Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

يتم دعم PV من خلال منحة Pedal the Cause الافتتاحية من قبل مركز Alvin J. Siteman للسرطان من خلال مؤسسة مستشفى بارنز اليهودي ، ومنحة الأبحاث التجريبية من مركز مارشا ريفكين لأبحاث سرطان المبيض ، ومنحة أبحاث السرطان من مؤسسة ماري كاي آش ومؤسسة V. يتم دعم NR من خلال منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة على الخلايا والبيولوجيا الجزيئية T32 لجامعة واشنطن ، سانت لويس.

ملاحظة: تم استخدام خط خلايا سرطان المبيض ، OVCAR3 ، في هذه الخطوات ، ولكن هذا البروتوكول ينطبق على نطاق واسع على خطوط خلايا أخرى متعددة ، بما في ذلك تلك المشتقة من مصادر غير مبيضية. يظهر رسم تخطيطي للبروتوكول في الشكل 2.
1. تصفيح الخلايا
<ol><li>اصنع أغطية م?...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

كما ذكر في البروتوكول ، من المفيد تضمين بعض الضوابط التجريبية لضمان عمل الفحص. وتشمل هذه العينة التي لا تعالج ب IdU بالإضافة إلى عينة معالجة بالأجسام المضادة الأولية. يجب أن ينتج عن كلا العنصرين السلبيين خلايا ملطخة بواسطة DAPI ولكنها لا تحتوي على إشارة IdU.
بناء على الظروف التجر...

