Name: simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Institut Curie Flow Facility üyelerine, akış sitometrisi deneylerinin kurulmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Perié Takımı'nın diğer üyelerinin birden fazla tartışma sırasındaki katkılarını da kabul etmek istiyoruz. Dr. Julia Marchingo ve Prof. Phil Hodgkin'e (Walter end Eliza Hall Tıbbi Araştırma Enstitüsü) lenfositler üzerindeki hücre bölünmesi boyalarının çoğullanması protokolünü paylaştıkları için teşekkür ederiz. Saint Louis hastanesi kordon kanı biyobankasına bu protokolün geliştirilmesi için gerekli biyolojik kaynakları sağladığı için teşekkür ederiz. Çalışma, CNRS ve Bettencourt-Schueller Vakfı'ndan (L.P.'ye) bir ATIP-Avenir hibesi, Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (L.P. ve A.D.'ye), Idex Paris-Science-Lettres Programı'ndan (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL'ye) (L.P.'ye), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, L.P.'ye) ve ITMO MIIC hibesinden (21CM044, L.P.'ye) hibeler ile desteklenmiştir. Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı ERC StG 758170-Microbar (L.P.'ye) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nin (ERC) finansmanının yanı sıra A.D., Fondation de France'dan bir burs ile desteklendi.

<ol>
	<li>Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+immunology:+Past,+present,+and+future.">Single-cell immunology: Past, present, and future.</a> Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).</li><li>Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA-sequencing:+A+powerful+yet+still+challenging+technology+to+study+cellular+heterogeneity.">Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity.</a> Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).</li><li>Regev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cell+atlas.">The human cell atlas.</a> Elife. 6, 27041 (2017).</li><li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity.">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li><li>Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+commitment+of+hematopoietic+stem+cells+and+progenitors:+insights+from+recent+single+cell+and+lineage+tracing+technologies.">Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies.</a> Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).</li><li>Peri&#233;, L., Duffy, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retracing+the+in+vivo+haematopoietic+tree+using+single-cell+methods.">Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods.</a> FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).</li><li>Yu, V. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+underlies+cell-autonomous+heterogeneous+behavior+of+hematopoietic+stem+cells.">Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells.</a> Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).</li><li>Ganuza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+haematopoiesis+is+established+by+hundreds+of+precursors+throughout+mammalian+ontogeny.">Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).</li><li>Naik, S. H., Schumacher, T. N., Peri&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+barcoding:+A+technical+appraisal.">Cellular barcoding: A technical appraisal.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).</li><li>Quek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+distinct+leukemic+stem+cells+in+human+CD34+&#8722;+acute+myeloid+leukemia+are+arrested+at+a+hemopoietic+precursor-like+stage.">Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 &#8722; acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).</li><li>Karamitros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+the+continuum+of+human+lympho-myeloid+progenitor+cells.">Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells.</a> Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Delaney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-mediated+expansion+of+human+cord+blood+progenitor+cells+capable+of+rapid+myeloid+reconstitution.">Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution.</a> Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+PPAR-&#947;+3+signaling+expands+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+enhancing+glycolysis.">Antagonism of PPAR-&#947; 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis.</a> Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-booster+nicotinamide+riboside+potently+stimulates+hematopoiesis+through+increased+mitochondrial+clearance.">The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nov/CCN3+enhances+cord+blood+engraftment+by+rapidly+recruiting+latent+human+stem+cell+activity.">Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).</li><li>Horwitz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omidubicel+vs+standard+myeloablative+umbilical+cord+blood+transplantation:+results+of+a+phase+3+randomized+study.">Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study.</a> Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).</li><li>Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+on+transcriptional+landscapes+links+state+to+fate+during+differentiation.">Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.</a> Science. 367 (6479), 3381 (2020).</li><li>Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell+fate+control+by+continuous+single-cell+quantification.">Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification.</a> Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).</li><li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes.">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).</li><li>Marchingo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+stimuli+independently+sum+to+regulate+an+inherited+clonal+division+fate.">T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate.</a> Nature Communications. 7, 13540 (2016).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+division+tracking+dyes+for+proliferation-based+clonal+lineage+tracing.">Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing.</a> Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).</li><li>Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Testing statistical hypotheses. , 784 (2005).</li><li>Tak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSPCs+display+within-family+homogeneity+in+differentiation+and+proliferation+despite+population+heterogeneity.">HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity.</a> Elife. 10, 360624 (2021).</li><li>Sommerkamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+multipotent+progenitor+5+cells+are+located+at+the+interphase+between+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).</li><li>Kato, K., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+CD34++hematopoietic+stem+cells+from+human+peripheral+blood+by+high-gradient+magnetic+cell+sorting.">Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting.</a> Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).</li><li>Miltenyi, S., M&#252;ller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS.">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).</li><li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development.">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li><li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia.">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li><li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells.">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li><li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome.">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151 (2013).</li><li>Davison, A. C., Hinkley, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bootstrap Methods and their Application. , (1997).</li><li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+B+cell+antibody+class+switching+is+stochastic,+cell-autonomous,+and+tuneable.">Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable.</a> Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+routes+of+lineage+development+reshape+the+human+blood+hierarchy+across+ontogeny.">Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116 (2016).</li><li>Grinenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+restricted+myeloid+progenitors+before+cell+division+in+mice.">Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).</li><li>Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+flow+cytometry:+Helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data.">Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).</li></ol>

Yazarlar bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlamada veya çalışmayı yayınlanmak üzere gönderme kararında hiçbir rolü yoktu.

