Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
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PV wird durch den Inaugural Pedal the Cause Grant des Alvin J. Siteman Cancer Center durch die Foundation for Barnes-Jewish Hospital, den Pilot Research Grant des Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, den Cancer Research Grant der Mary Kay Ash Foundation und die V-Foundation unterstützt. NR wird durch das NIH Cell and Molecular Biology Training T32 Grant an der Washington University, St. Louis, unterstützt.

HINWEIS: In diesen Schritten wurde die Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR3 verwendet, aber dieses Protokoll ist allgemein auf mehrere andere Zelllinien anwendbar, einschließlich solcher, die aus nicht-ovariellen Quellen stammen. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt.
1. Plattieren der Zellen
<ol><li>Stellen Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser her.<ol><li>Autoklavierte Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in ein koni...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. 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A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

Wie im Protokoll erwähnt, ist es wertvoll, einige experimentelle Kontrollen einzubeziehen, um sicherzustellen, dass der Assay funktioniert. Dazu gehören sowohl eine nicht IdU-behandelte Probe als auch eine nicht mit Primärantikörpern behandelte Probe. Beide Negativkontrollen sollten Zellen liefern, die durch DAPI gefärbt sind, aber kein IdU-Signal enthalten.
Basierend auf den experimentellen Bedingungen und den verwendeten Zelllinien können unterschiedliche Antikörperverdünnungen erfor...

