Name: simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer aos membros do Institut Curie Flow Facility por sua ajuda na montagem dos experimentos de citometria de fluxo. Queremos também agradecer as contribuições dos demais membros da Equipe Perié, durante múltiplas discussões. Agradecemos à Dra. Julia Marchingo e ao Prof. Phil Hodgkin (Walter End Eliza Hall Institute of Medical Research) por compartilharem seu protocolo de multiplexação de corantes de divisão celular em linfócitos. Agradecemos ao biobanco de sangue de cordão umbilical do hospital Saint Louis por fornecer os recursos biológicos necessários para o desenvolvimento deste protocolo. O estudo foi apoiado por uma bolsa ATIP-Avenir do CNRS e da Fundação Bettencourt-Schueller (para L.P.), subsídios do Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (para L.P. e A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (para L.P.), o Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, para L.P.) e o subsídio ITMO MIIC (21CM044, para L.P.). Além do financiamento do Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ERC StG 758170-Microbar (para L.P.), A.D. foi apoiado por uma bolsa da Fondation de France.

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Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse relevantes para este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e interpretação dos dados ou na decisão de submeter o trabalho para publicação.

O ensaio MultiGen é um ensaio de alto rendimento, fácil execução e baixo custo, que tem sido fundamental para o estudo de linfócitos23,24,35 e células hematopoéticas murinas 26,27. Aqui, apresentamos um novo desenvolvimento da abordagem que permite decifrar ex vivo a fase inicial do comprometimento humano do HSPC, em nível unicelular, usando cultura de curto prazo (Figura 6). Sistemas de cultura ex vivo de célula única são tipicamente usados para avaliar o destino a longo prazo de HSPCs em células maduras, mas alguns destinos ocorrem mais cedo do que outros36, potencialmente enviesando a análise para menos destinos. Além disso, esses sistemas de cultura geralmente perdem informações sobre divisões durante o compromisso do destino. Os primeiros passos do comprometimento têm se mostrado precoces no início da cultura, às vezes sem divisão26,37, tornando a cultura de curto prazo e a divisão de rastreamento essenciais para estudar o comprometimento precoce do destino. Ao acompanhar simultaneamente o destino, a divisão e o parentesco, este ensaio permite compreender o papel da primeira divisão e a decisão do destino nos HSPCs humanos. Usando o ensaio, é possível inferir após quantas divisões o processo de comprometimento ocorre, o equilíbrio entre auto-renovação e diferenciação para esses progenitores iniciais e como essas propriedades são herdadas ao longo das gerações. Até onde sabemos, este é o único ensaio que permite esses tipos de medidas para HSPCs humanos, com resolução de célula única. Além disso, usando diferentes combinações de corantes de divisão celular, aumentamos o rendimento da análise, tornando este ensaio uma ferramenta valiosa para gerar grandes conjuntos de dados rapidamente. As combinações de corantes permitem acompanhar várias famílias nos mesmos poços, aumentando o número de células disponíveis para análise em cultura de curta duração. O número de combinações poderia ser potencialmente aumentado ainda mais, através da adição de outros corantes (por exemplo, corante amarelo) ou modificando a proporção de CFSE e CTV. No entanto, isso reduz o número de outros parâmetros que podem ser analisados.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> Figura 6: Representação esquemática do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para realizar a análise com sucesso, devido ao grande número de poços e ao número reduzido de células a serem analisadas, é necessário executar a análise por citometria de fluxo em um analisador equipado com um leitor de placas. A nova geração de analisadores de bancada é particularmente adaptada a este ensaio, pois a maioria deles tem um volume morto menor para reduzir a porcentagem de perda celular. Isso, por sua vez, garante uma maior eficiência na recuperação da totalidade de cada poço, levando a uma eficiência estimada na faixa de 70%26. Estimar a perda celular durante a aquisição por citometria de fluxo é crucial para a análise de cada família individual. Por exemplo, supondo que não haja morte celular e contando o número de divisões, é possível estimar o número de células por cada família. No entanto, é desejável realizar alguns experimentos confirmatórios, particularmente na estimativa de morte celular nas condições de cultura testadas e medir a taxa de recuperação experimentalmente usando um número definido de células.
