Name: simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00
Duration: 10 min 20 s
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유세포 분석 실험을 설정하는 데 도움을 주신 퀴리 유동 시설 연구소 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 여러 토론을 통해 Team Perié의 다른 구성원들의 기여에 감사를 표하고 싶습니다. 림프구에서 세포 분열 염료의 다중화 프로토콜을 공유해 주신 Julia Marchingo 박사와 Phil Hodgkin 교수(Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research)에게 감사드립니다. 이 프로토콜의 개발에 필요한 생물학적 자원을 제공한 세인트루이스 병원 제대혈 바이오뱅크에 감사드립니다. 이 연구는 CNRS 및 Bettencourt-Schueller Foundation의 ATIP-Avenir 보조금(LP에게), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038)(LP 및 AD에게), Idex Paris-Science-Lettres Program(ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)(LP에게), Canceropole INCA Emergence(2021-1-EMERG-54b-ICR-1, LP에게) 및 ITMO MIIC 보조금(21CM044, LP에게). 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 ERC StG 758170-Microbar(LP까지)에 따라 유럽 연구 위원회(ERC)의 자금 지원과 함께 AD는 Fondation de France의 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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MultiGen 분석은 림프구 23,24,35 및 쥐 조혈 세포 26,27을 연구하는 데 중요한 역할을 하는 고처리량, 수행하기 쉽고 비용이 많이 드는 분석법입니다. 여기에서 우리는 단기 배양을 사용하여 단일 세포 수준에서 인간 HSPC 투입의 초기 단계를 생체 외에서 해독할 수 있는 접근 방식의 새로운 개발을 제시합니다(그림 6). 단일세포 생체외 배양 시스템은 일반적으로 HSPC의 성숙한 세포로의 장기적인 운명을 평가하는 데 사용되지만, 일부 운명은 다른 운명보다 일찍 발생한다(36), 잠재적으로 더 적은 운명으로 분석이 편향될 수 있다. 또한 이러한 문화 시스템은 일반적으로 운명 약속 중에 분열에 대한 정보를 놓치고 있습니다. 첫 번째 헌신 단계는 문화가 시작될 때부터 발생하는 것으로 나타났으며, 때로는 분열26,37 없이 발생하는 것으로 나타났으며, 이는 초기 운명 헌신을 연구하는 데 단기 문화와 추적 분열을 필수적으로 만듭니다. 운명, 분열 및 친족 관계를 동시에 추적함으로써 이 분석을 통해 인간 HSPC에서 첫 번째 분열과 운명 결정의 역할을 이해할 수 있습니다. 이 분석을 사용하면 헌신 과정이 얼마나 많은 분열이 발생하는지, 초기 선조에 대한 자기 재생과 차별화 사이의 균형, 그리고 이러한 속성이 세대에 걸쳐 어떻게 상속되는지 추론 할 수 있습니다. 우리가 아는 한, 이것은 단일 세포 분해능에서 인간 HSPC에 대해 이러한 유형의 측정을 허용하는 유일한 분석법입니다. 또한 세포 분열 염료의 다양한 조합을 사용하여 분석 처리량을 증가시켜 이 분석을 대규모 데이터 세트를 빠르게 생성하는 데 유용한 도구로 만들었습니다. 염료 조합을 사용하면 동일한 웰에서 여러 패밀리를 추적할 수 있어 단기 배양에서 분석에 사용할 수 있는 세포의 수를 늘릴 수 있습니다. 다른 염료(예: 노란색 염료)를 추가하거나 CFSE와 CTV의 비율을 수정하여 조합의 수를 잠재적으로 훨씬 더 늘릴 수 있습니다. 그러나 이렇게 하면 분석할 수 있는 다른 매개변수의 수가 줄어듭니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> 그림 6: 프로토콜의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
분석을 성공적으로 수행하려면 많은 수의 웰과 분석할 세포 수가 감소하기 때문에 플레이트 리더가 장착된 분석기에서 유세포 분석을 실행해야 합니다. 차세대 벤치 분석기는 특히 이 분석에 적합한데, 대부분의 분석기는 세포 손실 비율을 줄이기 위해 데드 부피가 더 작기 때문입니다. 이는 차례로 각 웰 전체를 회수할 때 더 높은 효율을 보장하며, 70% 범위(26)에서 추정된 효율을 유도한다. 유세포 분석 획득 중 세포 손실을 추정하는 것은 각 개별 패밀리의 분석에 매우 중요합니다. 예를 들어, 세포 사멸이 없다고 가정하고 분열 횟수를 계수하면 각 패밀리당 세포 수를 추정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 일부 확증 실험, 특히 시험된 배양 조건에서 세포 사멸의 추정 및 정의된 수의 세포를 사용하여 실험적으로 회수율을 측정하는 것이 바람직하다.
