים לניתוח בתרבית לטווח קצר. מספר השילובים יכול להיות גדול עוד יותר, על ידי הוספת צבעים אחרים (למשל, צבע צהוב) או שינוי היחס בין CFSE ו- CTV. עם זאת, זה מקטין את מספר הפרמטרים האחרים שניתן לנתח.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> איור 6: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי לבצע את הניתוח בהצלחה, בשל מספר גדול של בארות ואת מספר מופחת של תאים לנתח, יש צורך להפעיל את ניתוח ציטומטריה זרימה על מנתח מצויד קורא לוחות. הדור החדש של מנתחי ספסל מותאם במיוחד לבדיקה זו, מכיוון שלרובם יש נפח מת קטן יותר כדי להפחית את אחוז אובדן התאים. זה בתורו מבטיח יעילות גבוהה יותר בשחזור כל באר, מה שמביא ליעילות המוערכת בטווח של70% 26. הערכת אובדן התאים במהלך רכישת ציטומטריית הזרימה חיונית לניתוח של כל משפחה בנפרד. לדוגמה, בהנחה שאין מוות תאי וסופרים את מספר החלוקות, ניתן להעריך את מספר התאים לכל משפחה. עם זאת, רצוי לבצע כמה ניסויים מאששים, במיוחד בהערכת מוות תאי בתנאי התרבית הנבדקת ומדידת קצב ההתאוששות באופן ניסיוני באמצעות מספר מוגדר של תאים.
אחד השלבים המכריעים של פרוטוקול זה הוא הקצאת השיא. כאמור, התפלגות שיא באיכות טובה תלויה מאוד בבידוד של פסגות צרות מאוד במיון תאים. עם זאת, עדיין קשה להקצות את המספר הנכון של חטיבות בהתבסס באופן ייחודי על ההתפלגות. מכיוון שמיון תאים וניתוח ציטומטריית זרימה מבוצעים בשתי מכונות שונות, לא ניתן להשוות ישירות את עוצמת כל אות, כך שיהיה קשה לדעת אם השיא הראשון שנצפה בקצה הימני של ההיסטוגרמה הוא שיא 0 או שיא 1. בהקשר זה, פתרונות מעטים אפשריים; דרך אחת היא לבצע ניסוי אורתוגונלי כדי למדוד במדויק את מספר החלוקות המבוצעות על ידי תאים אלה (למשל, דימות תאים חיים). אפשרות נוספת היא פשוט לספור את מספר התאים בבאר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך, לפני ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה. זה יסיק מספר ממוצע של חלוקות (בהנחה שאין מוות תאי). לבסוף, פתרון פוסט-הוק להקצאת שיא הוא איתור מספר חריג של "משפחות בלתי אפשריות"; משפחות אלה מורכבות ממספר גדול מהאפשרי של תאים בכל דור (למשל, חמישה תאים בדור 2, או שני תאים בדור 1 ותא אחד בדור 2). האפשרות להחריג משפחות בלתי אפשריות מקודדת בשלב הניתוח הסטטיסטי, ומסמנת את המשפחה הבלתי אפשרית. אם ההתרחשות של שגיאות אלה גבוהה מדי, סביר להניח כי הקצאת השיא צריכה להיות מתוקנת.
בפרוטוקול זה, כללנו כמה דוגמאות של ייצוג וניתוח נתונים עבור הבדיקה, שכן זה הפך להיות צעד חיוני ביצירה ופרשנות של מערכי נתונים גדולים38. הדוגמה הראשונה היא מפת החום המציגה את מכלול התאים המנותחים, המאורגנים לפי משפחה. זהו כלי יעיל לחקור את המאפיינים הכלליים של הנתונים ואת המסקנות האפשריות: האם משפחות מורכבות מסוגי תאים מרובים או שהן נוטות להיות הומוגניות בהרכבן? האם משפחות מפוזרות על פני דורות רבים, או שהן מתחלקות לרוב באותו מספר פעמים? ניתוח גישוש זה צריך להיות משלים עם חלקות ספציפיות יותר ובדיקות סטטיסטיות. ניתן להשתמש בו כדי להעריך כמותית מחויבות גורל סימטרית וא-סימטרית, דיפרנציאציה ללא חלוקה, האיזון בין התחדשות עצמית להתבדלות, ומספר החלוקות עבור גורל מחויבות נתון. זה בסיסי, במהלך תכנון הניסוי, להגדיר את אורך תרבית התא בהתאם לסוג השאלה שנשאלה; לדוגמה, בשתי השאלות הראשונות (איזון סימטרי/א-סימטרי ודיפרנציאציה ללא חלוקה), תכנון צעדי תרבות קצרים מאוד מאפשר בידוד של מספר רב של משפחות שביצעו רק חלוקה אחת או כלל לא ביצעו חלוקה כלל26. לעומת זאת, ניסויים ארוכים יותר מאפשרים לחקור את מספר החלוקות הדרושות למחויבות תא מסוים, שכן הם דוגמים משפחות בשלבים שונים של התמיינות. עם זאת, שיטה זו אינה מיועדת לתרביות ארוכות טווח (2-3 שבועות), מכיוון שדילול צבע התא אינו מסוגל לעקוב במדויק אחר יותר משבע או שמונה חטיבות22. כתוצאה מכך, כלי זה מותאם בעיקר לחקר המחויבות המוקדמת של אבות hematopoietic, והוא לא נועד להסיק מסקנות מוצקות על תכונות התמיינות לטווח ארוך של תאים אלה.
