Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

PV er støttet af Inaugural Pedal the Cause Grant af Alvin J. Siteman Cancer Center gennem The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant fra Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant fra Mary Kay Ash Foundation og V-Foundation. NR støttes af NIH Cell and Molecular Biology uddannelse T32 tilskud til Washington University, St. Louis.

BEMÆRK: Ovariecancercellelinjen, OVCAR3, blev brugt i disse trin, men denne protokol er bredt anvendelig til flere andre cellelinjer, herunder dem, der stammer fra ikke-ovariekilder. Et skema over protokollen er vist i figur 2.
1. Plating cellerne
<ol><li>Lav poly-L-lysinbelagte coverslips.<ol><li>Tilsæt autoklaverede dæksler med en diameter på 12 mm til et 50 ml konisk rør med poly-L-lysinopløsning, og læg dem på en vippeknap i 15 minut...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

Som nævnt i protokollen er det værdifuldt at inkludere nogle få eksperimentelle kontroller for at sikre, at analysen fungerer. Disse omfatter en ingen IdU-behandlet prøve samt en prøve uden primært antistof. Begge negative kontroller skal give celler, der er farvet af DAPI, men ikke indeholder noget IdU-signal.
Baseret på de anvendte forsøgsbetingelser og cellelinjer kan forskellige antistoffortyndinger være nødvendige for at opnå det bedste fluorescerende signal. For meget signal k...

Genomisk DNA udsættes ofte for flere angreb fra forskellige endogene og eksogene kilder1. Hyppigheden af endogen skade korrelerer direkte med niveauerne af metaboliske biprodukter, såsom reaktive iltarter eller aldehyder, som i sig selv er højere i flere kræftformer, herunder kræft i æggestokkene 2,3. Det er bydende nødvendigt, at DNA-skader løses effektivt; Ellers kan det fremme genotoksiske læsioner og dermed mutagenese. Cellernes evne til at reparere genotoksiske læsioner afhænger af funktionaliteten af fejlfri DNA-reparationsveje og effektiv regulering af cellecyklusprogression som reaktion på DNA-skader. Især bærer mange ovariecancer funktionelt inaktiverende mutationer i p53 og har således et defekt G1 / S-kontrolpunkt, hvilket fører cellerne til at indlede DNA-replikation på trods af tilstedeværelsen af ureparerede genomiske læsioner 4,5. Graden af DNA-skader i kræft i æggestokkene forværres yderligere af observationen af, at mere end 50% af højkvalitets serøst ovariekarcinom (HGSOC) har defekter i BRCA1- og BRCA2-medieret homolog rekombination, den fejlfri DNA-reparationsvej, og omkring 20% har amplifikation i genet CCNE1, som for tidligt skubber G1-celler ind i S-fase6 . Sammen forbedrer den høje frekvens af endogene DNA-skader, defekte kontrolpunkter og funktionsdygtige reparationsveje eksponentielt akkumuleringen af genomiske læsioner i kræft i æggestokkene. Disse læsioner kan tjene som hindringer for progressionen af kritiske cellulære processer såsom DNA-replikation og transkription. Som diskuteret nedenfor katalyserer sådanne hindringer dannelsen af enkeltstrenget DNA (ssDNA) i celler.
Den dobbelte helix af DNA er afgørende for at beskytte genomet mod flere mutagene processer, såsom spontan depurination og depyrimidination, aktiviteten af cytosindeaminaser og oxidativ DNA-skade 1,7. I modsætning hertil er ssDNA meget sårbart over for disse mutationshændelser. Flere processer i celler kan resultere i generering af ssDNA (figur 1). Disse omfatter følgende:
(i) Standsning af DNA-replikationsmaskineriet: Dette fører til en afkobling af DNA-helicasen og polymerasen, hvilket efterlader strækninger af ssDNA 8,9.
(ii) Standsning af transkriptionsmaskineriet: Vedvarende standsning af RNA-polymerase fører til generering af trestrengede hybrid-DNA/RNA-strukturer kaldet R-sløjfer. R-loop-dannelse afslører det forskudte, ikke-transskriberede DNA som en enkelt streng10.
(iii) DNA-end-resektion: Initiering af homologi-rettet reparation kræver generering af et 3' ssDNA for at katalysere søgningen efter en homolog sekvens11.
(iv) D-loop: Strenginvasion under homolog rekombination kan resultere i forskydning af den ikke-skabelonkomplementære streng, hvilket resulterer i ssDNA12.
(v) Replikationskoblede huller: Under DNA-replikation sker forsinket strengsyntese på en diskontinuerlig måde, hvorved Okazaki-fragmenter først genereres og derefter ligeres. En forsinkelse eller defekt i behandlingen af Okazaki-fragmenterne kan også resultere i dannelse af ssDNA. Endelig, hvis replikationsgaflen på en førende streng støder på en stallende læsion, DNA-polymerase og primase, kan PRIMPOL genprime syntesen nedstrøms og efterlade et ssDNA-hul bag13,14.
Det er klart, at de fleste af disse begivenheder enten sker, når DNA-replikationsmaskineriet står over for genomiske læsioner eller under replikationskoblet reparation, hvilket tyder på, at højere DNA-skader fører til øgede niveauer af ssDNA. Da mange af disse hændelser er replikationsassocierede, betragtes dannelsen af ssDNA som markøren for "replikationsstress" i cellerne15,16.
Her beskriver vi et assay, der kan bruges til pålideligt at kvantificere ssDNA i celler. Enkelheden, reproducerbarheden og omkostningsfordelene ved denne tilgang gør det muligt at bruge den til vurdering af replikationsstressresponsen i celler. Nye undersøgelser har afsløret, at niveauet af ssDNA også kan være en forudsigelse for reaktioner på kemoterapi, såsom hæmmere af PARP1/2 enzymer, ATR og Wee1 kinase 17,18,19,20,21. Disse hæmmere forfølges i behandlingsregimen for flere HGSOC'er22. Derfor kan dette assay også være et nyttigt værktøj til at forudsige kemoterapeutiske reaktioner i ovariecancerceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