كثيرا ما يتعرض الحمض النووي الجينومي لاعتداءات متعددة من مصادر داخلية وخارجيةمختلفة 1. يرتبط تواتر الضرر الداخلي ارتباطا مباشرا بمستويات المنتجات الثانوية الأيضية ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية أو الألدهيدات ، والتي تكون أعلى جوهريا في أنواع متعددة من السرطان ، بما في ذلك سرطانات المبيض 2,3. من الضروري حل تلف الحمض النووي بكفاءة. خلاف ذلك ، يمكن أن تعزز الآفات السمية الجينية ، وبالتالي ، الطفرات. تعتمد قدرة الخلايا على إصلاح الآفات السامة للجينات على وظائف مسارات إصلاح الحمض النووي الخالية من الأخطاء والتنظيم الفعال لتطور دورة الخلية استجابة لتلف الحمض النووي. والجدير بالذكر أن العديد من سرطانات المبيض تحمل طفرات معطلة وظيفيا في p53 ، وبالتالي ، لديها نقطة تفتيش G1 / S معيبة ، مما يؤدي بالخلايا إلى بدء تكرار الحمض النووي على الرغم من وجود آفات جينومية لم يتم إصلاحها 4,5. تتفاقم درجة تلف الحمض النووي في سرطانات المبيض من خلال ملاحظة أن أكثر من 50٪ من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) لديها عيوب في إعادة التركيب المتماثل بوساطة BRCA1 و BRCA2 ، ومسار إصلاح الحمض النووي الخالي من الأخطاء ، وحوالي 20٪ لديهم تضخيم في الجين CCNE1 ، الذي يدفع خلايا G1 قبل الأوان إلى المرحلةS 6 . إن التكرار العالي لتلف الحمض النووي الداخلي ، ونقاط التفتيش المعيبة ، ومسارات الإصلاح المعطلة تعزز بشكل كبير تراكم الآفات الجينومية في سرطانات المبيض. يمكن أن تكون هذه الآفات بمثابة عوائق أمام تقدم العمليات الخلوية الحرجة مثل تكرار الحمض النووي والنسخ. كما نوقش أدناه ، تحفز هذه العوائق توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) في الخلايا.
يعد اللولب المزدوج للحمض النووي أمرا بالغ الأهمية لحماية الجينوم من عمليات الطفرات المتعددة ، مثل التطهير التلقائي وإزالة الحرارة ، ونشاط deaminases السيتوزين ، وتلف الحمض النووي التأكسدي 1,7. في المقابل ، فإن ssDNA معرض بشدة لهذه الأحداث الطفرة. يمكن أن تؤدي العمليات المتعددة في الخلايا إلى توليد ssDNA (الشكل 1). وتشمل هذه ما يلي:
(ط) توقف آلية تكرار الحمض النووي: يؤدي هذا إلى فصل لولب الحمض النووي والبلمرة ، تاركا امتدادات من ssDNA 8,9.
(ii) توقف آلية النسخ: يؤدي التوقف المستمر لبوليميراز الحمض النووي الريبي إلى توليد هياكل هجينة ثلاثية الخيوط من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي تسمى حلقات R. يكشف تكوين الحلقة R الحمض النووي النازح وغير المنسوخ كشريط واحد10.
(iii) استئصال نهاية الحمض النووي: يتطلب بدء الإصلاح الموجه بالتماثل توليد ssDNA 3 'لتحفيز البحث عن تسلسل متماثل11.
(iv) حلقة D: يمكن أن يؤدي غزو الشريط أثناء إعادة التركيب المتماثل إلى إزاحة الشريط المكمل غير القالب ، مما يؤدي إلى ssDNA12.
(v) الفجوات المقترنة بالتكرار: أثناء تكرار الحمض النووي ، يحدث تخليق الشريط المتأخر بطريقة متقطعة ، حيث يتم إنشاء شظايا أوكازاكي أولا ثم ربطها. يمكن أن يؤدي التأخير أو العيب في معالجة شظايا أوكازاكي أيضا إلى تكوين ssDNA. أخيرا ، إذا واجهت شوكة النسخ المتماثل على حبلا رائدا آفة توقف ، بوليميراز الحمض النووي ، والبريماز ، يمكن ل PRIMPOL إعادة تنظيم التوليف في اتجاه مجرى النهر ، تاركا فجوة ssDNA خلف13,14.
من الواضح أن معظم هذه الأحداث تحدث إما عندما تواجه آلية تكرار الحمض النووي آفات جينومية أو أثناء الإصلاح المقترن بالتكرار ، مما يشير إلى أن تلف الحمض النووي العالي يؤدي إلى زيادة مستويات ssDNA. نظرا لأن العديد من هذه الأحداث مرتبطة بالنسخ المتماثل ، فإن تكوين ssDNA يعتبر علامة "إجهاد النسخ المتماثل" في الخلايا15,16.
هنا ، نصف مقايسة يمكن استخدامها لتحديد كمية ssDNA في الخلايا بشكل موثوق. إن بساطة هذا النهج وقابليته للتكرار وفوائد التكلفة تجعله قابلا للاستخدام لتقييم استجابة إجهاد النسخ المتماثل في الخلايا. كشفت الدراسات الناشئة أن مستوى ssDNA يمكن أن يكون أيضا مؤشرا على الاستجابات للعلاج الكيميائي ، مثل مثبطات إنزيمات PARP1 / 2 ، ATR ، و Wee1 kinase17،18،19،20،21. يتم متابعة هذه المثبطات في نظام العلاج للعديد من HGSOCs22. لذلك ، يمكن أن يكون هذا الفحص أيضا أداة مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية الكيميائية في خلايا سرطان المبيض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

إجهاد النسخ المتماثل هو السمة المميزة للعديد من سرطانات المبيض. يمكن أن ينشأ إجهاد النسخ المتماثل من مصادر متعددة ، بما في ذلك فواصل الشريط المزدوج ، أو تعارضات النسخ والتكرار ، أو تضخم الجينات المسرطنة ، مما يؤدي حتما إلى توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA). وبالتالي ، فإن القياس الكمي ل ssDNA يمثل فرصة لتقييم مستوى إجهاد النسخ المتماثل في أنواع الخلايا المختلفة وتحت ظروف أو علاجات مختلفة مدمرة للحمض النووي. تشير الأدلة الناشئة أيضا إلى أن ssDNA يمكن أن يكون مؤشرا على الاستجابات لأدوية العلاج الكيميائي التي تستهدف إصلاح الحمض النووي. هنا ، نصف منهجية مفصلة قائمة على التألق المناعي لتحديد ssDNA. تتضمن هذه المنهجية تسمية الجينوم بنظير ثيميدين ، يليه الكشف القائم على الأجسام المضادة للتناظرية في الكروماتين في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة الجينوم. يمكن تصور امتدادات ssDNA كبؤر تحت مجهر مضان. يرتبط عدد وشدة البؤر ارتباطا مباشرا بمستوى ssDNA الموجود في النواة. نصف أيضا خط أنابيب آلي لتحديد إشارة ssDNA. الطريقة سريعة وقابلة للتكرار. علاوة على ذلك ، فإن بساطة هذه المنهجية تجعلها قابلة للتطبيقات عالية الإنتاجية مثل الأدوية والشاشات الجينية.