MultiGen testi, lenfosit 23,24,35 ve murin hematopoetik hücreleri26,27'yi incelemek için etkili olan yüksek verimli, gerçekleştirilmesi kolay ve ucuz olmayan bir tahlildir. Burada, kısa süreli kültür kullanarak tek hücreli düzeyde, insan HSPC taahhüdünün erken evresini ex vivo olarak deşifre etmeyi sağlayan yaklaşımın yeni bir gelişimini sunuyoruz (Şekil 6). Tek hücreli ex vivo kültür sistemleri tipik olarak HSPC'lerin olgun hücrelere uzun vadeli kaderini değerlendirmek için kullanılır, ancak bazı kaderler diğerlerinden daha erken ortaya çıkar36, potansiyel olarak analizi daha az kadere doğru önyargılı hale getirir. Ek olarak, bu kültür sistemleri genellikle kader taahhüdü sırasında bölünmeler hakkındaki bilgileri kaçırır. İlk taahhüt adımlarının, kültürün başlangıcında olduğu kadar erken bir zamanda, bazen 26,37'lik bölünme olmadan, kısa vadeli kültürü ve izleme bölünmesini erken kader taahhüdünü incelemek için gerekli kıldığı gösterilmiştir. Kader, bölünme ve akrabalığı eşzamanlı olarak takip ederek, bu tahlil insan HSPC'lerinde ilk bölünme ve kader kararının rolünü anlamayı sağlar. Testi kullanarak, taahhüt sürecinin kaç bölünmeden sonra, bu erken atalar için kendini yenileme ve farklılaşma arasındaki dengeyi ve bu özelliklerin nesiller boyunca nasıl miras alındığını çıkarmak mümkündür. Bildiğimiz kadarıyla, bu, tek hücreli çözünürlükte insan HSPC'leri için bu tür ölçümlere izin veren tek tahlildir. Ek olarak, hücre bölme boyalarının farklı kombinasyonlarını kullanarak, analizin verimini artırdık ve bu tahlili hızlı bir şekilde büyük veri kümeleri oluşturmak için değerli bir araç haline getirdik. Boya kombinasyonları, aynı kuyucuktaki birkaç aileyi takip etmeyi sağlar ve kısa süreli kültürde analiz için mevcut hücre sayısını arttırır. Kombinasyonların sayısı, diğer boyaların (örneğin, sarı boya) eklenmesi veya CFSE ve CTV oranının değiştirilmesi yoluyla potansiyel olarak daha da arttırılabilir. Ancak bu, analiz edilebilecek diğer parametrelerin sayısını azaltır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> Şekil 6: Protokolün şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Analizi başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için, çok sayıda kuyucuk ve analiz edilecek hücre sayısının azalması nedeniyle, akış sitometri analizini bir plaka okuyucu ile donatılmış bir analizörde çalıştırmak gerekir. Yeni nesil tezgah analizörleri özellikle bu tahlile uyarlanmıştır, çünkü çoğu hücre kaybı yüzdesini azaltmak için daha küçük bir ölü hacme sahiptir. Bu da, her bir kuyunun tamamının geri kazanılmasında daha yüksek bir verimliliği garanti eder ve bu da% 70 aralığında tahmin edilen bir verimliliği tetikler26. Akış sitometrisi kazanımı sırasında hücre kaybını tahmin etmek, her bir ailenin analizi için çok önemlidir. Örneğin, hücre ölümü olmadığını varsayarsak ve bölünme sayısını sayarsak, her aile başına hücre sayısını tahmin etmek mümkündür. Bununla birlikte, özellikle test edilen kültür koşullarında hücre ölümünün tahmin edilmesinde ve belirli sayıda hücre kullanılarak deneysel olarak iyileşme oranının ölçülmesinde bazı doğrulayıcı deneylerin yapılması arzu edilir.
