Name: quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence at JoVE.com

PV는 The Foundation for Barnes-Jewish Hospital을 통한 Alvin J. Siteman Cancer Center의 Inaugural Pedal the Cause Grant, Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research의 파일럿 연구 보조금, Mary Kay Ash Foundation 및 V-Foundation의 암 연구 보조금의 지원을 받습니다. NR은 세인트루이스 워싱턴 대학교에 대한 NIH 세포 및 분자 생물학 교육 T32 보조금의 지원을 받습니다.

참고: 난소암 세포주인 OVCAR3이 이 단계에서 사용되었지만 이 프로토콜은 비난소 공급원에서 파생된 세포주를 포함하여 여러 다른 세포주에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다.
1. 셀 도금
<ol><li>폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 만듭니다.<ol><li>폴리-L-라이신 용액이 담긴 12mL 원뿔형 튜브에 오토클?...

<ol>
	<li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer.">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency:+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer.">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li><li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer:+Unlocking+the+heterogeneity.">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).</li><li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube.">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093 (2017).</li><li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer.">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics &amp; Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li><li>Patch, A. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer.">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer.">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li><li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint.">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li><li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA.">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li><li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+a+tightrope:+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability.">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li><li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+end+resection:+Mechanism+and+control.">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li><li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair.">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+An+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models.">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer.">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574 (2021).</li><li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+but+concerted+roles+of+ATR,+DNA-PK,+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase.">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li><li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells.">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li><li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy.">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li><li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+protein+A:+Single-stranded+DNA's+first+responder:+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair.">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li><li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+and+RAD51:+Fork+reversal,+fork+protection,+and+genome+stability.">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li><li>Mar&#233;chal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li></ol>

프로토콜에서 언급했듯이 분석이 작동하는지 확인하기 위해 몇 가지 실험 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 여기에는 IdU 처리되지 않은 샘플과 1차 항체 처리되지 않은 샘플이 포함됩니다. 두 음성 대조군 모두 DAPI에 의해 염색되었지만 IdU 신호를 포함하지 않는 세포를 생성해야 합니다.
사용된 실험 조건 및 세포주에 따라 최상의 형광 신호를 얻기 위해 다양한 항체 희석?...

게놈 DNA는 다양한 내인성 및 외인성 출처의 여러 공격에 자주 노출된다1. 내인성 손상의 빈도는 난소암을 포함한 여러 암 유형에서 본질적으로 더 높은 활성산소종 또는 알데히드와 같은 대사 부산물의 수준과 직접적인 상관관계가 있다 2,3. DNA 손상을 효율적으로 해결하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 유전 독성 병변을 조장하여 결과적으로 돌연변이 유발을 일으킬 수 있습니다. 유전독성 병변을 복구하는 세포의 능력은 오류 없는 DNA 복구 경로의 기능과 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 주기 진행의 효율적인 조절에 달려 있습니다. 특히, 많은 난소암은 p53에 기능적으로 비활성화 돌연변이를 가지고 있으며, 따라서 결함이 있는 G1/S 체크포인트를 가지고 있어 복구되지 않은 게놈 병변이 있음에도 불구하고 세포가 DNA 복제를 시작하도록 유도합니다 4,5. 난소암의 DNA 손상 정도는 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 50% 이상이 BRCA1 및 BRCA2 매개 상동 재조합, 오류 없는 DNA 복구 경로에 결함이 있고 약 20%가 유전자 CCNE1에서 증폭되어 G1 세포를 S상6으로 조기에 밀어 넣는다는 관찰에 의해 더욱 복잡해집니다 . 높은 빈도의 내인성 DNA 손상, 결함 있는 체크포인트 및 오작동하는 복구 경로가 함께 난소암에서 게놈 병변의 축적을 기하급수적으로 향상시킵니다. 이러한 병변은 DNA 복제 및 전사와 같은 중요한 세포 과정의 진행에 장애가 될 수 있습니다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 이러한 장애는 세포에서 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 촉매합니다.
DNA의 이중 나선은 자발적인 정화 및 탈피리미딘, 시토신 데아미나제의 활성, 산화적 DNA 손상과 같은 여러 돌연변이 유발 과정으로부터 게놈을 보호하는 데 중요합니다 1,7. 대조적으로, ssDNA는 이러한 돌연변이 사건에 매우 취약합니다. 세포의 여러 과정으로 인해 ssDNA가 생성될 수 있습니다(그림 1). 여기에는 다음이 포함됩니다.
(i) DNA 복제 기계의 정지: 이것은 DNA 헬리카제와 중합효소의 분리로 이어져 ssDNA 8,9의 스트레칭을 남깁니다.
(ii) 전사 기계의 실속: RNA 중합효소의 지속적인 실속은 R-루프라고 하는 3가닥 하이브리드 DNA/RNA 구조의 생성으로 이어집니다. R-루프 형성은 변위되고 전사되지 않은 DNA를 단일 가닥10으로 노출시킵니다.
(iii) DNA 말단 절제술: 상동성 지향 복구의 개시는 상동 서열11에 대한 탐색을 촉매하기 위해 3' ssDNA의 생성을 필요로 한다.
(iv) D-루프: 상동성 재조합 동안 가닥 침범은 비주형 상보적 가닥의 변위를 초래하여 ssDNA12를 초래할 수 있습니다.
(v) 복제 결합 갭: DNA 복제 중에 지연 가닥 합성이 불연속적인 방식으로 발생하여 오카자키 조각이 먼저 생성된 다음 결찰됩니다. 오카자키 단편 처리의 지연 또는 결함도 ssDNA 형성을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 선행 가닥의 복제 포크가 실속 병변, DNA 중합효소 및 프리마제를 만나면 PRIMPOL은 합성 다운스트림을 리프라이밍하여13,14 뒤에 ssDNA 갭을 남길 수 있습니다.
분명히, 이러한 사건의 대부분은 DNA 복제 기계가 게놈 병변에 직면하거나 복제 결합 복구 중에 발생하며, 이는 DNA 손상이 높을수록 ssDNA 수치가 증가함을 시사합니다. 이러한 사건의 많은 부분이 복제와 관련되어 있기 때문에 ssDNA의 형성은 세포15,16에서 "복제 스트레스"의 마커로 간주됩니다.
여기에서는 세포에서 ssDNA를 안정적으로 정량화하는 데 사용할 수 있는 분석법을 설명합니다. 이 접근법의 단순성, 재현성 및 비용 이점으로 인해 세포의 복제 스트레스 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 신흥 연구는 ssDNA의 수준이 또한 PARP1/2 효소의 억제제, ATR, 및 Wee1 키나제 17,18,19,20,21과 같은 화학요법에 대한 반응의 예측인자일 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이들 억제제는 여러 HGSOCs2의 치료 요법에서 추구되고 있다. 따라서, 이 분석은 또한 난소암 세포에서 화학요법 반응을 예측하는 유용한 도구가 될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0179595</td>
			<td>10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage 
			Storage: Store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7125-5G</td>
			<td>MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia 
			Storage: Stored in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32766</td>
			<td>Light sensitive - keep in dark 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Made by adding specific mass to volume of PBS 
			Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Cover Glass&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72230-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS GA3 Software&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>77010604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCAR3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep 
			Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4832-50ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-6X500ML</td>
			<td>Storage: Store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying replication stress in ovarian cancer cells using single-stranded dna immunofluorescence