Uma das etapas cruciais desse protocolo é a atribuição de pico. Como já mencionado, uma boa distribuição de picos de qualidade é fortemente dependente do isolamento de picos muito estreitos na triagem celular. No entanto, ainda é difícil atribuir o número correto de divisões com base exclusivamente na distribuição. Como a triagem celular e a análise por citometria de fluxo são realizadas em dois equipamentos diferentes, não é possível comparar diretamente a intensidade de cada sinal, de modo que pode ser difícil saber se o primeiro pico observado na extremidade direita do histograma é o pico 0 ou o pico 1. Nesse sentido, poucas soluções são possíveis; Uma maneira é realizar um experimento ortogonal para medir com precisão o número de divisões realizadas por essas células (por exemplo, imagens de células vivas). Outra possibilidade é simplesmente contar o número de células no poço sob um microscópio de campo claro invertido, antes de executar a análise de citometria de fluxo. Isso irá inferir um número médio de divisões (supondo que não haja morte celular). Finalmente, uma solução post-hoc para a atribuição de pico é a detecção de um número incomum de "famílias impossíveis"; Essas famílias são compostas por um número maior do que o possível de células por geração (por exemplo, cinco células na geração 2, ou duas células na geração 1 e uma célula na geração 2). A possibilidade de excluir famílias impossíveis é codificada na etapa de análise estatística e sinaliza a família impossível. Se a ocorrência desses erros for muito alta, é razoável supor que a atribuição de pico precise ser revista.
Nesse protocolo, incluímos alguns exemplos de representação e análise de dados para o ensaio, uma vez que este se tornou uma etapa essencial na geração e interpretação de grandes conjuntos de dados38. O primeiro exemplo é o mapa de calor que mostra a totalidade de todas as células analisadas, organizadas por família. Esta é uma ferramenta eficiente para explorar as propriedades gerais dos dados e possíveis conclusões: as famílias são compostas por múltiplos tipos celulares ou tendem a ser homogêneas em sua composição? As famílias estão espalhadas por várias gerações ou dividem-se, na sua maioria, o mesmo número de vezes? Essa análise exploratória precisa ser complementada com parcelas mais específicas e testes estatísticos. Ele pode ser usado para avaliar quantitativamente o compromisso de destino simétrico e assimétrico, a diferenciação sem divisão, o equilíbrio entre auto-renovação e diferenciação e o número de divisões para um determinado destino de compromisso. É fundamental, durante o planejamento experimental, definir o comprimento da cultura celular de acordo com o tipo de pergunta feita; Por exemplo, para as duas primeiras questões (equilíbrio simétrico/assimétrico e diferenciação sem divisão), o planejamento de etapas muito curtas permite o isolamento de um grande número de famílias que realizaram apenas uma ou nenhuma divisão26. Por outro lado, experimentos mais longos permitem a exploração do número de divisões necessárias para um comprometimento celular específico, pois amostram famílias em diferentes estágios de diferenciação. No entanto, esse método não é projetado para culturas de longo prazo (2-3 semanas), pois a diluição do corante celular não é capaz de rastrear com precisão mais de sete ou oito divisões22. Como consequência, esta ferramenta é principalmente adaptada para estudar o comprometimento precoce de progenitores hematopoiéticos, e não é projetada para tirar conclusões robustas sobre as propriedades de diferenciação a longo prazo dessas células.
O arcabouço estatístico foi desenvolvido especificamente para a análise desse tipo de dado e baseado no conceito depermutações26. Isso foi necessário devido à observação de uma dependência familiar da distribuição do tipo celular e do número de divisões realizadas. Em outras palavras, células que fazem parte da mesma família também são mais propensas a exibir fenótipos semelhantes e dividir o mesmo número de vezes. Embora uma análise aprofundada esteja além do escopo deste trabalho, o conjunto de testes estatísticos fornecido deve ser suficiente para avaliar diferentes condições.
Em conclusão, este protocolo constitui uma ferramenta valiosa para avaliar a dinâmica celular de células-tronco hematopoéticas e progenitoras ex vivo, de forma rápida e de baixo custo. Devido à sua flexibilidade e versatilidade em relação ao ponto de tempo, condições de cultura e tipo de HSPCs analisados, permite testar uma variedade de condições experimentais. Como um ensaio baseado em citometria de fluxo, pode ser implementado na maioria dos laboratórios, e não requer conhecimento prévio extensivo, tornando-se um bom candidato para triagens e experimentos piloto.