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 피크 할당입니다. 이미 언급했듯이, 양질의 피크 분포는 세포 분류에서 매우 좁은 피크의 분리에 크게 의존합니다. 그럼에도 불구하고 분포에 따라 고유한 수의 나눗셈을 할당하는 것은 여전히 어렵습니다. 세포 분류 및 유세포 분석은 서로 다른 두 대의 기계에서 수행되기 때문에 각 신호의 강도를 직접 비교할 수 없으므로 히스토그램의 오른쪽 끝에서 관찰된 첫 번째 피크가 피크 0인지 피크 1인지 알기 어려울 수 있습니다. 이와 관련하여 가능한 솔루션은 거의 없습니다. 한 가지 방법은 이들 세포에 의해 수행되는 분열의 수를 정확하게 측정하기 위해 직교 실험을 수행하는 것이다 (예를 들어, 살아있는 세포 이미징). 또 다른 가능성은 유세포 분석을 실행하기 전에 도립 명시야 현미경으로 웰의 세포 수를 간단히 계산하는 것입니다. 이것은 평균 분열 수를 추론할 것입니다(세포 사멸이 없다고 가정). 마지막으로, 피크 할당을 위한 사후 솔루션은 비정상적인 수의 "불가능한 패밀리"를 감지하는 것입니다. 이러한 패밀리는 세대당 가능한 수보다 많은 수의 세포로 구성됩니다(예: 2세대의 5개 세포 또는 1세대의 2개 세포 및 2세대의 1개 세포). 불가능한 패밀리를 제외할 수 있는 가능성은 통계 분석 단계에서 코딩되며 불가능한 패밀리에 플래그를 지정합니다. 이러한 오류의 발생률이 너무 높으면 피크 할당을 수정해야 한다고 가정하는 것이 합리적입니다.
이 프로토콜에서, 우리는 분석을 위한 데이터 표현 및 분석의 몇 가지 예를 포함시켰는데, 이는 이것이 대규모 데이터 세트의 생성 및 해석에 필수적인 단계가 되었기 때문이다38. 첫 번째 예는 패밀리별로 구성된 분석된 모든 셀의 전체를 보여주는 히트맵입니다. 이것은 데이터의 일반적인 특성과 잠재적 결론을 탐색하는 효율적인 도구입니다 : 가족은 여러 세포 유형으로 구성되어 있습니까, 아니면 구성이 균질한 경향이 있습니까? 가족이 여러 세대에 걸쳐 분산되어 있습니까, 아니면 대부분 같은 횟수로 나누고 있습니까? 이 탐색적 분석은 보다 구체적인 플롯과 통계 테스트로 보완되어야 합니다. 대칭 및 비대칭 운명 헌신, 분열 없는 분화, 자기 갱신과 분화 사이의 균형, 주어진 약속 운명에 대한 분열의 수를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 실험 계획 중에 질문 유형에 따라 세포 배양 길이를 설정하는 것이 기본입니다. 예를 들어, 처음 두 가지 질문(대칭/비대칭 균형 및 분할 없는 미분)의 경우 매우 짧은 배양 단계를 계획하면 분할을 하나만 수행하거나 전혀 수행하지 않은 많은 수의 가족을 격리할 수 있습니다26. 반대로, 더 긴 실험을 통해 분화의 여러 단계에서 가족을 샘플링하기 때문에 특정 세포 투입에 필요한 분열 수를 탐색할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 세포 염료 희석이 7개 또는 8개 이상의 분열을 정확하게 추적할 수 없기 때문에 장기 배양(2-3주)을 위해 설계되지 않았다22. 결과적으로, 이 도구는 대부분 조혈 전구체의 초기 헌신을 연구하는 데 적합하며 이러한 세포의 장기 분화 특성에 대한 강력한 결론을 내리도록 설계되지 않았습니다.
