Detta protokoll möjliggör identifiering av proteinbindningspartners av en känd RNA-sekvens genom att dra ner dem från cellulärt extrakt med användning av biotinylerade RNA-oligonukleotider. Jämfört med metoder som kräver tvättmedel eller höga temperaturer för att lossa proteinerna från RNA, använder dessa protokoll istället mycket milda förhållanden som också gör det möjligt att bevara potentiella proteinkomplex. Demonstrerar proceduren kommer att vara Jakob Rupert, doktorand enligt min bestämmelse.
Börja den totala proteinskörden genom att ta bort mediet från brunnarna på HEK 293T-cellplattan och tvätta brunnarna på de sex brunnsplattorna med en milliliter PBS. Kassera PBS och överför plattorna till is innan du tillsätter 200 mikroliter lysbuffert till varje brunn. Lossa och bryt cellerna med en cellskrapa innan du överför cellextraktet härrörande från två brunnar till samma 1,5 ml rör.
Efter 30 minuters inkubation på is och centrifugering, överför supernatanten till ett förkylt rör. Beräkna sedan volymen proteinextrakt motsvarande 1,5 milligram proteiner. Ta sedan alla prover till en slutlig volym på 600 mikroliter med hjälp av en lysbuffert.
Förvara proverna på is tills de används. För att förbereda pärlorna, blanda dem i lagringsbufferten genom att knäppa röret. Efter beräkning av 100 mikroliter uppslamningsmedium per prov, placera den beräknade volymen av uppslamningen i ett magnetiskt ställ.
För att tvätta pärlorna, ta bort lagringslösningen och tvätta pärlorna genom att tillsätta en milliliter lysbuffert och invertera den manuellt. Ta sedan bort bufferten med magnetstället och upprepa tvättsteget. Tillsätt en volym lysbuffert som är lika med den ursprungliga volymen flytgödselmedium och blanda den genom att knäppa röret innan mediet fördelas jämnt i så många 1,5 ml rör som prover.
För pärlblockering, ta bort bufferten med magnetstället och tillsätt 600 mikroliter 0,25 milligram per milliliter jäst TRNA-lösning beredd i lysbuffert. Inkubera den i en timme vid rumstemperatur på ett roterande hjul. Ta bort TRNA-lösningen med magnetstället innan du tillsätter 600 mikroliter lysbuffert och tvätta den genom att blanda manuellt.
Upprepa tvättsteget och kassera bufferten. För varje rör som innehåller de första 100 mikroliter av uppslamningsmediet, bereds 200 mikrogram RNA-oligonukleotid i 600 mikroliter lysbuffert. Tillsätt oligo till pärlorna och inkubera i en timme vid rumstemperatur medan du roterar.
Ta bort lösningen från pärlorna och tvätta två gånger med 600 mikroliter lysbuffert genom att rotera rören i fem minuter vardera vid rumstemperatur. Kassera bufferten. För proteinbindning på pärlor, separera 5% eller 30 mikroliter volym från 600 mikroliter proteinlösning och behåll den som ingång eller IN för vidare analys.
Tillsätt den återstående proteinblandningen till varje tub med laddade pärlor och inkubera med långsamma rotationer över natten vid fyra grader Celsius. Ta bort den obundna proteinfraktionen från pärlorna med hjälp av magnetstället. Spara 5% eller 30 mikroliter av volymen och märk den flöda genom eller FT. Tillsätt en milliliter tvättbuffert 1 till pärlorna och rotera den i fem minuter vid fyra grader Celsius.
Kassera bufferten och upprepa denna tvätt en gång. Tillsätt en milliliter tvättbuffert 2 till pärlorna. Och efter inkubation vid fyra grader Celsius på en rotator i fem minuter, kassera supernatanten.
För eluering av de specifika bindemedlen, tillsätt 100 mikroliter elueringsbuffert 1 till pärlorna. Efter blandning manuellt genom att snärta, inkubera den i fem minuter vid rumstemperatur. Placera rören i en termisk mixer och skaka kraftigt i fem minuter vid 95 grader Celsius.
Placera sedan röret i magnetstället och samla den eluerade fraktionen i ett rent rör. När du är klar, snurra snabbt pärlorna med en bänkcentrifug för att maximera återhämtningen av eluatet. Och spara 5% eller fem mikroliter av den totala eluat- eller EL-volymen för vidare analyser.
De eluerade proteinerna identifierades med masspektrometri. Plottning av de signifikant anrikade proteinerna i ett vulkandiagram avslöjade att det totala proteininnehållet och de anrikade proteinerna som eluerades från RNA var signifikant högre än RNA, vilket tyder på att RNA kan etablera ett högre antal specifika interaktioner. Som exempel på överensstämmelse mellan förutsagda och erhållna resultat visade interaktionspoängen för plus RNA och minus RNA med proteiner från humant proteom att HNRNPH3 förutspåddes binda plus RNA selektivt och PCBP2 att interagera specifikt med RNA.
Dessutom förutspåddes proteinet RBM41 vara promiskuöst för båda RNA-oligonukleotiderna. Masspektroskopianalysen av proteinpull-down-analysprover bekräftade närvaron av HNRNPH3 i RNA och PCBP2 i minus RNA. Medan RBM41 visade sig interagera med båda.
Western blot användes för att detektera närvaron av TDP-43 i resultaten och protokolloptimeringsstegen. I RNA observerades TDP-43 i ingångsprovet och eluatet, vilket indikerar dess närvaro från början. TDP-43 behölls av RNA under tvättstegen och eluerades i slutet med en hög saltbuffert.
Genom att kartlägga protein-RNA-interaktioner kan denna metod avslöja makromolekylära nätverk bakom många fysiologiska vägar. Till exempel transkriptionell reglering eller patologiska mekanismer inklusive cancer och neurodegeneration.