Bu protokolün en önemli adımlarından biri zirve atamasıdır. Daha önce de belirtildiği gibi, kaliteli bir tepe dağılımı, hücre sıralamada çok dar piklerin izolasyonuna büyük ölçüde bağlıdır. Bununla birlikte, dağıtıma benzersiz bir şekilde dayanarak doğru sayıda bölüm atamak hala zordur. Hücre sıralama ve akış sitometrisi analizi iki farklı makinede yapıldığından, her sinyalin yoğunluğunu doğrudan karşılaştırmak mümkün değildir, bu nedenle histogramın sağ ucunda gözlenen ilk pikin tepe 0 mı yoksa tepe 1 mi olduğunu bilmek zor olabilir. Bu bağlamda, çok az çözüm mümkündür; Bunun bir yolu, bu hücreler tarafından gerçekleştirilen bölünmelerin sayısını doğru bir şekilde ölçmek için ortogonal bir deney yapmaktır (örneğin, canlı hücre görüntüleme). Diğer bir olasılık, akış sitometri analizini çalıştırmadan önce, ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu altında kuyudaki hücre sayısını saymaktır. Bu, ortalama bir bölünme sayısı çıkaracaktır (hücre ölümü olmadığı varsayılarak). Son olarak, zirve ataması için post-hoc bir çözüm, alışılmadık sayıda "imkansız ailenin" tespitidir; Bu aileler, nesil başına mümkün olandan daha fazla sayıda hücreden oluşur (örneğin, nesil 2'de beş hücre veya nesil 1'de iki hücre ve nesil 2'de bir hücre). İmkansız aileleri dışlama olasılığı istatistiksel analiz adımında kodlanır ve imkansız aileyi işaretler. Bu hataların ortaya çıkması çok yüksekse, tepe atamasının gözden geçirilmesi gerektiğini varsaymak mantıklıdır.
Bu protokolde, büyük veri kümelerinin oluşturulmasında ve yorumlanmasında önemli bir adım haline geldiğinden, test için birkaç veri gösterimi ve analizi örneği ekledik38. İlk örnek, aile başına organize edilmiş analiz edilen tüm hücrelerin toplamını gösteren ısı haritasıdır. Bu, verilerin genel özelliklerini ve potansiyel sonuçları araştırmak için etkili bir araçtır: aileler birden fazla hücre tipinden mi oluşuyor yoksa bileşimde homojen olma eğiliminde mi? Aileler birden fazla nesle yayılmış mı, yoksa çoğunlukla aynı sayıda bölünüyorlar mı? Bu keşifsel analizin daha sonra daha spesifik grafikler ve istatistiksel testlerle tamamlanması gerekir. Simetrik ve asimetrik kader taahhüdünü, bölünmeden farklılaşmayı, kendini yenileme ve farklılaşma arasındaki dengeyi ve belirli bir taahhüt kaderi için bölünme sayısını nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Deneysel planlama sırasında, hücre kültürü uzunluğunu sorulan sorunun türüne göre ayarlamak esastır; Örneğin, ilk iki soru için (simetrik/asimetrik denge ve bölünmeden farklılaşma), çok kısa kültür adımlarının planlanması,26'da sadece bir bölünme gerçekleştiren veya hiç yapmayan çok sayıda ailenin izole edilmesini sağlar. Tersine, daha uzun deneyler, farklılaşmanın farklı aşamalarındaki aileleri örnekledikleri için, belirli bir hücre taahhüdü için gereken bölünme sayısının araştırılmasına izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem uzun süreli kültürler (2-3 hafta) için tasarlanmamıştır, çünkü hücre boyası seyreltmesi yedi veya sekizden fazla bölümü doğru bir şekilde izleyememektedir22. Sonuç olarak, bu araç çoğunlukla hematopoetik progenitörlerin erken bağlılığını incelemek için uyarlanmıştır ve bu hücrelerin uzun vadeli farklılaşma özellikleri hakkında sağlam sonuçlar çıkarmak için tasarlanmamıştır.