통계적 틀은 이러한 유형의 데이터 분석을 위해 특별히 개발되었으며 순열26의 개념을 기반으로 합니다. 이것은 세포 유형 분포와 수행 된 분열 수에 대한 가족 의존성을 관찰했기 때문에 필요했습니다. 즉, 동일한 패밀리에 속하는 세포도 유사한 표현형을 나타내고 동일한 횟수로 분열할 가능성이 더 큽니다. 심층 분석은 이 작업의 범위를 벗어나지만 다양한 조건을 평가할 때 제공된 통계 테스트 세트로 충분해야 합니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 생체 외에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 세포 역학을 빠르고 저렴한 방식으로 평가하기 위한 귀중한 도구를 구성합니다. 시점, 배양 조건 및 분석된 HSPC 유형에 대한 유연성과 다양성으로 인해 다양한 실험 조건을 테스트할 수 있습니다. 유세포 분석 기반 분석법으로 대부분의 실험실에서 구현할 수 있으며 광범위한 사전 지식이 필요하지 않아 스크리닝 및 파일럿 실험에 적합합니다.

지난 10년 동안 세포 및 분자 생물학에 대한 단일 세포 접근법이 전 세계적으로 확산되었습니다. 단세포 유전체학1,2의 단계에 따라 오늘날에는 매년 급증하는 새로운 단세포 오믹스 기술을 통해 단일 세포의 많은 구성 요소(예: DNA, RNA, 단백질)를 연구할 수 있습니다. 이러한 기술은 면역학, 신경생물학, 종양학 등의 분야에서 인간과 모델 유기체 세포를 사용하는 오래된 질문과 새로운 질문을 제시해 주었다3. 개별 세포 간의 차이점을 강조함으로써 단일 세포 오믹스는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 이질성을 중심으로 하고 분리된 동종 집단의 고전적 모델에서 벗어나 조혈의 새로운 모델의 정의를 촉발했습니다 4,5.
모든 오믹스 기법의 몇 가지 단점 중 하나는 관심 있는 세포가 파괴되어 기능을 평가할 수 없다는 것입니다. 반대로, 단일 세포 이식 분석 및 혈통 추적 기술과 같은 다른 단일 세포 방법은 생체 내에서 개별 세포의 운명을 평가함으로써 조상 세포의 기능에 대한 판독을 제공합니다 6,7. 혈통 추적 기술은 관심 있는 세포에 유전적 유전자 라벨(heritable genetic label)7 또는 형광 라벨(fluorescent label)8,9을 붙여서 여러 단일 세포의 운명을 동시에 추적할 수 있도록 하는 것이다. 그러나, 출발 세포의 특성화는 전형적으로 유세포 분석에 의해 평가된 몇 가지 표면 단백질의 발현과 같은 제한된 수의 파라미터로 제한된다10. 또한 단일 세포 계통 추적 기술은 일반적으로 DNA/RNA 시퀀싱 또는 이미징을 통해 세포 라벨을 힘들게 검출해야 합니다. 특히 이 마지막 점은 단일 실험에서 테스트할 수 있는 조건의 수를 제한합니다.