Genomische DNA ist häufig mehreren Angriffen aus verschiedenen endogenen und exogenen Quellen ausgesetzt1. Die Häufigkeit endogener Schäden korreliert direkt mit den Konzentrationen von Stoffwechselnebenprodukten wie reaktiven Sauerstoffspezies oder Aldehyden, die bei mehreren Krebsarten, einschließlich Eierstockkrebs, intrinsisch höher sind 2,3. Es ist zwingend erforderlich, dass DNA-Schäden effizient behoben werden. Andernfalls kann es genotoxische Läsionen und folglich Mutagenese fördern. Die Fähigkeit von Zellen, genotoxische Läsionen zu reparieren, hängt von der Funktionalität fehlerfreier DNA-Reparaturwege und der effizienten Regulation des Zellzyklusverlaufs als Reaktion auf DNA-Schäden ab. Bemerkenswert ist, dass viele Eierstockkarzinome funktionell inaktivierende Mutationen in p53 tragen und somit einen defekten G1/S-Checkpoint aufweisen, der dazu führt, dass die Zellen trotz des Vorhandenseins nicht reparierter genomischer Läsionen eine DNA-Replikation initiieren 4,5. Das Ausmaß der DNA-Schädigung bei Ovarialkarzinomen wird durch die Beobachtung noch verstärkt, dass mehr als 50% der hochgradigen serösen Ovarialkarzinome (HGSOC) Defekte in der BRCA1- und BRCA2-vermittelten homologen Rekombination, dem fehlerfreien DNA-Reparaturweg, und etwa 20% eine Amplifikation im Gen CCNE1 aufweisen, das G1-Zellen vorzeitig in die S-Phase6 drängt . Zusammen erhöht die hohe Häufigkeit von endogenen DNA-Schäden, defekten Checkpoints und fehlerhaften Reparaturwegen die Akkumulation genomischer Läsionen bei Eierstockkrebs exponentiell. Diese Läsionen können als Hindernisse für das Fortschreiten kritischer zellulärer Prozesse wie DNA-Replikation und -Transkription dienen. Wie weiter unten erörtert, katalysieren solche Hindernisse die Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) in Zellen.
Die Doppelhelix der DNA ist entscheidend für den Schutz des Genoms vor mehreren mutagenen Prozessen, wie z. B. spontaner Depurinierung und Depyrimidinierung, der Aktivität von Cytosin-Desaminasen und oxidativen DNA-Schäden 1,7. Im Gegensatz dazu ist ssDNA sehr anfällig für diese Mutationsereignisse. Mehrere Prozesse in Zellen können zur Erzeugung von ssDNA führen (Abbildung 1). Dazu gehören die folgenden:
(i) Stillstand der DNA-Replikationsmaschinerie: Dies führt zu einer Entkopplung der DNA-Helikase und der Polymerase, wobei Abschnitte der ssDNA 8,9 zurückbleiben.
(ii) Stillstand der Transkriptionsmaschinerie: Anhaltendes Abwürgen der RNA-Polymerase führt zur Erzeugung von dreisträngigen hybriden DNA/RNA-Strukturen, die als R-Schleifen bezeichnet werden. Bei der Bildung von R-Schleifen wird die verschobene, nicht transkribierte DNA als Einzelstrang10 freigelegt.
(iii) DNA-Endresektion: Die Initiierung einer homologiegesteuerten Reparatur erfordert die Erzeugung einer 3'-ssDNA, um die Suche nach einer homologen Sequenz11 zu katalysieren.
(iv) D-Schleife: Die Stranginvasion während der homologen Rekombination kann zur Verschiebung des komplementären Nicht-Template-Strangs führen, was zu ssDNA12 führt.
(v) Replikationsgekoppelte Lücken: Während der DNA-Replikation erfolgt die verzögerte Strangsynthese diskontinuierlich, wobei Okazaki-Fragmente zuerst erzeugt und dann ligiert werden. Eine Verzögerung oder ein Defekt bei der Verarbeitung der Okazaki-Fragmente kann ebenfalls zur Bildung von ssDNA führen. Wenn schließlich die Replikationsgabel an einem führenden Strang auf eine stockende Läsion, DNA-Polymerase und Primase stößt, kann PRIMPOL die Synthese stromabwärts reprimieren und eine ssDNA-Lücke hinter13,14 hinterlassen.
Offensichtlich treten die meisten dieser Ereignisse entweder auf, wenn die DNA-Replikationsmaschinerie genomischen Läsionen ausgesetzt ist, oder während der replikationsgekoppelten Reparatur, was darauf hindeutet, dass höhere DNA-Schäden zu erhöhten ssDNA-Spiegeln führen. Da viele dieser Ereignisse replikationsassoziiert sind, wird die Bildung von ssDNA als Marker für "Replikationsstress" in Zellen angesehen15,16.
Hier beschreiben wir einen Assay, mit dem ssDNA in Zellen zuverlässig quantifiziert werden kann. Die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Kostenvorteile dieses Ansatzes machen es möglich, ihn für die Beurteilung der Replikationsstressantwort in Zellen zu verwenden. Neue Studien haben gezeigt, dass der Gehalt an ssDNA auch ein Prädiktor für das Ansprechen auf eine Chemotherapie sein kann, wie z. B. Inhibitoren von PARP1/2-Enzymen, ATR und Wee1-Kinase 17,18,19,20,21. Diese Inhibitoren werden im Behandlungsschema mehrerer HGSOCs22 verfolgt. Daher kann dieser Assay auch ein nützliches Werkzeug sein, um chemotherapeutische Reaktionen in Eierstockkrebszellen vorherzusagen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

Replikationsstress ist ein Kennzeichen mehrerer Eierstockkrebsarten. Replikationsstress kann aus mehreren Quellen entstehen, einschließlich Doppelstrangbrüchen, Transkriptions-Replikationskonflikten oder amplifizierten Onkogenen, was unweigerlich zur Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) führt. Die Quantifizierung der ssDNA bietet daher die Möglichkeit, das Ausmaß des Replikationsstresses in verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen DNA-schädigenden Bedingungen oder Behandlungen zu bewerten. Neue Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass ssDNA ein Prädiktor für das Ansprechen auf Chemotherapeutika sein kann, die auf die DNA-Reparatur abzielen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Immunfluoreszenz-basierte Methodik zur Quantifizierung von ssDNA. Diese Methodik beinhaltet die Markierung des Genoms mit einem Thymidin-Analogon, gefolgt von der antikörperbasierten Detektion des Analogons am Chromatin unter nicht denaturierenden Bedingungen. Abschnitte der ssDNA können als Herde unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Die Anzahl und Intensität der Herde steht in direktem Zusammenhang mit dem im Zellkern vorhandenen ssDNA-Gehalt. Wir beschreiben auch eine automatisierte Pipeline zur Quantifizierung des ssDNA-Signals. Die Methode ist schnell und reproduzierbar. Darüber hinaus macht die Einfachheit dieser Methodik sie für Hochdurchsatzanwendungen wie Arzneimittel- und genetische Screenings zugänglich.