A última década foi marcada pela disseminação mundial de abordagens unicelulares para biologia celular e molecular. Seguindo os passos da genômica de célula única1,2, hoje em dia é possível estudar muitos componentes de uma única célula (por exemplo, DNA, RNA, proteínas), com novas técnicas de célula única -ômicas surgindo a cada ano. Essas técnicas têm lançado luz sobre velhas e novas questões para os campos da imunologia, neurobiologia, oncologia e outros, tanto utilizando células humanas quanto de organismos modelo3. Ao destacar as diferenças entre as células individuais, a ômica unicelular motivou a definição de um novo modelo de hematopoese, centrado na heterogeneidade das células-tronco hematopoéticas e progenitoras (HSPCs) e afastando-se do modelo clássico de populações discretas homogêneas 4,5.
Uma das poucas desvantagens de todas as técnicas -ômicas é a destruição da célula de interesse, impossibilitando a possibilidade de avaliar sua funcionalidade. Por outro lado, outros métodos de célula única, como o ensaio de transplante de célula única e tecnologias de rastreamento de linhagem, fornecem uma leitura da funcionalidade da célula ancestral avaliando o destino de células individuais in vivo 6,7. As tecnologias de rastreamento de linhagens envolvem a marcação da célula de interesse com uma etiqueta genética hereditária7 ou fluorescente8,9, permitindo que o destino de várias células individuais seja seguido ao mesmo tempo. No entanto, a caracterização das células iniciais é tipicamente limitada a um número restrito de parâmetros, como a expressão de algumas proteínas de superfície avaliada por citometria de fluxo10. Além disso, as tecnologias de rastreamento de linhagem de célula única requerem detecção trabalhosa da marca celular, tipicamente via sequenciamento de DNA/RNA ou imagem. Este último ponto, em particular, limita o número de condições que podem ser testadas em um único experimento.
Outra classe de métodos que são usados para estudar a funcionalidade de células únicas são sistemas de cultura de células ex vivo de HSPCs individuais. Fáceis de executar, esses ensaios padrão-ouro envolvem a classificação de células individuais em vasos de cultura celular de 96 poços e, após a cultura, caracterizando o fenótipo de progênie celular, tipicamente por citometria de fluxo ou análise morfológica. Esses ensaios têm sido usados principalmente para caracterizar a diferenciação a longo prazo de HSPCs em células maduras, tipicamente após 2-3 semanas de cultura11,12. Alternativamente, têm sido utilizados para tentar manter e expandir os HSPCs ex vivo 13,14,15,16,17,18, com a promessa de benefício médico para o transplante de células-tronco humanas 19. Por fim, têm sido utilizados para estudar o comprometimento precoce de HSPCs utilizando cultura de curta duração20, sendo o baixo número de células geradas nessa cultura o principal fator limitante. Uma desvantagem desses diferentes tipos de ensaios ex vivo é que eles refletem apenas parcialmente a complexidade in vivo; ainda assim, eles são uma das raras maneiras de estudar a diferenciação humana HSPC.
Uma informação ausente dos métodos unicelulares existentes (célula única-ômica, rastreamento de linhagem e cultura ex vivo) é a detecção precisa de divisões celulares, um parâmetro essencial a ser considerado ao estudar a dinâmica do HSPC21. Uma maneira simples de avaliar o número de divisões por citometria de fluxo é o uso de "corantes proteicos" solúveis, como o éster succinimidílico de diacetato de 5-(e 6)-carboxifluoresceína (CFSE)22. Esses corantes de divisão difundem-se dentro do citoplasma das células coradas, diluem-se pela metade e passam para as duas células-filhas a cada divisão celular, permitindo enumerar até 10 divisões. Combinando vários corantes de divisão, é possível semear vários progenitores individuais no mesmo poço, pois cada corante individual permite a separação dos diferentes descendentes. Este é o princípio por trás do uso de corantes celulares para multiplex, clonal e division-tracking, que foi introduzido pela primeira vez para linfócitos murinos23,24.