המסגרת הסטטיסטית פותחה במיוחד לניתוח נתונים מסוג זה ומבוססת על הרעיון של תמורות26. זה היה הכרחי בגלל התצפית של תלות משפחתית על התפלגות סוג התא ועל מספר החטיבות שבוצעו. במילים אחרות, תאים שהם חלק מאותה משפחה נוטים יותר להציג פנוטיפים דומים ולהתחלק באותו מספר פעמים. בעוד ניתוח מעמיק הוא מעבר להיקף של עבודה זו, קבוצה מסופקת של בדיקות סטטיסטיות צריך להיות מספיק בעת הערכת תנאים שונים.
לסיכום, פרוטוקול זה מהווה כלי רב ערך להערכת הדינמיקה התאית של תאי גזע המטופויטיים ותאי אב ex vivo, בצורה מהירה וזולה. בשל גמישותו ורבגוניותו לגבי נקודת זמן, תנאי תרבית וסוג HSPCs שנותחו, הוא מאפשר לבדוק מגוון תנאי ניסוי. כניסוי מבוסס ציטומטריית זרימה, ניתן ליישם אותו ברוב המעבדות, והוא אינו דורש ידע מוקדם נרחב, מה שהופך אותו למועמד טוב לבדיקות סקר וניסויי פיילוט.

העשור האחרון עמד בסימן התפשטות עולמית של גישות חד-תאיות לביולוגיה תאית ומולקולרית. בעקבות השלבים של גנומיקה של תא בודד1,2, כיום ניתן לחקור מרכיבים רבים של תא בודד (למשל, DNA, RNA, חלבונים), עם טכניקות חדשניות של תא בודד -omics המתפתחות מדי שנה. טכניקות אלה שפכו אור על שאלות ישנות וחדשות בתחומי האימונולוגיה, נוירוביולוגיה, אונקולוגיה ועוד, הן באמצעות תאי אורגניזם אנושיים והן באמצעות תאי אורגניזם מודל3. על ידי הדגשת ההבדלים בין תאים בודדים, תא בודד -omics הניע את ההגדרה של מודל חדש של hematopoiesis, שבמרכזו ההטרוגניות של תאי גזע ותאי אב hematopoietic (HSPCs) והתרחקות מהמודל הקלאסי של אוכלוסיות הומוגניות בדידות 4,5.
אחד החסרונות המעטים של כל טכניקות -omics הוא הרס התא של עניין, מניעת האפשרות להעריך את הפונקציונליות שלה. לעומת זאת, שיטות חד-תאיות אחרות, כגון בדיקת השתלה של תא בודד וטכנולוגיות למעקב אחר שושלת, מספקות קריאה של הפונקציונליות של תא האב הקדמון על ידי הערכת גורלם של תאים בודדים in vivo 6,7. טכנולוגיות מעקב אחר שושלת כוללות תיוג התא המעניין עם גנטיקה תורשתית7 או תווית פלואורסצנטית8,9, מה שמאפשר לעקוב אחר גורלם של תאים בודדים מרובים בו זמנית. עם זאת, אפיון התאים ההתחלתיים מוגבל בדרך כלל למספר מוגבל של פרמטרים, כגון ביטוי של כמה חלבוני שטח המוערכים על ידי ציטומטריית זרימה10. בנוסף, טכנולוגיות מעקב אחר שושלת חד-תאית דורשות זיהוי מייגע של התווית התאית, בדרך כלל באמצעות ריצוף DNA/RNA או הדמיה. נקודה אחרונה זו מגבילה במיוחד את מספר התנאים שניתן לבחון בניסוי יחיד.