يوضح الشكل 4 الصور التمثيلية والقياس الكمي لبؤر IdU من النوى المشتقة من الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة ب 0.5 mM هيدروكسي يوريا لمدة 24 ساعة. كلتا النواتين ملطختان ويمكن التعرف عليهما في قناة DAPI. يتكون تحليل هذه الصور من تحديد عدد البؤر في كل نواة. عدد البؤر يتناسب مع درجة...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

نصف هنا طريقة قائمة على التألق المناعي لتحديد مستويات الحمض النووي أحادي الشريط في الخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة والقابلة للتكرار لفحص إجهاد النسخ المتماثل ، وهي سمة شائعة في العديد من سرطانات المبيض. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق هذا الفحص مع خط أنابيب التحليل الآلي ، مما يزيد من كفاءته.

قياس إجهاد النسخ المتماثل في خلايا سرطان المبيض باستخدام التألق المناعي للحمض النووي أحادي الشريط

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

يقدم بروتوكولنا طريقة عالية الكفاءة وقابلة للتكرار بسهولة لتحديد كمية الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل ، وهو علامة على إجهاد النسخ المتماثل في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح بساطته بالتطبيقات والشاشات عالية الإنتاجية. على وجه الخصوص ، تسمح هذه الطريقة بالقياس الكمي السريع لإجهاد النسخ المتماثل ، وهي السمة المميزة للعديد من سرطانات المبيض.كما أنه قابل لبرنامج التحليل التلقائي المضيف ، مما يزيد من الكفاءة. يتم الآن اعتبار الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل بنشاط كعلامة حيوية للاستجابة للعلاج الكيميائي الذي يستهدف مسارات إصلاح الحمض النووي. ومن ثم ، فإن هذه الطريقة قابلة للتطبيق بشكل كبير في هذا السيناريو.يوجد إجهاد النسخ المتماثل خارج سياقات سرطان المبيض أو سرطانات BRCA1 ، BRCA2 الناقصة. وبالتالي ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الأخرى أو سياقات المرض. للبدء ، قم بعمل زلات غطاء مطلية بالبولي ليسين عن طريق إضافة زلات غطاء بقطر 12 مم ومحلول بوليسين إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ، وضعه على كرسي متأرجح لمدة 15 دقيقة.نضح الحل على غطاء زراعة الأنسجة. اغسل زلات الغطاء بإضافة ماء معقم ، وضع الأنبوب الذي يحتوي على الغطاء ينزلق مرة أخرى على الروك لمدة خمس دقائق. بعد غسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات ، استنشاق الماء من الأنبوب ونشر زلات الغطاء على طبق معقم.نضح الماء المتبقي واتركه يجف في غطاء زراعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة أو حتى لا تبقى قطرات الماء. بمجرد أن يجف ، أغلق الطبق باستخدام Parafilm وضعه على حرارة 4 درجات مئوية. لمنع انفصال الخلايا عن انزلاق الغطاء أثناء خطوة ما قبل الاستخراج ، ضع زلة غطاء واحدة مطلية بالبولي ليسين في كل بئر من لوحة 24 بئرا.بمجرد أن تصل خلايا OVCAR3 إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، قم بشفط الوسط من اللوحة واغسل الخلايا ب 5 إلى 7 ملليلتر من PBS. نضح برنامج تلفزيوني من اللوحة. بعد استنشاق برنامج تلفزيوني ، أضف 1 ملليلتر من 0.25٪ تربسين وضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 إلى 10 دقائق أو حتى تنطلق الخلايا من قاع اللوحة.اجمع الخلايا التي تحتوي على 5 إلى 10 ملليلتر من الوسط وأضف تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي. عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم باستخدام الإجراءات القياسية. بعد ذلك ، قم بتخفيف تعليق الخلية ، واحصل على رقم ينتج عنه التقاء بنسبة 70 إلى 80٪ بعد ثلاث مجموعات سكانية.