Replikationsstress er et kendetegn for flere kræft i æggestokkene. Replikationsstress kan opstå fra flere kilder, herunder dobbeltstrengsbrud, transkriptionsreplikationskonflikter eller forstærkede onkogener, hvilket uundgåeligt resulterer i generering af enkeltstrenget DNA (ssDNA). Kvantificering af ssDNA giver derfor mulighed for at vurdere niveauet af replikationsstress i forskellige celletyper og under forskellige DNA-skadelige tilstande eller behandlinger. Nye beviser tyder også på, at ssDNA kan være en forudsigelse for reaktioner på kemoterapeutiske lægemidler, der er målrettet mod DNA-reparation. Her beskriver vi en detaljeret immunfluorescensbaseret metode til kvantificering af ssDNA. Denne metode indebærer mærkning af genomet med en thymidinanalog efterfulgt af den antistofbaserede påvisning af analogen ved kromatinet under ikke-denaturerende betingelser. Strækninger af ssDNA kan visualiseres som foci under et fluorescensmikroskop. Antallet og intensiteten af foci korrelerer direkte med niveauet af ssDNA, der er til stede i kernen. Vi beskriver også en automatiseret pipeline til kvantificering af ssDNA-signalet. Metoden er hurtig og reproducerbar. Desuden gør enkelheden i denne metode den modtagelig for applikationer med høj kapacitet såsom lægemiddel- og genetiske skærme.

Figur 4 viser repræsentative billeder og kvantificering af IdU-foci fra kernerne fra de ubehandlede celler og celler behandlet med 0,5 mM hydroxyurea i 24 timer. Begge kerner er farvede og identificerbare i DAPI-kanalen. Analysen af disse billeder består i at kvantificere antallet af foci i hver kerne. Antallet af foci er proportional med graden af replikationsstress.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Her beskriver vi en immunfluorescensbaseret metode til at kvantificere niveauerne af enkeltstrenget DNA i celler. Denne effektive og reproducerbare metode kan bruges til at undersøge replikationsstress, et fælles træk ved flere kræft i æggestokkene. Derudover er dette assay kompatibelt med en automatiseret analysepipeline, hvilket yderligere øger dens effektivitet.