İstatistiksel çerçeve, özellikle bu tür verilerin analizi için geliştirilmiştir ve permütasyonlarkavramına dayanmaktadır 26. Bu, hücre tipi dağılımına ve yapılan bölünme sayısına ailesel bir bağımlılığın gözlemlenmesi nedeniyle gerekliydi. Başka bir deyişle, aynı ailenin parçası olan hücrelerin de benzer fenotipler gösterme ve aynı sayıda bölünme olasılığı daha yüksektir. Derinlemesine bir analiz bu çalışmanın kapsamı dışında olsa da, farklı koşulları değerlendirirken sağlanan istatistiksel testler seti yeterli olmalıdır.
Sonuç olarak, bu protokol hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin hücresel dinamiklerini ex vivo olarak hızlı ve ucuz bir şekilde değerlendirmek için değerli bir araçtır. Zaman noktası, kültür koşulları ve analiz edilen HSPC'lerin türü ile ilgili esnekliği ve çok yönlülüğü nedeniyle, çeşitli deneysel koşulların test edilmesine izin verir. Akış sitometrisine dayalı bir tahlil olarak, çoğu laboratuvarda uygulanabilir ve kapsamlı bir ön bilgi gerektirmez, bu da onu taramalar ve pilot deneyler için iyi bir aday haline getirir.

Son on yıl, hücresel ve moleküler biyolojiye tek hücreli yaklaşımların dünya çapında yayılmasıyla işaretlendi. Tek hücreli genomik 1,2'nin adımlarını izleyerek, günümüzde her yıl gelişen yeni tek hücreli -omik tekniklerle tek bir hücrenin birçok bileşenini (örneğin, DNA, RNA, proteinler) incelemek mümkündür. Bu teknikler, hem insan hem de model organizma hücrelerini kullanarak immünoloji, nörobiyoloji, onkoloji ve diğerleri için eski ve yeni sorulara ışık tutmuştur3. Tek tek hücreler arasındaki farklılıkları vurgulayarak, tek hücreli -omikler, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) heterojenliğine odaklanan ve klasik ayrık homojen popülasyon modelinden uzaklaşan yeni bir hematopoez modelinin tanımlanmasını sağlamıştır 4,5.
Tüm -omik tekniklerin birkaç dezavantajından biri, işlevselliğini değerlendirme olasılığını ortadan kaldırarak, ilgili hücrenin tahrip edilmesidir. Tersine, tek hücreli transplantasyon testi ve soy izleme teknolojileri gibi diğer tek hücreli yöntemler, bireysel hücrelerin in vivo 6,7 kaderini değerlendirerek ata hücrenin işlevselliğinin okunmasını sağlar. Soy izleme teknolojileri, ilgilenilen hücrenin kalıtsal bir genetik7 veya floresan etiket 8,9 ile etiketlenmesini içerir ve aynı anda birden fazla tek hücrenin kaderinin izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, başlangıç hücrelerinin karakterizasyonu tipik olarak, akış sitometrisi10 tarafından değerlendirilen birkaç yüzey proteininin ekspresyonu gibi sınırlı sayıda parametre ile sınırlıdır. Ek olarak, tek hücreli soy izleme teknolojileri, tipik olarak DNA / RNA dizilimi veya görüntüleme yoluyla hücresel etiketin zahmetli bir şekilde algılanmasını gerektirir. Özellikle bu son nokta, tek bir deneyde test edilebilecek koşulların sayısını sınırlar.