단일 세포의 기능을 연구하는 데 사용되는 또 다른 종류의 방법은 단일 HSPC의 생체 외 세포 배양 시스템입니다. 수행하기 쉬운 이러한 골드 스탠더드 분석에는 개별 세포를 96웰 세포 배양 용기로 분류하고 배양 후 일반적으로 유세포 분석 또는 형태학적 분석을 통해 세포 자손 표현형을 특성화하는 작업이 포함됩니다. 이들 분석은 주로 HSPC의 성숙 세포로의 장기 분화를 특성화하기 위해 사용되어 왔으며, 전형적으로 배양 2-3주 후에이루어졌다 11,12. 대안적으로, 이들은 인간 줄기 세포 이식에 대한 의학적 이점을 약속하면서 생체 외 HSPCs 13,14,15,16,17,18을 유지하고 확장하는 데 사용되어 왔다 19. 마지막으로, 그들은 단기 배양20을 사용하여 HSPC의 초기 투입을 연구하는 데 사용되었으며, 이 배양에서 생성되는 적은 수의 세포가 주요 제한 요인입니다. 이러한 다양한 종류의 생체 외 분석의 한 가지 단점은 생체 내 복잡성을 부분적으로만 반영한다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 그들은 인간 HSPC 분화를 연구하는 드문 방법 중 하나입니다.
기존의 단일 세포 방법(단일 세포 오믹스, 계통 추적 및 생체 외 배양)에서 누락된 정보 중 하나는 HSPC 역학21을 연구할 때 고려해야 할 필수 매개변수인 세포 분열의 정확한 감지입니다. 유세포 분석을 통해 분열 수를 평가하는 간단한 방법은 5-(및 6)-카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)22와 같은 가용성 "단백질 염료"를 사용하는 것입니다. 이러한 분열 염료는 염색된 세포의 세포질 내부로 확산되고 절반으로 희석되어 모든 세포 분열에서 두 딸 세포로 전달되어 최대 10개의 분열을 열거할 수 있습니다. 여러 분할 염료를 결합하면 각 개별 염료가 서로 다른 자손을 분리 할 수 있기 때문에 동일한 우물에 여러 개의 개별 전구체를 뿌릴 수 있습니다. 이것은 쥐 림프구에 처음 도입된 다중 클론 및 분열 추적을 위한 세포 염료 사용의 원리입니다23,24.
여기에서는 쥐 및 인간 HSPC와 함께 사용하기 위한 MultiGen 분석의 개발을 제시합니다. 이를 통해 생체 외에서 분화, 분열 및 친족 관계에 대해 많은 단일 세포를 동시에 테스트할 수 있습니다. 이 고처리량, 수행하기 쉽고 저렴한 분석을 통해 세포 표현형, 수행된 분열 수, 웰의 다른 세포와의 세포 친족 관계 및 클론 관계를 동시에 측정할 수 있습니다. 대칭 및 비대칭 운명 헌신, 자기 갱신과 차별화 사이의 균형, 주어진 헌신 운명에 필요한 분할 수를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 형광 활성화 세포 분류기(FACS)와 플레이트 리더가 있는 유세포 분석기, 그리고 세포 배양을 수행하는 데 필요한 장비가 필요합니다. 인간 HSPC에 대한 분석 실행을 위한 기술 프로토콜 외에도 세포 패밀리25의 개념과 관련된 세포 특성을 평가하는 데 필요한 통계적 테스트를 포함하여 상세한 분석 프레임워크를 제공합니다. 이 프로토콜은 이미 뮤린 HSPC 격실26, 27을 기술하는데 성공적으로 사용되었다.