أضف 1 ملليلتر من تعليق الخلية على زلات غطاء البولي ليسين الموضوعة في آبار صفيحة 24 بئرا ، وقم بتنمية الخلايا في وسط الاستزراع في ظل الظروف القياسية. بعد مضاعفة عدد السكان ، قم باستنشاق الوسائط الموجودة من اللوحة ونبض الخلايا باستخدام 10 ميكرومولار IdU لمضاعفة السكان اللاحقة. لحصاد الخلايا ، استبدل الوسط بالثلج البارد 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة خمس دقائق.لتثبيت الخلايا ، نضح PBSTx واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة مع 3٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث إلى أربع غسلات باستخدام برنامج تلفزيوني ، احتفظ بالخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. بعد التثبيت ، قم بتخلل الخلايا باستخدام 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة خمس دقائق ، مع التأكد من تغطية انزلاق الغطاء بالكامل.بعد غسل الخلايا ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 1 ملليلتر من 0.2٪ PBST في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط PBST ومنع العينات باستخدام 5٪ BSA المصنوع في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للتلطيخ المناعي ، قم بإعداد غرفة موحدة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة على Tupperware ذات قاع مسطح. قم بتغطية غطاء اللوحة المكون من 24 بئرا باستخدام Parafilm.ضعه في الغرفة المرطبة وضع زلات الغطاء على غطاء اللوحة. أضف 60 ميكرولترا من الجسم المضاد للماوس الأساسي المخفف المضاد ل BrdU أعلى قسيمة الغطاء. بدلا من ذلك ، لتقليل الجسم المضاد من الجفاف واستخدام حجم أقل ، ضع قطرة من الجسم المضاد المخفف على Parafilm واقلب الغطاء المنزلق عليه.ثم احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، نضح الجسم المضاد الأساسي. أعد الغطاء ينزلق مرة أخرى إلى طبق مكون من 24 بئرا واغسله بنسبة 0.2٪ PBST أربع مرات.أضف جسما مضادا ثانويا مخففا على زلة الغطاء كما هو موضح سابقا ، واحتضنه لمدة ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. قم بتسمية شريحة مجهر وقم بتركيب انزلاق الغطاء على الشرائح باستخدام وسيط تركيب DAPI. قم بتخزين الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة إذا كان وسيط التثبيت بحاجة إلى المعالجة أو التصلب.كانت النوى المشتقة من الخلايا غير المعالجة والمعالجة التي تحتوي على 0.5 مليمولار هيدروكسي يوريا ملطخة ويمكن التعرف عليها في قنوات DAPI و IdU. يتكون تحليل هذه الصور من تحديد عدد البؤر في كل نواة. عدد البؤر يتناسب مع درجة إجهاد النسخ المتماثل.من المهم مراعاة وقت مضاعفة خط الخلية المختار لأن وقت نبض IdU قد يختلف لفترات مضاعفة أطول أو أقصر. بدلا من ذلك، يمكننا فحص الخلايا بحثا عن البروتين المتماثل A لتأكيد النتائج وتقييم استجابات إجهاد التضاعف المختلفة في الخلايا. تستخدم هذه التقنية للعديد من خطوط الخلايا جنبا إلى جنب مع أي عامل يسبب تلف الحمض النووي لفحص تراكم الحمض النووي أحادي التوتر.وبالتالي ، فإن هذه الطريقة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع وقابلة للتطبيق.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

تقييم أضرار الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

نمذجة آثار الإجهاد الدموي على الخلايا السرطانية المتداولة باستخدام حقنة وإبرة

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...