Tek hücrelerin işlevselliğini incelemek için kullanılan bir başka yöntem sınıfı, tek HSPC'lerin ex vivo hücre kültürleme sistemleridir. Gerçekleştirilmesi kolay, bu altın standart testler, bireysel hücrelerin 96 kuyucuklu hücre kültürü damarlarına ayrılmasını ve kültürden sonra, hücre soy fenotipini, tipik olarak akış sitometrisi veya morfolojik analiz ile karakterize etmeyi içerir. Bu testler çoğunlukla, HSPC'lerin olgun hücrelere uzun vadeli farklılaşmasını karakterize etmek için, tipik olarak 2-3 haftalık kültür11,12'den sonra kullanılmıştır. Alternatif olarak, insan kök hücre nakli için tıbbi fayda vaadi ile ex vivo HSPC'leri 13,14,15,16,17,18'i korumaya ve genişletmeye çalışmak için kullanılmıştır 19. Son olarak, HSPC'lerin kısa süreli kültür20 kullanarak erken taahhüdünü incelemek için kullanılmıştır, bu kültürde üretilen düşük hücre sayısı ana sınırlayıcı faktördür. Bu farklı ex vivo tahlil türlerinin bir dezavantajı, in vivo karmaşıklığı sadece kısmen yansıtmalarıdır; Yine de, insan HSPC farklılaşmasını incelemenin nadir yollarından biridir.
Mevcut tek hücreli yöntemlerden (tek hücreli omikler, soy izleme ve ex vivo kültür) eksik bir bilgi parçası, HSPC dinamikleri21'i incelerken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir parametre olan hücre bölünmelerinin doğru tespitidir. Akış sitometrisi yoluyla bölünme sayısını değerlendirmenin basit bir yolu, 5-(ve 6)-karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE)22 gibi çözünür "protein boyalarının" kullanılmasıdır. Bu bölünme boyaları, boyanmış hücrelerin sitoplazması içinde yayılır ve yarı yarıya seyreltilir ve her hücre bölünmesinde iki yavru hücreye geçerek 10 bölüme kadar numaralandırmaya izin verir. Birkaç bölme boyasını birleştirerek, her bir boya farklı torunların ayrılmasına izin verdiği için aynı kuyuda birden fazla bireysel progenitörün tohumlanması mümkündür. Bu, ilk olarak murin lenfositler23,24 için tanıtılan multipleks klonal ve bölünme takibi için hücre boyalarının kullanılmasının arkasındaki prensiptir.
Burada, murin ve insan HSPC'leri ile kullanılmak üzere MultiGen testinin geliştirilmesini sunuyoruz. Birçok tek hücrenin farklılaşma, bölünme ve ex vivo akrabalık özellikleri için aynı anda test edilmesine izin verir. Bu yüksek verimli, gerçekleştirilmesi kolay ve ucuz tahlil, hücresel fenotipi, gerçekleştirilen bölünme sayısını ve kuyudaki diğer hücrelerle hücre akrabalığını ve klonal ilişkiyi aynı anda ölçmeye izin verir. Simetrik ve asimetrik kader taahhüdünü, kendini yenileme ve farklılaşma arasındaki dengeyi ve belirli bir taahhüt kaderi için gerekli olan bölünme sayısını nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Protokol, bir floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) ve bir plaka okuyuculu bir akış sitometresi ve ayrıca hücre kültürünü gerçekleştirmek için gerekli ekipmanı gerektirir. Tahlilin insan HSPC'leri üzerinde yürütülmesi için teknik protokole ek olarak, hücre ailesi25 kavramıyla ilgili hücresel özellikleri değerlendirmek için gerekli istatistiksel testler de dahil olmak üzere ayrıntılı analiz çerçevesini de sağlıyoruz. Bu protokol, murin HSPC bölmesi26,27'yi tanımlamak için başarıyla kullanılmıştır.