Aqui, apresentamos o desenvolvimento do ensaio MultiGen para uso com HSPCs murinos e humanos. Ele permite o teste de muitas células individuais simultaneamente para suas propriedades de diferenciação, divisão e parentesco ex vivo. Este ensaio de alto rendimento, fácil de executar e barato permite medir o fenótipo celular, o número de divisões realizadas, o parentesco celular e a relação clonal com as outras células do poço, tudo ao mesmo tempo. Ele pode ser usado para avaliar quantitativamente o compromisso de destino simétrico e assimétrico, o equilíbrio entre auto-renovação e diferenciação e o número de divisões necessárias para um determinado destino de compromisso. O protocolo requer um classificador de células ativado por fluorescência (FACS) e um citômetro de fluxo com leitor de placas, além do equipamento necessário para a realização da cultura celular. Além do protocolo técnico para execução do ensaio em HSPCs humanos, também fornecemos o quadro detalhado de análise, incluindo os testes estatísticos necessários para avaliar as propriedades celulares relacionadas ao conceito de família celular25. Esse protocolo já foi utilizado com sucesso para descrever o compartimento murino da HSPC26,27.
O protocolo a seguir utiliza como material de partida células CD34+ enriquecidas magneticamente28. Dessa forma, é possível corar e isolar eficientemente os HSPCs humanos de diferentes fontes de sangue (por exemplo, sangue do cordão umbilical, medula óssea, sangue periférico). É importante não descartar a fração CD34- , pois ela será utilizada como parte do protocolo para definir diferentes tipos de controles experimentais. As quantidades e volumes de células mencionados podem ser ampliados ou reduzidos, de acordo com o fluxo de trabalho e as necessidades experimentais. Da mesma forma, o protocolo pode ser adaptado para o estudo de diferentes tipos de progenitores, simplesmente modificando os anticorpos utilizados para as etapas de triagem celular e citometria de fluxo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom culture plate&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Lin APC</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-7776-72</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA III</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace Violet (CTV)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62948-36</td>
			<td>Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block Fc1.3216</td>
			<td>BD</td>
			<td>564220</td>
			<td>Dilution 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>S1900-500C</td>
			<td>Batch S00CH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.1</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312216</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3</td>
			<td>BD</td>
			<td>564195</td>
			<td>Dilution 1/15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343513</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>356620</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560673</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560675</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory prepared</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells

Poucas técnicas podem avaliar fenótipo e destino para uma mesma célula simultaneamente. A maioria dos protocolos atuais utilizados para caracterizar o fenótipo, embora capaz de gerar grandes conjuntos de dados, necessita da destruição da célula de interesse, impossibilitando a avaliação de seu destino funcional. Sistemas diferenciadores biológicos heterogêneos, como a hematopoiese, são, portanto, difíceis de descrever. Com base em corantes de rastreamento de divisão celular, desenvolvemos um protocolo para determinar simultaneamente o parentesco, o número de divisão e o status de diferenciação para muitos progenitores hematopoiéticos únicos. Este protocolo permite avaliar o potencial de diferenciação ex vivo de progenitores hematopoéticos murinos e humanos, isolados de diversas fontes biológicas. Além disso, por ser baseado em citometria de fluxo e um número limitado de reagentes, pode gerar rapidamente uma grande quantidade de dados, em nível unicelular, de maneira relativamente barata. Também fornecemos o pipeline analítico para análise de célula única, combinado com uma estrutura estatística robusta. Como esse protocolo permite a ligação da divisão e diferenciação celular no nível de célula única, ele pode ser usado para avaliar quantitativamente o comprometimento do destino simétrico e assimétrico, o equilíbrio entre auto-renovação e diferenciação e o número de divisões para um determinado destino de compromisso. Em conjunto, este protocolo pode ser utilizado em delineamentos experimentais com o objetivo de desvendar as diferenças biológicas entre progenitores hematopoéticos, a partir de uma perspectiva unicelular.