하기 프로토콜은 자기적으로 농축된 CD34+ 세포를 출발 물질로서 사용한다28. 이러한 방식으로, 상이한 혈액 공급원 (예를 들어, 제대혈, 골수, 말초 혈액)으로부터 인간 HSPC를 효율적으로 염색하고 단리할 수 있다. CD34- 분획은 상이한 유형의 실험 대조군을 설정하기 위한 프로토콜의 일부로서 사용될 것이기 때문에 폐기하지 않는 것이 중요하다. 언급된 세포의 양과 부피는 실험 작업 흐름과 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있습니다. 유사하게, 이 프로토콜은 세포 분류 및 유세포 분석 단계에 사용되는 항체를 간단히 수정함으로써 다양한 유형의 전구체 연구에 적용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom culture plate&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Lin APC</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-7776-72</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA III</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace Violet (CTV)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62948-36</td>
			<td>Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block Fc1.3216</td>
			<td>BD</td>
			<td>564220</td>
			<td>Dilution 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>S1900-500C</td>
			<td>Batch S00CH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.1</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312216</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3</td>
			<td>BD</td>
			<td>564195</td>
			<td>Dilution 1/15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343513</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>356620</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560673</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560675</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory prepared</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells

동일한 세포에 대한 표현형과 운명을 동시에 평가할 수 있는 기술은 거의 없습니다. 표현형을 특성화하는 데 사용되는 현재 프로토콜의 대부분은 대규모 데이터 세트를 생성할 수 있지만 관심 세포의 파괴를 필요로 하므로 기능적 운명을 평가할 수 없습니다. 따라서 조혈과 같은 이질적인 생물학적 분화 시스템은 설명하기 어렵습니다. 세포 분열 추적 염료를 기반으로 우리는 많은 단일 조혈 전구체에 대한 혈연 관계, 분열 수 및 분화 상태를 동시에 결정하는 프로토콜을 추가로 개발했습니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 공급원으로부터 분리된 쥐 및 인간 조혈 전구체의 생체 외 분화 가능성을 평가할 수 있습니다. 또한 유세포 분석과 제한된 수의 시약을 기반으로 하기 때문에 비교적 저렴한 방식으로 단일 세포 수준에서 많은 양의 데이터를 빠르게 생성할 수 있습니다. 또한 강력한 통계 프레임워크와 결합된 단일 세포 분석을 위한 분석 파이프라인을 제공합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 세포 분열과 분화의 연결을 허용하기 때문에 대칭 및 비대칭 운명 헌신, 자가 재생과 분화 사이의 균형, 주어진 약속 운명에 대한 분열 수를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 단일 세포 관점에서 조혈 전구체 간의 생물학적 차이를 밝히는 것을 목표로 하는 실험 설계에 사용할 수 있습니다.