סוג נוסף של שיטות המשמשות לחקר הפונקציונליות של תאים בודדים הן מערכות תרבית תאים ex vivo של HSPCs בודדים. קל לבצע, בדיקות תקן זהב אלה כוללות מיון של תאים בודדים לתוך 96-בארות כלי תרבית התא, ולאחר תרבית, אפיון פנוטיפ צאצאי התא, בדרך כלל על ידי ציטומטריה זרימה או ניתוח מורפולוגי. בדיקות אלה שימשו בעיקר כדי לאפיין את ההתמיינות ארוכת הטווח של HSPCs לתאים בוגרים, בדרך כלל לאחר 2-3 שבועות של תרבית11,12. לחלופין, הם שימשו כדי לנסות לשמר ולהרחיב את Ex vivo HSPCs 13,14,15,16,17,18, עם הבטחה לתועלת רפואית להשתלת תאי גזע אנושיים 19. לבסוף, הם שימשו לחקר המחויבות המוקדמת של HSPCs באמצעות תרבית לטווח קצר20, כאשר המספר הנמוך של תאים שנוצרו בתרבית זו הוא הגורם המגביל העיקרי. חסרון אחד של סוגים שונים אלה של מבחני ex vivo הוא שהם משקפים רק באופן חלקי את מורכבות in vivo; ובכל זאת, הם אחת הדרכים הנדירות לחקור התמיינות HSPC אנושית.
פיסת מידע אחת חסרה משיטות קיימות של תא בודד (אומיקה של תא בודד, מעקב אחר שושלת ותרבית ex vivo) היא זיהוי מדויק של חלוקות תאים, פרמטר חיוני שיש לקחת בחשבון כאשר חוקרים דינמיקה של HSPC21. דרך פשוטה להעריך את מספר החלוקות באמצעות ציטומטריית זרימה היא שימוש ב"צבעי חלבון" מסיסים, כמו 5-(ו-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)22. צבעי חלוקה אלה מתפזרים בתוך הציטופלסמה של התאים המוכתמים, מדוללים בחצי ומועברים לשני תאי הבת בכל חלוקת תא, מה שמאפשר למנות עד 10 חלוקות. שילוב של מספר צבעי חלוקה, ניתן לזרוע מספר אבות בודדים באותה באר, שכן כל צבע בודד מאפשר הפרדה בין הצאצאים השונים. זהו העיקרון מאחורי השימוש בצבעי תאים למעקב אחר שיבוט וחלוקה מרובה שהוצג לראשונה עבור לימפוציטים מורינים23,24.
כאן, אנו מציגים את הפיתוח של בדיקת MultiGen לשימוש עם HSPCs מורין ובני אדם. הוא מאפשר בדיקה של תאים בודדים רבים בו זמנית עבור תכונות ההתמיינות, החלוקה והקרבה שלהם ex vivo. בדיקה זו, בעלת תפוקה גבוהה, קלה לביצוע וזולה זו מאפשרת למדוד את הפנוטיפ התאי, את מספר החלוקות שבוצעו, ואת קרבת התאים ויחסי השבט עם התאים האחרים בבאר, והכל בו זמנית. ניתן להשתמש בו כדי להעריך כמותית מחויבות גורל סימטרית וא-סימטרית, את האיזון בין התחדשות עצמית לבין דיפרנציאציה, ואת מספר החלוקות הדרושות לגורל מחויבות נתון. הפרוטוקול דורש ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) וציטומטר זרימה עם קורא לוחות, בתוספת הציוד הדרוש לביצוע תרבית תאים. בנוסף לפרוטוקול הטכני לביצוע הבדיקה על HSPCs אנושיים, אנו מספקים גם את מסגרת הניתוח המפורטת, כולל הבדיקות הסטטיסטיות הדרושות להערכת תכונות תאיות הקשורות למושג משפחת תאים25. פרוטוקול זה כבר שימש בהצלחה לתיאור תא HSPC מורין26,27.