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Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Poucos métodos permitem avaliar rapidamente a funcionalidade dos progenitores hematopoéticos. Este protocolo mede o impacto das primeiras divisões celulares no destino e comprometimento celular. Este protocolo permite medir simultaneamente a divisão e diferenciação em nível de célula única e com alto rendimento sem a necessidade de manipulação complexa e extensa.Este método é adequado para qualquer população hematopoiética que possa ser mantida em cultura. Assim, pode ser facilmente aplicado à biologia do câncer, imunologia e biologia do desenvolvimento. Para começar, alíquota 250 microlitros da fração CD34+ igualmente em quatro tubos de polipropileno de 15 mililitros.Rotule os tubos conforme descrito no manuscrito do texto. Aliquot 250 microlitros da fração CD34 em outros quatro tubos de polipropileno de 15 mililitros e rotular os tubos. Preparar soluções CFSE high e CSFE low conforme descrito no texto do manuscrito.Adicione 250 microlitros da solução CFSE alta ao tubo CF e CV, 250 microlitros da solução baixa CFSE ao tubo VC e 250 microlitros do meio Dulbecco's Modified Eagle Medium, ou DMEM, sem soro fetal bovino, ou FBS, ao tubo VI. Para garantir uma mistura eficiente de suspensão celular em corante celular, incline o tubo em 90 graus e deposite as soluções CFSE na parede do tubo. Em seguida, segure o tubo verticalmente e misture três ou quatro vezes para garantir uma mistura rápida das soluções de CFSE com as células ressuspensas.Incubar a suspensão a 37 graus Celsius durante oito minutos. Após a incubação, adicionar cinco mililitros de DMEM contendo 10% de FBS e colocar os tubos a 37 graus Celsius por cinco minutos. Gire os tubos a 300 G por cinco minutos.Retire o sobrenadante por aspiração sem perturbar o pellet e lave o pellet com cinco mililitros de PBS, ETDA. Gire os tubos novamente e descarte o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 40 microlitros de PBS, ETDA. Para manchar as células CD34+, prepare uma mistura mestra de anticorpos em um único tubo de 0,5 mililitro.Adicione sete microlitros da mistura mestre de anticorpos a cada uma das quatro condições CD34+. Ressuspender as células em tampão de coloração usando aproximadamente 500 microlitros cada para as esferas em células CD34+ e um mililitro para os tubos CD34. Para classificação de células, defina a estratégia de limitação criando diagramas de gráfico de pontos.Primeiro, visualize as células em um gráfico de pontos FSCA versus SSCA e clique duas vezes na ferramenta Polygon gating para selecionar a população com baixa dispersão lateral. Rotule esse portão recém-criado como Células. No gráfico de pontos a seguir, FSCA versus FSCH, clique com o botão direito do mouse no gráfico e selecione as células do portão no menu suspenso clicando nele.Use a mesma ferramenta de limitação para selecionar uma população apertada na diagonal entre os dois eixos. Rotule esse portão como Células Únicas. No terceiro gráfico de pontos, APC versus FSH-H, exibe a população Single Cells e gate as células negativas para a expressão da linhagem APC.Rotule essa população recém-criada como Linhagem Negativa. No quarto gráfico, CFSE versus CTV, exibe a população Linhagem Negativa e cria quatro portas separadas, uma para cada combinação de corante. O portão VI é mostrado aqui como exemplo.Use a quinta e sexta parcelas para identificar os progenitores de interesse. Generosamente porta CD34+CD38-população e o CD34+CD38+ na quinta parcela. Em seguida, selecione a população CD34+CD38 no sexto gráfico e desenhe três portas para LMPP, HSC e MPP.Execute as frações CD34+, gravando pelo menos 5.000 eventos no portão de célula única. Ajuste o portão para cada combinação de corantes, definindo um portão apertado para selecionar uma população homogênea. Prepare o Modelo de Classificação de Chapas usando o layout Classificação de Experimentos.Os poços denominados CD34-contêm 5.000 a 10.000 células classificadas na porta CF, CV, VC, VI. Os poços a granel contêm 500 células classificadas no portão CD34+CD38-Os poços de célula única contêm apenas um evento por combinação de corante de divisão celular por poço, portanto, quatro eventos por poço no total. Em seguida, comece classificando o CD34-CF no modo Pureza de rendimento.Clique no botão Adquirir e, em seguida, no botão Classificar. Clique