Aşağıdaki protokol, başlangıç malzemesi28 olarak manyetik olarak zenginleştirilmiş CD34+ hücrelerini kullanır. Bu şekilde, insan HSPC'lerini farklı kan kaynaklarından (örneğin, kordon kanı, kemik iliği, periferik kan) etkili bir şekilde boyamak ve izole etmek mümkündür. CD34 fraksiyonunu atmamak önemlidir, çünkü farklı deneysel kontrol türlerini ayarlamak için protokolün bir parçası olarak kullanılacaktır. Söz konusu hücre miktarları ve hacimleri, deneysel iş akışına ve gereksinimlere göre yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Benzer şekilde, protokol, hücre sıralama ve akış sitometrisi adımları için kullanılan antikorları değiştirerek, farklı tipte progenitörlerin çalışmasına uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene tubes</td>
			<td>vWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom culture plate&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Lin APC</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-7776-72</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA III</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace Violet (CTV)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62948-36</td>
			<td>Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC block Fc1.3216</td>
			<td>BD</td>
			<td>564220</td>
			<td>Dilution 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>S1900-500C</td>
			<td>Batch S00CH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.1</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312216</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3</td>
			<td>BD</td>
			<td>564195</td>
			<td>Dilution 1/15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343513</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>356620</td>
			<td>Dilution 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560673</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100</td>
			<td>BD</td>
			<td>560675</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td>Dilution 1/20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory prepared</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be stored in sterile conditions, at +4 &#176;C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of kinship, division number, and phenotype via flow cytometry for hematopoietic stem and progenitor cells

Çok az teknik, aynı hücre için fenotip ve kaderi aynı anda değerlendirebilir. Fenotipi karakterize etmek için kullanılan mevcut protokollerin çoğu, büyük veri kümeleri üretebilmelerine rağmen, ilgili hücrenin yok edilmesini gerektirmekte ve işlevsel kaderini değerlendirmeyi imkansız kılmaktadır. Bu nedenle hematopoez gibi heterojen biyolojik farklılaştırıcı sistemleri tanımlamak zordur. Hücre bölünmesi izleme boyalarına dayanarak, birçok tek hematopoetik progenitör için akrabalık, bölünme numarası ve farklılaşma durumunu aynı anda belirlemek için bir protokol geliştirdik. Bu protokol, çeşitli biyolojik kaynaklardan izole edilen murin ve insan hematopoetik progenitörlerinin ex vivo farklılaşma potansiyelinin değerlendirilmesine olanak tanır. Dahası, akış sitometrisine ve sınırlı sayıda reaktife dayandığından, tek hücreli seviyede, nispeten ucuz bir şekilde hızlı bir şekilde büyük miktarda veri üretebilir. Ayrıca, sağlam bir istatistiksel çerçeve ile birlikte tek hücreli analiz için analitik boru hattı sağlıyoruz. Bu protokol, hücre bölünmesi ve farklılaşmasının tek hücre düzeyinde bağlanmasına izin verdiğinden, simetrik ve asimetrik kader taahhüdünü, kendini yenileme ve farklılaşma arasındaki dengeyi ve belirli bir taahhüt kaderi için bölünme sayısını nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Toplamda, bu protokol, hematopoetik progenitörler arasındaki biyolojik farklılıkları tek hücreli bir bakış açısıyla çözmeyi amaçlayan deneysel tasarımlarda kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Birkaç yöntem, hematopoetik progenitörlerin işlevselliğini hızlı bir şekilde değerlendirmeye izin verir. Bu protokol, ilk hücre bölünmelerinin hücre kaderi ve bağlılığı üzerindeki etkisini ölçer. Bu