복제 스트레스는 여러 난소암의 특징입니다. 복제 스트레스는 이중 가닥 절단, 전사-복제 충돌 또는 증폭된 종양 유전자를 포함한 여러 소스에서 나타날 수 있으며, 필연적으로 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 초래합니다. 따라서 ssDNA를 정량화하면 다양한 세포 유형과 다양한 DNA 손상 조건 또는 치료에서 복제 스트레스 수준을 평가할 수 있습니다. 새로운 증거는 또한 ssDNA가 DNA 복구를 표적으로 하는 화학요법 약물에 대한 반응의 예측 인자일 수 있음을 시사합니다. 여기에서는 ssDNA를 정량화하기 위한 상세한 면역형광 기반 방법론을 설명합니다. 이 방법론은 티미딘 유사체로 게놈을 표지한 다음 비변성 조건에서 염색질에서 유사체의 항체 기반 검출을 포함합니다. ssDNA의 스트레치는 형광 현미경으로 초점으로 시각화할 수 있습니다. 병소의 수와 강도는 핵에 존재하는 ssDNA의 수준과 직접 관련이 있습니다. 또한 ssDNA 신호를 정량화하기 위한 자동화된 파이프라인에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 빠르고 재현 가능합니다. 또한 이 방법론의 단순성으로 인해 약물 및 유전자 스크리닝과 같은 고처리량 응용 분야에 적합합니다.

24시간 동안 0.5 mM 하이드록시우레아로 처리된 미처리 세포 및 세포로부터 유래된 핵으로부터의 IdU 초점의 대표 이미지 및 정량화가 도 4에 제시되어 있다. 두 핵 모두 염색되어 DAPI 채널에서 식별 가능합니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.with...

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Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

여기에서는 세포에서 단일 가닥 DNA의 수준을 정량화하는 면역형광 기반 방법을 설명합니다. 이 효율적이고 재현 가능한 방법은 여러 난소암에서 흔히 볼 수 있는 특징인 복제 스트레스를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 분석은 자동화된 분석 파이프라인과 호환되어 효율성을 더욱 높입니다.