Repräsentative Bilder und die Quantifizierung der IdU-Herde aus den Kernen, die von den unbehandelten Zellen und den mit 0,5 mM Hydroxyharnstoff für 24 h behandelten Zellen stammen, sind in Abbildung 4 dargestellt. Beide Kerne sind im DAPI-Kanal gefärbt und identifizierbar. Die Analyse dieser Bilder besteht darin, die Anzahl der Herde in jedem Kern zu quantifizieren. Die Anzahl der Herde ist proportional zum Grad der Replikationsspannung.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-toge...

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Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Hier beschreiben wir eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Quantifizierung des Gehalts an einzelsträngiger DNA in Zellen. Diese effiziente und reproduzierbare Methode kann verwendet werden, um den Replikationsstress zu untersuchen, ein häufiges Merkmal bei mehreren Eierstockkrebsarten. Darüber hinaus ist dieser Assay mit einer automatisierten Analysepipeline kompatibel, was seine Effizienz weiter erhöht.

Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Unser Protokoll stellt eine hocheffiziente und leicht reproduzierbare Methode zur Quantifizierung einzelsträngiger DNA dar, die ein Marker für Replikationsstress in einer Vielzahl von Zelllinien ist. Darüber hinaus ermöglicht seine Einfachheit Anwendungen und Bildschirme mit hohem Durchsatz. Insbesondere ermöglicht diese Methode eine schnelle Quantifizierung eines Replikationsstresses, ein Kennzeichen mehrerer Eierstockkrebsarten.Es ist auch für eine automatische Host-Analysesoftware geeignet, was die Effizienz weiter steigert. Einzelsträngige DNA wird jetzt aktiv als Biomarker für das Ansprechen auf eine Chemotherapie in Betracht gezogen, die auf DNA-Reparaturwege abzielt. Daher ist diese Methode in diesem Szenario sehr gut anwendbar.Replikationsstress existiert jenseits von Eierstockkrebskontexten oder BRCA1- und BRCA2-defizienten Krebsarten. Und so kann diese Methode auf eine Vielzahl anderer Zelltypen oder Krankheitskontexte angewendet werden. Stellen Sie zunächst polylysinbeschichtete Deckgläser her, indem Sie autoklavierte Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 Millimetern und Polylysinlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben und 15 Minuten lang auf eine Wippe legen.Saugen Sie die Lösung auf einer Gewebekulturhaube ab. Waschen Sie die Deckgläser mit sterilem Wasser und legen Sie das Röhrchen mit den Deckgläsern fünf Minuten lang wieder auf die Wippe. Nach dreimaligem Waschen der Deckgläser Wasser aus dem Röhrchen absaugen und die Deckgläser auf einer sterilen Schale verteilen.Saugen Sie das restliche Wasser ab und lassen Sie es eine Stunde lang in der Gewebekulturhaube trocknen oder bis keine Wassertropfen mehr vorhanden sind. Verschließen Sie die Schale nach dem Trocknen mit Parafilm und stellen Sie sie auf 4 Grad Celsius. Um zu verhindern, dass sich die Zellen während des Vorextraktionsschritts von den Deckgläsern lösen, legen Sie ein polylysinbeschichtetes Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.Sobald die OVCAR3-Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, saugen Sie das Medium von der Platte ab und waschen Sie die Zellen mit 5 bis 7 Millilitern PBS. Saugen Sie das PBS von der Platte ab. Fügen Sie nach dem Absaugen des PBS 1 Milliliter 0,25% Trypsin hinzu und stellen Sie die Schale 8 bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator oder bis sich die Zellen vom Boden der Platte abheben.Sammeln Sie die Zellen mit 5 bis 10 Millilitern