protokol, karmaşık ve kapsamlı manipülasyon gerektirmeden tek hücre düzeyinde ve yüksek verimde aynı anda bölünme ve farklılaşmayı ölçmeye izin verir.Bu yöntem, kültürde korunabilen herhangi bir hematopoetik popülasyon için uygundur. Böylece kanser biyolojisi, immünoloji ve gelişim biyolojisine kolayca uygulanabilir. Başlamak için, CD34 + fraksiyonunun 250 mikrolitresini, dört adet 15 mililitrelik polipropilen tüpte eşit olarak aliquot.Tüpleri metin makalesinde açıklandığı gibi etiketleyin. CD34 fraksiyonunun 250 mikrolitresini başka bir dört adet 15 mililitrelik polipropilen tüpe ayırın ve tüpleri etiketleyin. CFSE yüksek ve CSFE düşük çözümlerini metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın.CF ve CV tüpüne 250 mikrolitre CFSE yüksek çözeltisi, VC tüpüne 250 mikrolitre CFSE düşük çözeltisi ve VI tüpüne fetal sığır serumu veya FBS olmadan 250 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM'i ekleyin. Hücre boyasında hücre süspansiyonunun verimli bir karışımını sağlamak için, tüpü 90 derece eğin ve CFSE çözeltilerini tüp duvarına yatırın. Daha sonra, tüpü dikey olarak tutun ve CFSE çözeltilerinin askıya alınmış hücrelerle hızlı bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için üç veya dört kez karıştırın.Süspansiyonu sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra,% 10 FBS içeren beş mililitre DMEM ekleyin ve tüpleri beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Tüpleri beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.Peletleri rahatsız etmeden süpernatantı aspirasyon yoluyla çıkarın ve peleti beş mililitre PBS, ETDA ile yıkayın. Tüpleri tekrar döndürün ve peletleri 40 mikrolitre PBS, ETDA'da yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. CD34 + hücrelerini boyamak için, tek bir 0.5 mililitrelik tüpe ana bir antikor karışımı hazırlayın.Dört CD34 + koşulunun her birine antikor ana karışımından yedi mikrolitre ekleyin. CD34 + hücrelerindeki boncuklar için her biri yaklaşık 500 mikrolitre ve CD34 tüpleri için bir mililitre kullanarak hücreleri boyama tamponunda yeniden askıya alın. Hücre sıralama için, nokta grafiği diyagramları oluşturarak geçit stratejisini ayarlayın.İlk olarak, FSCA'ya karşı SSCA nokta grafiğindeki hücreleri görselleştirin ve düşük yan saçılımlı popülasyonu seçmek için Poligon geçit aracına çift tıklayın. Yeni oluşturulan bu kapıyı Hücreler olarak etiketleyin. Aşağıdaki nokta grafiğinde, FSCA'ya karşı FSCH, grafiğe sağ tıklayın ve üzerine tıklayarak açılır menüden kapı Hücreleri'ni seçin.İki eksen arasındaki köşegen üzerinde sıkı bir popülasyon seçmek için aynı geçit aracını kullanın. Bu kapıyı Tek Hücreler olarak etiketleyin. Üçüncü nokta grafiğinde, APC'ye karşı FSH-H, popülasyon Tek Hücrelerini görüntüler ve APC soyunun ekspresyonu için negatif hücreleri geçitler.Bu yeni oluşturulan popülasyonu Soy Negatifi olarak etiketleyin. Dördüncü grafikte, CFSE'ye karşı CTV, popülasyon Soyu Negatif'i görüntüleyin ve her boya kombinasyonu için bir tane olmak üzere dört ayrı kapı oluşturun. Kapı VI burada örnek olarak gösterilmiştir.İlgilenilen öncülleri tanımlamak için beşinci ve altıncı grafikleri kullanın. Beşinci arsada CD34 + CD38 popülasyonunu ve CD34 + CD38 + 'yı cömertçe açın. Ardından, altıncı grafikte CD34 + CD38 popülasyonunu seçin ve LMPP, HSC ve MPP için üç kapı çizin.CD34 + kesirlerini çalıştırın, tek hücre kapısına en az 5.000 olay kaydedin. Her boya kombinasyonu için kapıyı ayarlayın ve homojen bir popülasyon seçmek için sıkı bir kapı ayarlayın. Deneme Sıralama düzenini kullanarak Plaka Sıralama Şablonunu hazırlayın.CD34 adı verilen kuyular, CF, CV, VC, VI kapısında sıralanmış 5.000 ila 10.000 hücre içerir. Toplu kuyular, CD34 + CD38 kapısında sıralanmış 500 hücre içerir - Tek hücreli kuyular, kuyu başına hücre bölünmesi boya kombinasyonu başına yalnızca bir olay içerir, bu nedenle toplamda kuyu başına dört olay içerir. Ardından, CD34-CF'yi Verim Saflığı modunda sıralamaya başlayın.Al düğmesine ve ardından Sırala düğmesine tıklayın. Al'ı tıklayın, ardından Sırala düğmesini tıklayın ve