단일 가닥 DNA 면역형광을 사용한 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

당사의 프로토콜은 다양한 세포주에서 복제 스트레스의 마커인 단일 가닥 DNA를 정량화하는 매우 효율적이고 쉽게 재현 가능한 방법을 제시합니다. 또한 단순성으로 인해 처리량이 많은 응용 프로그램과 화면이 가능합니다. 특히, 이 방법은 여러 난소암의 특징인 복제 스트레스의 신속한 정량화를 가능하게 합니다.또한 호스트 자동 분석 소프트웨어를 사용할 수 있어 효율성을 더욱 높일 수 있습니다. 단일 가닥 DNA는 현재 DNA 복구 경로를 표적으로 하는 화학 요법에 대한 반응을 위한 바이오마커로 활발히 고려되고 있습니다. 따라서 이 방법은 해당 시나리오에 매우 적합합니다.복제 스트레스는 난소암 맥락 또는 BRCA1, BRCA2 결핍 암을 넘어 존재합니다. 따라서, 이 방법은 다양한 다른 세포 유형 또는 질병 맥락에 적용될 수 있다. 시작하려면 오토클레이브 12mm 직경의 커버 슬립과 폴리라이신 용액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 추가하여 폴리라이신 코팅 커버 슬립을 만들고 로커에 15분 동안 놓습니다.조직 배양 후드에서 용액을 흡인합니다. 멸균수를 추가하여 커버 슬립을 세척하고 커버 슬립이 들어 있는 튜브를 로커에 5분 동안 다시 놓습니다. 커버 슬립을 세 번 씻은 후 튜브에서 물을 흡입하고 커버 슬립을 멸균 접시에 펼칩니다.남은 물을 흡인하고 조직 배양 후드에서 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 Parafilm으로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에 놓습니다. 사전 추출 단계 동안 커버 슬립으로부터 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해, 하나의 폴리리신 코팅된 커버 슬립을 24-웰 플레이트의 각 웰에 배치한다.OVCAR3 세포가 70 내지 80% 밀도에 도달하면, 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 세포를 5 내지 7 밀리리터의 PBS로 세척한다. 플레이트에서 PBS를 흡인합니다. PBS를 흡인 한 후 1 밀리리터의 0.25 % 트립신을 넣고 섭씨 37 도의 인큐베이터에 8-10 분 동안 또는 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려 질 때까지 접시를 놓습니다.5 내지 10 밀리리터의 배지로 세포를 모으고 세포 현탁액을 원추형 튜브에 첨가한다. 표준 절차를 사용하여 혈구계로 수동으로 세포를 계산합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 희석하고, 3 개의 집단 후에 70-80 %의 confluency를 산출 할 수있는 수를 얻는다.24-웰 플레이트의 웰에 놓인 폴리라이신 커버 슬립에 1 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가하고, 표준 조건 하에서 배양 배지에서 세포를 성장시킨다. 한 집단 배가 후, 플레이트에서 기존 배지를 흡인하고 두 개의 후속 집단 배가를 위해 10 마이크로몰 IdU로 세포를 펄스합니다. 세포를 채취하기 위해, 배지를 얼음 위에서 5분 동안 얼음 위의 얼음 차가운 0.5% PBSTx로 교체한다.세포 고정을 위해 PBSTx를 흡인하고 실온에서 3% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 3-4회 세척한 후 추가 사용이 있을 때까지 고정 셀을 섭씨 4도로 유지하십시오. 고정 후 얼음 위에서 0.5% PBSTx를 사용하여 5분 동안 세포를 투과시켜 전체 커버 슬립을 덮도록 합니다.세포를 실온에서 0.2% PBST 1밀리리터로 3 내지 4회 세척한 후, PBST를 흡인하고 PBS로 만든 5%BSA를 사용하여 시료를 실온에서 30분 동안 차단하였다. 면역 염색을 위해 평평한 바닥 Tupperware에 젖은 종이 타월을 올려 통합 챔버를 준비하십시오. 24웰 플레이트 뚜껑을 Parafilm으로 덮습니다.가습실에 넣고 플레이트 뚜껑에 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립 상단에 희석된 항-BrdU 1차 마우스 항체 60마이크로리터를 추가합니다. 또는 항체가 건조되는 것을 줄이고 부피를 줄이려면 희석된 항체 한 방울을 파라필름에 떨어뜨리고 커버 슬립을 뒤집습니다.그런 다음 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 1차 항체를 흡인한다. 커버를 다시 24-웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척한다.앞서 설명한 대로 커버 슬립에 희석된 2차 항체를 추가하고 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 DAPI 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 장착 매체를 경화 또는 경화해야 하는 경우 슬라이드를 실온의 어두운 곳에 24시간 동안 보관하십시오.0.5 밀리몰 하이드록시우레아로 처리되지 않고 처리된 세포에서 유래된 핵을 염색하고 DAPI 및 IdU 채널에서 식별할 수 있었습니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.IdU 펄스 시간은 더 길거나 더 짧은 배가 기간 동안 변할 수 있으므로 선택한 세포주의 배가 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 또는 복제 단백질 A에 대해 세포를 조사하여 결과를 확인하고 세포의 다양한 복제 스트레스 반응을 평가할 수 있습니다. 이 기술은 단일 변형된 DNA의 축적을 검사하기 위해 DNA 손상 유도제와 함께 많은 세포주에 사용됩니다.따라서 이 방법은 널리 접근 가능하고 적용 가능합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

주사기와 바늘을 사용하여 순환 종양 세포에 혈역학 적 스트레스의 효과 모델링

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...