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Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

조혈 전구 세포의 기능을 신속하게 평가할 수있는 방법은 거의 없습니다. 이 프로토콜은 첫 번째 세포 분열이 세포의 운명과 헌신에 미치는 영향을 측정합니다. 이 프로토콜을 사용하면 복잡하고 광범위한 조작 없이 단일 세포 수준에서 높은 처리량으로 분열과 분화를 동시에 측정할 수 있습니다.이 방법은 배양에서 유지 될 수있는 모든 조혈 집단에 적합합니다. 따라서 암 생물학, 면역학 및 발달 생물학에 쉽게 적용할 수 있습니다. 시작하려면 250 마이크로 리터의 CD34 + 분획을 4 개의 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 균등하게 분배합니다.텍스트 원고에 설명된 대로 튜브에 라벨을 붙입니다. CD34 분획 250마이크로리터를 다른 4개의 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 분취하고 튜브에 라벨을 붙입니다. 텍스트 원고에 설명 된대로 CFSE high 및 CSFE low 솔루션을 준비하십시오.CF 및 CV 튜브에 CFSE 고용액 250마이크로리터, VC 튜브에 CFSE 저용액 250마이크로리터, 소 태아 혈청(FBS)이 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 250마이크로리터를 VI 튜브에 추가합니다. 세포 염료에서 세포 현탁액의 효율적인 혼합을 보장하려면 튜브를 90도 기울이고 CFSE 용액을 튜브 벽에 증착합니다. 그런 다음 튜브를 수직으로 잡고 3-4회 혼합하여 CFSE 용액과 재현탁된 셀이 빠르게 혼합되도록 합니다.현탁액을 섭씨 37도에서 8분 동안 배양합니다. 배양 후 10% FBS가 포함된 DMEM 5밀리리터를 추가하고 튜브를 섭씨 37도에서 5분 동안 놓습니다. 튜브를 300G에서 5분 동안 돌립니다.펠릿을 방해하지 않고 흡인을 통해 상청액을 제거하고 5밀리리터의 PBS, ETDA로 펠릿을 세척합니다. 튜브를 다시 회전시키고 펠릿을 40 마이크로리터의 PBS, ETDA에 재현탁하기 전에 상청액을 버립니다. CD34+세포를 염색하기 위해 항체의 마스터 믹스를 단일 0.5밀리리터 튜브에 준비합니다.항체 마스터 믹스의 7마이크로리터를 4개의 CD34+ 조건 각각에 추가합니다. CD34+ 세포의 비드에 대해 각각 약 500마이크로리터, CD34 튜브의 비드에 대해 각각 약 1밀리리터를 사용하여 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다. 셀 정렬의 경우 도트 플롯 다이어그램을 만들어 게이팅 전략을 설정합니다.먼저 FSCA와 SSCA 도트 플롯에서 셀을 시각화하고 폴리곤 게이팅 도구를 두 번 클릭하여 측면 산란이 낮은 모집단을 선택합니다. 새로 만든 이 게이트에 Cells라는 레이블을 지정합니다. 다음 도트 플롯 FSCA 대 FSCH에서 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 게이트 셀을 클릭하여 선택합니다.동일한 게이팅 도구를 사용하여 두 축 사이의 대각선에서 좁은 모집단을 선택합니다. 이 게이트에 단일 셀로 레이블을 지정합니다. 세 번째 점도표인 APC 대 FSH-H에서는 모집단 단일 세포를 표시하고 APC 계통의 발현에 대해 음성인 세포를 게이트합니다.새로 생성된 이 모집단을 Lineage Negative로 레이블을 지정합니다. 네 번째 그림 CFSE 대 CTV에서는 모집단 Lineage Negative를 표시하고 각 염료 조합에 대해 하나씩 4개의 개별 게이트를 만듭니다. 게이트 VI는 여기에 예시로 나와 있습니다.다섯 번째 및 여섯 번째 그림을 사용하여 관심 있는 선조를 식별합니다. 다섯 번째 플롯에서 CD34+CD38-모집단과 CD34+CD38+를 관대하게 게이트합니다. 그런 다음 여섯 번째 그림에서 CD34+CD38-모집단을 선택하고 LMPP, HSC 및 MPP에 대한 세 개의 게이트를 그립니다.CD34+fractions를 실행하여 단일 세포 게이트에 최소 5, 000개의 이벤트를 기록합니다. 각 염료 조합에 대한 게이트를 조정하고 균질한 모집단을 선택하기 위해 단단한 게이트를 설정합니다. 실험 정렬 레이아웃을 사용하여 플레이트 정렬 템플릿을 준비합니다.CD34로 명명된 웰은 CF, CV, VC, VI 게이트에 분류된 5, 000 내지 10, 000개의 세포를 함유한다. 