Medium und geben Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer unter Verwendung von Standardverfahren. Als nächstes verdünnen Sie die Zellsuspension und erhalten Sie eine Zahl, die nach drei Populationen 70 bis 80% Konfluenz ergibt.Fügen Sie 1 Milliliter Zellsuspension auf Polylysin-Deckgläser hinzu, die in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte gegeben werden, und züchten Sie die Zellen im Kulturmedium unter Standardbedingungen. Nach einer Populationsverdopplung werden die vorhandenen Medien von der Platte abgesaugt und die Zellen mit 10 mikromolaren IdU für die beiden nachfolgenden Populationsverdopplungen gepulst. Um die Zellen zu ernten, ersetzen Sie das Medium fünf Minuten lang durch eiskaltes 0,5%PBSTx auf Eis.Zur Fixierung der Zellen PBSTx absaugen und die Zellen 15 Minuten lang mit 3% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur inkubieren. Halten Sie die Zellen nach drei bis vier Wäschen mit PBS bis zur weiteren Verwendung bei 4 Grad Celsius. Nach der Fixierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% PBSTx fünf Minuten lang auf Eis und stellen Sie sicher, dass das gesamte Deckglas bedeckt ist.Nachdem Sie die Zellen drei- bis viermal mit 1 Milliliter 0,2% PBST bei Raumtemperatur gewaschen haben, saugen Sie das PBST ab und blockieren Sie die Proben mit 5% BSA aus PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie für die Immunfärbung eine einheitliche Kammer vor, indem Sie ein feuchtes Papiertuch auf eine Tupperware mit flachem Boden legen. Decken Sie den 24-Well-Plattendeckel mit Parafilm ab.Legen Sie es in die befeuchtete Kammer und legen Sie die Deckgläser auf den Tellerdeckel. Fügen Sie 60 Mikroliter verdünnten primären Anti-BrdU-Maus-Antikörper auf die Oberseite des Deckglases hinzu. Um das Austrocknen des Antikörpers zu verringern und weniger Volumen zu verbrauchen, geben Sie alternativ einen Tropfen verdünnten Antikörper auf den Parafilm und drehen Sie das Deckglas darauf.Dann eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation den primären Antikörper absaugen. Legen Sie die Deckgläser wieder auf eine 24-Well-Platte und waschen Sie sie viermal mit 0,2 % PBST.Fügen Sie verdünnten sekundären Antikörper auf das Deckglas hinzu, wie zuvor gezeigt, und inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Beschriften Sie einen Objektträger und montieren Sie das Deckglas mit DAPI-Einhängemedium auf die Objektträger. Lagern Sie Objektträger 24 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, wenn das Montagemedium ausgehärtet oder gehärtet werden muss.Die Kerne, die aus den unbehandelten und behandelten Zellen mit 0,5 Millimolar Hydroxyharnstoff stammten, wurden in den DAPI- und IdU-Kanälen gefärbt und identifizierbar. Die Analyse dieser Bilder besteht darin, die Anzahl der Herde in jedem Kern zu quantifizieren. Die Anzahl der Herde ist proportional zum Grad der Replikationsspannung.Es ist wichtig, die Verdopplungszeit der Zelllinie der Wahl zu berücksichtigen, da die Zeit des IdU-Pulsierens für längere oder kürzere Verdopplungszeiträume variieren kann. Alternativ können wir Zellen auf Replikationsprotein A untersuchen, um die Ergebnisse zu bestätigen und verschiedene Replikationsstressreaktionen in Zellen zu bewerten. Diese Technik wird für viele Zelllinien zusammen mit einem DNA-Schadens-induzierenden Mittel verwendet, um die Anhäufung von einfach gespannter DNA zu untersuchen.Somit ist diese Methode allgemein zugänglich und anwendbar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...