הפרוטוקול הבא משתמש בתאי CD34+ מועשרים מגנטית כחומר המוצא28. בדרך זו, ניתן להכתים ולבודד ביעילות את HSPCs האנושיים ממקורות דם שונים (למשל, דם טבורי, מח עצם, דם היקפי). חשוב לא להשליך את שבר CD34, מכיוון שהוא ישמש כחלק מהפרוטוקול להגדרת סוגים שונים של בקרות ניסיוניות. ניתן להגדיל או להקטין את כמויות התאים והנפחים שהוזכרו, בהתאם לזרימת העבודה הניסיונית ולצרכים. באופן דומה, ניתן להתאים את הפרוטוקול לחקר סוגים שונים של אבות, פשוט על ידי שינוי הנוגדנים המשמשים למיון התאים ולשלבי ציטומטריית הזרימה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom culture plate&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Lin APC</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-7776-72</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA III</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace Violet (CTV)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62948-36</td>
			<td>Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block Fc1.3216</td>
			<td>BD</td>
			<td>564220</td>
			<td>Dilution 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>S1900-500C</td>
			<td>Batch S00CH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.1</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312216</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3</td>
			<td>BD</td>
			<td>564195</td>
			<td>Dilution 1/15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343513</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>356620</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560673</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560675</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory prepared</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells

טכניקות מעטות יכולות להעריך פנוטיפ וגורל עבור אותו תא בו זמנית. רוב הפרוטוקולים הנוכחיים המשמשים לאפיון פנוטיפ, למרות שהם מסוגלים ליצור מערכי נתונים גדולים, מחייבים את הרס התא המעניין, מה שהופך אותו לבלתי אפשרי להעריך את גורלו התפקודי . לכן קשה לתאר מערכות התמיינות ביולוגיות הטרוגניות כמו המטופויזה. בהתבסס על צבעי מעקב אחר חלוקת תאים, פיתחנו פרוטוקול לקביעת קרבה, מספר חלוקה ומצב התמיינות בו זמנית עבור אבות המטופויטיים בודדים רבים. פרוטוקול זה מאפשר להעריך את פוטנציאל התמיינות ex vivo של אבות המטופויטיים מורינים ובני אדם, מבודדים ממקורות ביולוגיים שונים. יתר על כן, מכיוון שהוא מבוסס על ציטומטריית זרימה ומספר מוגבל של ריאגנטים, הוא יכול לייצר במהירות כמות גדולה של נתונים, ברמת התא הבודד, באופן זול יחסית. אנו מספקים גם את הצינור האנליטי לניתוח תא יחיד, בשילוב עם מסגרת סטטיסטית חזקה. מכיוון שפרוטוקול זה מאפשר קישור של חלוקת תאים והתמיינות ברמת התא הבודד, ניתן להשתמש בו כדי להעריך כמותית מחויבות גורל סימטרית וא-סימטרית, את האיזון בין התחדשות עצמית להתמיינות, ואת מספר החלוקות עבור גורל מחויבות נתון. בסך הכל, פרוטוקול זה יכול לשמש בתכנונים ניסיוניים שמטרתם לפענח את ההבדלים הביולוגיים בין אבות המטופויטיים, מנקודת מבט של תא יחיד.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

מוצגת כאן טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה המאפשרת למדוד בו זמנית את מספר חלוקות התא, פנוטיפ תאי פני השטח וקרבה תאית. ניתן לבדוק תכונות אלה באופן סטטיסטי באמצעות מסגרת מבוססת תמורות.

הערכה סימולטנית של קרבה, מספר חלוקה ופנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה עבור תאי גזע המטופויטיים ותאי אב