Kvantificering af replikationsstress i ovariecancerceller ved hjælp af enkeltstrenget DNA-immunofluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Vores protokol præsenterer en yderst effektiv og let reproducerbar metode til kvantificering af enkeltstrenget DNA, som er en markør for replikationsstress i en række cellelinjer. Derudover giver dens enkelhed mulighed for applikationer og skærme med høj kapacitet. Denne metode muliggør især hurtig kvantificering af en replikationsstress, et kendetegn ved flere kræft i æggestokkene.Det er også acceptabelt for en vært automatisk analyse software, yderligere øge effektiviteten. Enkeltstrenget DNA betragtes nu aktivt som en biomarkør for respons på kemoterapi rettet mod DNA-reparationsveje. Derfor er denne metode meget anvendelig i dette scenario.Replikationsstress findes ud over ovariecancerkontekster eller BRCA1, BRCA2-mangelfulde kræftformer. Og dermed kan denne metode anvendes på en lang række andre celletyper eller sygdomssammenhænge. Til at begynde med skal du lave polylysinbelagte dæksler ved at tilføje autoklaverede dæksler med en diameter på 12 millimeter og polylysinopløsning til et 50 ml konisk rør og placere på en vippe i 15 minutter.Opsug opløsningen på en vævskulturhætte. Vask dækslet glider ved at tilføje sterilt vand, og læg røret med dækslet glider tilbage på vipperen i fem minutter. Efter vask glider dækslet tre gange, aspirer vand fra røret og spred dækslet glider på en steril skål.Opsug det resterende vand og lad dem tørre i vævskulturhætten i en time, eller indtil der ikke er vanddråber tilbage. Når det er tørt, forsegles skålen med Parafilm og placeres ved 4 grader Celsius. For at forhindre, at cellerne løsnes fra dækslerne under præekstraktionstrinnet, skal du placere en polylysinbelagt dæksel i hver brønd på en 24-brøndplade.Når OVCAR3-cellerne når 70 til 80% sammenløb, aspireres mediet fra pladen og vaskes cellerne med 5 til 7 ml PBS. Opsug PBS fra pladen. Efter opsugning af PBS tilsættes 1 ml 0,25% trypsin og anbringes skålen i inkubatoren ved 37 grader Celsius i 8 til 10 minutter, eller indtil cellerne løfter sig fra bunden af pladen.Saml cellerne med 5 til 10 ml medium og tilsæt cellesuspensionen til et konisk rør. Tæl cellerne manuelt med et hæmocytometer ved hjælp af standardprocedurer. Fortynd derefter cellesuspensionen, og opnå et tal, der vil give 70 til 80% sammenløb efter tre populationer.Tilsæt 1 ml cellesuspension på polylysindækselsedler placeret i brøndene på en 24-brøndplade, og dyrk cellerne i dyrkningsmediet under standardbetingelser. Efter en populationsfordobling aspireres de eksisterende medier fra pladen og pulseres cellerne med 10 mikromolær IdU for de to efterfølgende populationsfordoblinger. For at høste cellerne skal du udskifte mediet med iskold 0,5% PBSTx på is i fem minutter.Til fiksering af celler aspirateres PBSTx og inkuberes cellerne i 15 minutter med 3% paraformaldehyd ved stuetemperatur. Efter tre til fire vaske med PBS skal faste celler holdes ved 4 grader Celsius indtil yderligere brug. Efter fiksering permeabiliseres cellerne ved hjælp af 0,5% PBSTx på is i fem minutter, hvilket sikrer, at hele dækslet dækkes.Efter vask af cellerne tre til fire gange med 1 milliliter 0,2% PBST ved stuetemperatur, aspireres PBST og blokeres prøverne ved hjælp af 5% BSA fremstillet i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Til immunfarvning skal du forberede et samlet kammer ved at lægge et vådt papirhåndklæde på en fladbundet Tupperware. Dæk tallerkenlåget med 24 brønde med parafilm.Anbring det i det befugtede kammer, og læg dækselsedlerne på pladelåget. Tilsæt 60 mikroliter fortyndet anti-BrdU primært museantistof på toppen af dækselsedlen. Alternativt, for at reducere antistoffet fra tørring og bruge mindre volumen, skal du placere en dråbe fortyndet antistof på parafilmen og vende dækslet glide på det.Derefter inkuberes i en time ved 37 grader Celsius. Efter inkubation aspireres det primære antistof. Sæt dækslet tilbage på en tallerken med 24 brønde, og vask dem med 0,2 % PBST fire gange.Tilsæt fortyndet sekundært antistof på dæksedlen som vist tidligere, og inkuber i en time i mørke ved stuetemperatur. Mærk et mikroskopglas og monter dækslet på diasene med DAPI-monteringsmedium. Opbevar dias i mørke ved stuetemperatur i 24 timer, hvis monteringsmediet skal hærdes eller hærdes.Kernerne afledt af de ubehandlede og behandlede celler med 0,5 millimolært hydroxyurea blev farvet og identificerbare i DAPI- og IdU-kanalerne. Analysen af disse billeder består i at kvantificere antallet af foci i hver kerne. Antallet af foci er proportional med graden af replikationsstress.Det er vigtigt at overveje fordoblingstiden for den valgte cellelinje, da tidspunktet for IdU-pulsering kan variere i længere eller kortere fordoblingsperioder. Alternativt kan vi undersøge celler for replikationsprotein A for at bekræfte resultaterne og vurdere forskellige replikationsstressresponser i celler. Denne teknik bruges til mange cellelinjer sammen med ethvert DNA-skadefremkaldende middel til at undersøge akkumuleringen af enkeltanstrengt DNA.Således er denne metode bredt tilgængelig og anvendelig.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Modificeret Terminal Restriktion Fragment Analyse til kvantificering af telomer længde ved brug af in-gel hybridisering

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluering af In Vitro DNA skader med Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering af tumorceller ved hjælp af en medicinsk Wire for optager cirkulerende tumorceller: en 3D tilgang baseret på immunofluorescens og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Kendetegner DNA reparationsprocesser på forbigående og langvarig dobbelt-strenget DNA pauser ved immunfluorescens mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Imaging af DNA-skader og reparation Foci i Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Modellering virkningerne af hæmodynamisk stress på cirkulerende tumorceller ved hjælp af en sprøjte og nål

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer patientafledte organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...