saflık derecesi olarak 0160'ı işaretlediğinizden emin olun. Son olarak, ilgilenilen hücreleri, kuyu başına bir hücre, tek hücre saflığında sıralayın ve Dizin Sıralama seçeneğini işaretlediğinizden emin olun.Plakayı beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve plakayı bir kağıt havlu üzerinde kaputun altında hızla ters çevirerek süpernatantı çıkarın. A1'den A4'e kadar olan kuyucuklara sekiz mikrolitre ayakta duran tampon ekleyin, ardından karışımın sekiz mikrolitresini diğer kuyucuklara ekleyin. Çok kanallı pipet kullanarak kuyucuk başına 100 mikrolitre boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.Hücreleri 85 mikrolitre boyama tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve çıkarın. Akış sitometresindeki analizi, özel şablonu kullanarak ve Özel'e tıklayarak Edinme modunda başlatın. Listeden ilgilenilen floroforları seçtikten sonra, en az bir hücre içeren kuyucuk sayısı için düzeltilmiş plaka şablonunu izleyerek plaka kurulumunu ayarlayın.Karıştırma seçeneğini işaretleyin ve edinme hacmi sınırı olarak 100 mikrolitre seçin. Ardından, edinme oranını saniyede bir mikrolitreden daha üstün olmayan bir şekilde ayarlayın, çünkü daha düşük hız, kuyu başına analiz edilen toplam hacmi iyileştirir. Temsili geçiş için, farklı toplu kuyuları tek bir dosyada birleştirin.Popülasyonları Birleştir seçeneğine tıkladıktan sonra, Parametreler menüsünden Tüm telafi edilmemiş parametreler'i seçin ve ardından Birleştir'e tıklayın. Birleştirilmiş dosyayı çalışma alanına yükleyin, ardından sürükleyip bırakarak ücret matrisini uygulayın. CV ve VC içeren hücre etiketlerinin dönüştürülmüş bir değere ihtiyacı vardır.Dönüştürülen değeri almak için Araçlar ve Türev Parametresi'ne tıklayın. Belirtilen formülü formül kutusuna yapıştırın. Geçidi, histogram grafiği olarak her renge ayrı ayrı uygulayın.CF ve VI için, sırasıyla CFSE-A ve CTV-A'yı X ekseninde ayarlayın. CV ve VC için, yeni türetilmiş parametreyi X ekseninde ayarlayın, ardından her tepe noktasına karşılık gelen kapıları ayarlayın. Kapıyı her bir hücreye iyi uygulayın.Türetilmiş parametreyi analiz edilen her kuyuya eklediğinizden emin olun. Belirli bir tepe noktasına yanlış atanmış olayları algılamak için her bir kuyu için her renk kapısını el ile doğrulayın. Hücre kültüründen sonra akış sitometrisi analizi, hücresel fenotipleme ile birlikte her bir hücrenin akrabalığını kurmak için hassas geçit gerektirir.Tepe tanımı ve ataması, akış sitometrisi analizinin çok önemli yönleridir. Histogramlar, iki benzer yoğunluk zirvesinden biri ve biri iki farklı yoğunluk zirvesine sahip olmak üzere birden fazla zirveye yayılmış iki aile örneği gösterir. HSC'ler ve MPP'ler için 72 saat sonra gerçekleştirilen iki ayrı deney için farklı veri gösterimi türleri ve istatistiksel testler burada gösterilmiştir.HSC farklılaşması koşulu için ısı haritası, hem hücre kaderlerinde hem de hücre bölünmelerinde farklı hücre ailelerini temsil eder. HSC'lerin ve MPP'lerden türetilmiş hücre ailelerinin kaderini karşılaştıran histogram burada gösterilmiştir. Her iki hücre tipi için, koşul GT ve koşul farklılaşması arasındaki karşılaştırma, MPP'ler için yapılan istatistiksel testlerle birlikte görüntülenir.Nesil başına hücre ailelerinin yüzdesini ve ilk bölünme için kaderdeki simetri veya asimetri tipini karşılaştıran histogramlar burada gösterilmiştir. MPP'ler için kaderlerin nesil başına dağılımı ve durum farklılaşması burada gösterilmiştir. Bu prosedür, uygun geçit stratejisini belirlemek için hücreleri toplu olarak izole etmeyi gerektirir.Bu nedenle boyamaya en az 10.000 hücre ile başlamak daha iyidir. Bu yöntemi, canlı hücrelerin hayal ettiği gibi sürekli ölçümlerle birleştirmek çok güçlü olabilir, çünkü ikisi birlikte hücre dinamiğinin erken progenitörlerinin ayrıntılı bir tanımını sağlayabilir. Bu yaklaşım ilk olarak Hopkins Labs tarafından T hücre biyolojisi için geliştirilmiştir.Kan kök hücreleri için uyarlanmış olan bu versiyon şimdi kanser ve kök hücre biyolojisine genişlemektedir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...