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

שיטות מעטות מאפשרות להעריך במהירות את הפונקציונליות של אבות hematopoietic. פרוטוקול זה מודד את ההשפעה של חלוקות התאים הראשונות על גורל התא ומחויבותו. פרוטוקול זה מאפשר למדוד בו זמנית חלוקה והתמיינות ברמת תא בודד ובתפוקה גבוהה ללא צורך במניפולציה מורכבת ונרחבת.שיטה זו מתאימה לכל אוכלוסייה המטופויטית שניתן לשמור עליה בתרבית. כך שניתן ליישם אותו בקלות בביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה וביולוגיה התפתחותית. כדי להתחיל, aliquot 250 מיקרוליטר של CD34 + חלק שווה בארבעה צינורות פוליפרופילן 15 מיליליטר.תייג את הצינורות כמתואר בכתב היד של הטקסט. Aliquot 250 מיקרוליטר של שבר CD34 לתוך עוד ארבעה צינורות פוליפרופילן 15 מיליליטר לתייג את הצינורות. הכן פתרונות CFSE גבוהים ונמוכים CSFE כמתואר בכתב היד של הטקסט.הוסף 250 מיקרוליטר של התמיסה הגבוהה CFSE לצינור CF ו- CV, 250 מיקרוליטר של התמיסה הנמוכה CFSE לצינור VC, ו- 250 מיקרוליטר של מדיום הנשר המותאם של דולבקו, או DMEM, ללא נסיוב בקר עוברי, או FBS, לצינור VI. כדי להבטיח שילוב יעיל של תרחיף תאים בצבע התא, הטה את הצינור ב -90 מעלות והפקיד את תמיסות CFSE על דופן הצינור. לאחר מכן, החזק את הצינור במאונך וערבב שלוש או ארבע פעמים כדי להבטיח ערבוב מהיר של תמיסות CFSE עם התאים המרחפים מחדש.לדגור על המתלה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות. לאחר הדגירה, להוסיף חמישה מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS ומניחים את הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. סובב את הצינורות ב 300 גרם במשך חמש דקות.הסר את supernatant באמצעות שאיפה מבלי להפריע את הגלולה ולשטוף את הגלולה עם חמישה מיליליטר של PBS, ETDA. סובבו שוב את הצינורות והשליכו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב-40 מיקרוליטר של PBS, ETDA. כדי להכתים את תאי CD34+, הכינו תערובת אב של נוגדנים לתוך צינור יחיד של 0.5 מיליליטר.הוסף שבעה מיקרוליטרים מתערובת האב של הנוגדנים לכל אחד מארבעת תנאי CD34+. השהה מחדש את התאים במאגר צביעה באמצעות כ -500 מיקרוליטר כל אחד עבור החרוזים בתאי CD34 + ומיליליטר אחד עבור צינורות CD34. למיון תאים, הגדר את אסטרטגיית ה- gating על-ידי יצירת דיאגרמות התוויית נקודות.ראשית, דמיינו את התאים בתרשים נקודות FSCA לעומת SSCA ולחצו לחיצה כפולה על כלי ה-Polygon gating כדי לבחור את האוכלוסייה עם פיזור צד נמוך. תייג שער חדש זה שנוצר כתאים. בתרשים הנקודות הבא, FSCA לעומת FSCH, לחץ לחיצה ימנית על העלילה ובחר את תאי השער מהתפריט הנפתח על ידי לחיצה עליו.השתמש באותו כלי gating כדי לבחור אוכלוסייה הדוקה באלכסון בין שני הצירים. תייג שער זה כתאים בודדים. בתרשים הנקודה השלישית, APC לעומת FSH-H, מציגים את האוכלוסייה תאים בודדים ומשערים את התאים שליליים לביטוי שושלת APC.תייגו אוכלוסייה חדשה זו כשושלת שלילית. בחלקה הרביעית, CFSE לעומת CTV, מציגים את האוכלוסייה שלילי ויוצרים ארבעה שערים נפרדים, אחד לכל שילוב צבעים. שער VI מוצג כאן כדוגמה.השתמש במגרשים החמישי והשישי כדי לזהות את אבות העניין. שער נדיב CD34 + CD38 אוכלוסייה ו CD34 + CD38 + בחלקה החמישית. לאחר מכן, בחר את אוכלוסיית CD34 + CD38 בחלקה השישית וצייר שלושה שערים עבור LMPP, HSC ו- MPP.הפעל את CD34 + שברים, הקלטת לפחות 5, 000 אירועים בשער התא היחיד. התאימו את השער לכל שילוב צבעים, והציבו שער הדוק לבחירת אוכלוסייה הומוגנית. הכן את תבנית מיון הלוחות באמצעות פריסת מיון ניסוי.הבארות בשם CD34-מכילות 5, 000 עד 10, 000 תאים ממוינים על CF, CV, VC, VI שער. הבארות בתפזורת מכילות 500 תאים ממוינים על השער CD34+CD38 - הבארות הבודדות מכילות רק אירוע אחד לכל שילוב צבע חלוקת תאים לכל באר, כך שבסך הכל ארבעה אירועים לכל באר. לאחר מכן, התחל עם מיון CD34-CF במצב טוהר תשואה.