벌크 웰은 게이트 CD34+CD38-단일 세포 웰 당 세포 분열 염료 조합 당 하나의 이벤트 만 포함하므로 웰 당 총 4 개의 이벤트를 포함합니다. 그런 다음 수율 순도 모드에서 CD34-CF를 분류하는 것부터 시작합니다.Acquire 버튼을 클릭한 다음 Sort 버튼을 클릭합니다. Acquire(획득)를 클릭한 다음 Sort(정렬) 버튼을 클릭하여 순도 등급으로 0160을 선택했는지 확인합니다. 마지막으로, 관심 있는 셀을 웰당 하나의 셀로 단일 셀 순도로 정렬하여 Index Sorting 옵션을 선택했는지 확인합니다.플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리하고 후드 아래의 플레이트를 종이 타월로 빠르게 뒤집어 상층액을 제거합니다. 8 마이크로리터의 스탠딩 버퍼를 웰 A1 내지 A4에 첨가하고, 이어서 8 마이크로리터의 혼합물을 다른 웰에 첨가한다. 다채널 피펫을 사용하여 웰 당 100 마이크로리터의 염색 완충액을 첨가하여 세포를 세척한다.원심분리하여 상층액을 제거한 후 세포를 85 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁시켰다. 전용 템플릿을 사용하여 Acquisition 모드에서 유세포 분석기에 대한 분석을 시작하고 Custom(사용자 지정)을 클릭합니다. 목록에서 관심 있는 형광단을 선택한 후 하나 이상의 셀을 포함하는 웰 수에 대해 수정된 플레이트 템플릿에 따라 플레이트 설정을 설정합니다.교반 옵션을 선택하고 획득 부피 제한으로 100마이크로리터를 선택합니다. 이어서, 획득 속도를 초당 1 마이크로리터로 우월하지 않게 설정하고, 속도가 낮을수록 웰 당 분석된 총 부피가 향상된다. 대표 게이팅의 경우, 서로 다른 벌크 웰을 단일 파일에 연결합니다.Concatenate Populations 옵션을 클릭한 후 Parameters 메뉴에서 All uncompensated parameters를 선택한 다음 Concatenate를 클릭합니다. 연결된 파일을 작업 공간에 업로드한 다음 드래그 앤 드롭을 통해 보정 매트릭스를 적용합니다. CV 및 VC가 있는 셀 레이블에는 변환된 값이 필요합니다.Tools and Derive Parameter(도구 및 매개변수 파생)를 클릭하여 변환된 값을 가져옵니다. 표시된 수식을 수식 상자에 붙여 넣습니다. 각 색상에 게이팅을 히스토그램 플롯으로 개별적으로 적용합니다.CF 및 VI의 경우 각각 X축에 CFSE-A 및 CTV-A를 설정합니다. CV 및 VC의 경우 X축에 새로 파생된 매개변수를 설정한 다음 각 피크에 해당하는 게이트를 설정합니다. 각 개별 단일 셀 웰에 게이팅을 적용합니다.파생된 파라미터를 분석된 모든 웰에 추가해야 합니다. 각 웰의 각 컬러 게이트를 수동으로 확인하여 지정된 피크에 잘못 할당된 이벤트를 감지합니다. 세포 배양 후 유세포 분석 분석에는 세포 표현형과 함께 각 개별 세포의 친족 관계를 확립하기 위해 정밀한 게이팅이 필요합니다.피크 정의 및 할당은 유세포 분석의 중요한 측면입니다. 히스토그램은 여러 피크에 퍼져 있는 패밀리의 두 가지 예를 보여주는데, 하나는 두 개의 유사한 강도 피크 중 하나이고 다른 하나는 두 개의 다른 강도 피크를 가지고 있습니다. HSC 및 MPP에 대해 72시간 후에 수행된 두 개의 개별 실험에 대해 다양한 유형의 데이터 표현 및 통계 테스트가 여기에 표시됩니다.조건 HSC 분화에 대한 히트 맵은 세포 운명과 세포 분열 모두에서 서로 다른 세포 패밀리를 나타냅니다. 운명 HSC와 MPP 유래 세포군을 비교하는 히스토그램이 여기에 나와 있습니다. 두 세포 유형 모두에 대해 조건 GT와 조건 분화 간의 비교가 MPP에 대해 수행된 통계적 테스트와 함께 표시됩니다.세대당 세포군의 비율과 첫 번째 분할에 대한 운명의 대칭 또는 비대칭 유형을 비교하는 히스토그램이 여기에 나와 있습니다. MPP의 세대당 운명 분포와 조건 차별화가 여기에 표시됩니다. 이 절차에서는 적절한 게이팅 전략을 설정하기 위해 셀을 대량으로 분리해야 합니다.따라서 적어도 10, 000 개의 세포로 염색을 시작하는 것이 좋습니다. 이 방법을 살아있는 세포가 상상하는 것과 같은 연속 측정과 결합하면 두 가지가 함께 세포 역학의 초기 전구체에 대한 자세한 설명을 제공할 수 있기 때문에 매우 강력할 수 있습니다. 이 접근법은 홉킨스 연구소 (Hopkins Labs)에 의해 T 세포 생물학을 위해 처음 개발되었습니다.혈액 줄기 세포에 적응 된이 버전은 현재 암 및 줄기 세포 생물학으로 확장되고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...