em Adquirir e, em seguida, no botão Classificar, garantindo ter marcado 0160 como grau de pureza. Finalmente, classifique as células de interesse, uma célula por poço, em pureza de célula única, garantindo ter marcado a opção de classificação de índice.Centrifugar a placa a 300 G por cinco minutos e remover o sobrenadante invertendo rapidamente a placa sob o capô sobre um papel toalha. Adicionar oito microlitros de tampão parado aos poços A1 a A4, seguido da adição de oito microlitros da mistura aos outros poços. Lave as células adicionando 100 microlitros de tampão de coloração por poço usando uma pipeta multicanal.Centrifugar e remover o sobrenadante antes de ressuspender as células em 85 microlitros de tampão corante. Inicie a análise no citômetro de fluxo no modo de aquisição usando o modelo dedicado e clicando em Personalizado. Após selecionar os fluoróforos de interesse da lista, defina a configuração da placa seguindo o molde da placa corrigido para o número de poços contendo pelo menos uma célula.Marque a opção Agitação e selecione 100 microlitros como limite de volume de aquisição. Em seguida, defina a taxa de aquisição não superior a um microlitro por segundo, pois menor velocidade melhora o volume total analisado por poço. Para o fechamento representativo, concatene os diferentes poços a granel em um único arquivo.Depois de clicar na opção Concatenar populações, selecione Todos os parâmetros não compensados no menu Parâmetros e, em seguida, clique em Concatenar. Carregue o arquivo concatenado no espaço de trabalho e, em seguida, aplique a matriz de compensação por meio de arrastar e soltar. Rótulos de células com CV e VC precisam de um valor transformado.Clique em Ferramentas e Derive Parameter para obter o valor transformado. Cole a fórmula indicada na caixa de fórmula. Aplique o limite a cada cor individualmente como um gráfico de histograma.Para FC e VI, defina CFSE-A e CTV-A no eixo X, respectivamente. Para CV e VC, defina o parâmetro recém-derivado no eixo X e, em seguida, defina as portas correspondentes a cada pico. Aplique bem o gating em cada célula individual.Certifique-se de adicionar o parâmetro derivado a cada poço analisado. Verifique manualmente cada porta de cor para cada poço para detectar eventos que estão atribuídos incorretamente a um determinado pico. A análise por citometria de fluxo após cultura celular requer gating preciso para estabelecer o parentesco de cada célula individual juntamente com a fenotipagem celular.A definição e atribuição dos picos são aspectos cruciais da análise por citometria de fluxo. Os histogramas mostram dois exemplos de famílias distribuídas em múltiplos picos, um de dois picos de intensidade semelhantes e outro com dois picos de intensidade diferentes. Diferentes tipos de representação de dados e testes estatísticos são mostrados aqui para dois experimentos separados realizados após 72 horas para HSCs e MPPs.O mapa de calor para a diferenciação da condição HSC representa diferentes famílias celulares, tanto no destino celular quanto nas divisões celulares. O histograma comparando as famílias celulares derivadas de HSCs e MPPs é mostrado aqui. Para ambos os tipos celulares, a comparação entre a condição GT e a diferenciação da condição é exibida juntamente com os testes estatísticos realizados para MPPs.Histogramas comparando a porcentagem de famílias celulares por geração e o tipo de simetria ou assimetria no destino para a primeira divisão são mostrados aqui. A distribuição dos destinos por geração para MPPs e a diferenciação da condição são mostradas aqui. Este procedimento requer isolar células em massa para definir a estratégia de confinamento apropriada.Portanto, é melhor iniciar a coloração com pelo menos 10.000 células. Combinar este método com a medição contínua, como as células vivas imaginando, pode ser muito poderoso, pois os dois juntos podem fornecer uma descrição detalhada dos primeiros progenitores da dinâmica celular. Esta abordagem foi desenvolvida pela primeira vez para a biologia de células T pelo Hopkins Labs.Esta versão, adaptada para células estaminais do sangue, está agora a expandir-se para o cancro e a biologia das células estaminais.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identificação de mutações de DNA em células-tronco/progenitoras hematopoiéticas purificadas

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...