לחץ על כפתור לרכוש ולאחר מכן על למיין לחצן. לחץ על Acquire, ולאחר מכן על הלחצן Sort וודא שסימן 0160 כציון טוהר. לבסוף, מיין את התאים המעניינים, תא אחד לכל באר, בטוהר תא בודד, וודא שסימנו את אפשרות מיון המדדים.צנטריפוגו את הצלחת ב-300 גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנאטנט על ידי היפוך מהיר של הצלחת מתחת למכסה המנוע מעל מגבת נייר. הוסף שמונה מיקרוליטר של חיץ עומד לבארות A1 עד A4, ולאחר מכן הוסף שמונה מיקרוליטר של תערובת לבארות האחרות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חיץ צביעה לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.צנטריפוגה ולהסיר את supernatant לפני resuspending את התאים ב 85 מיקרוליטר של חיץ צביעה. התחל את הניתוח על ציטומטר הזרימה במצב רכישה באמצעות התבנית הייעודית ולחץ על מותאם אישית. לאחר בחירת הפלואורופורים המעניינים מהרשימה, הגדר את הגדרת הלוח בהתאם לתבנית הלוח שתוקנה למספר הבארות המכילות תא אחד לפחות.סמן את האפשרות Agitation ובחר 100 מיקרוליטר כמגבלת נפח הרכישה. לאחר מכן, הגדר את קצב הרכישה לא עדיף על מיקרוליטר אחד לשנייה, כמו מהירות נמוכה יותר משפר את הנפח הכולל מנותח לכל באר. לגידור מייצג, שרשרו את הבארות השונות בתפזורת בקובץ יחיד.לאחר לחיצה על האפשרות Concatenate Populations, בחר All uncompensated parameters מתפריט Parameters, ולאחר מכן לחץ על Concatenate. העלה את הקובץ המשורשר לסביבת העבודה, ולאחר מכן החל את מטריצת הפיצוי באמצעות גרירה ושחרור. תוויות תאים עם CV ו- VC זקוקות לערך שעבר טרנספורמציה.לחץ על Tools and Derive Parameter כדי לקבל את הערך שהומר. הדבק את הנוסחה שצוינה בתיבת הנוסחאות. החילו את הגאטינג על כל צבע בנפרד כתרשים היסטוגרמה.עבור CF ו- VI, הגדר את CFSE-A ו- CTV-A על ציר X, בהתאמה. עבור CV ו- VC, הגדר את הפרמטר הנגזר החדש על ציר X, ולאחר מכן הגדר שערים המתאימים לכל שיא. החל את gating על כל תא בודד היטב.הקפד להוסיף את הפרמטר הנגזר לכל באר מנותחת. אמת ידנית כל שער צבע עבור כל באר כדי לזהות אירועים שהוקצו באופן שגוי לשיא נתון. ניתוח ציטומטריית זרימה לאחר תרבית תאים דורש gating מדויק כדי לקבוע את הקרבה של כל תא בודד יחד עם פנוטיפ התא.הגדרת שיא והקצאה הם היבטים מכריעים של ניתוח ציטומטריית זרימה. ההיסטוגרמות מציגות שתי דוגמאות למשפחות המפוזרות על פסגות מרובות, אחת משתי פסגות עוצמה דומות ואחת עם שתי פסגות עוצמה שונות. סוגים שונים של ייצוג נתונים ובדיקות סטטיסטיות מוצגים כאן עבור שני ניסויים נפרדים שבוצעו לאחר 72 שעות עבור HSCs ו- MPPs.מפת החום של התמיינות HSC מייצגת משפחות תאים שונות, הן בגורלות התא והן בחלוקות התא. ההיסטוגרמה המשווה את גורלן של משפחות תאים נגזרות מ-HSCs ו-MPPs מוצגת כאן. עבור שני סוגי התאים, ההשוואה בין התנאי GT לבין התמיינות התנאים מוצגת יחד עם הבדיקות הסטטיסטיות שבוצעו עבור MPPs.היסטוגרמות המשוות את אחוז משפחות התאים לדור ואת סוג הסימטריה או הא-סימטריה בגורל עבור החלוקה הראשונה מוצגות כאן. חלוקת הגורלות לדור עבור MPPs והבדלי התנאים מוצגים כאן. הליך זה דורש לבודד תאים בכמויות גדולות כדי להגדיר את אסטרטגיית gating המתאימה.לכן עדיף להתחיל את מכתים עם לפחות 10, 000 תאים. שילוב שיטה זו עם מדידה רציפה, כמו תאים חיים שמדמיינים, יכול להיות חזק מאוד, שכן שניהם יחד יכולים לספק תיאור מפורט של האבות המוקדמים של הדינמיקה של התא. גישה זו פותחה לראשונה עבור ביולוגיה של תאי T על ידי מעבדות הופקינס.גרסה זו, המותאמת לתאי גזע בדם, מתרחבת כעת לסרטן ולביולוגיה של תאי גזע.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...