Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tildelt F. Hoerndli). Vi vil også gerne takke Dr. Attila Stetak for pAS1-plasmidet.

1. Oprettelse af transgene stammer
<ol><li>Ved hjælp af en kloningsmetode efter eget valg8,9, klonekspressionsvektorer til at indeholde Pflp-18- eller Prig-3-promotoren (for AVA-specifikt signal i ventralnervestrengen) efterfulgt af den valgte Ca2+-indikator og derefter en 3' UTR (se diskussionen for mere information)10. En liste over plasmider og deres kilder findes i supplerende ta...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

Den første overvejelse ved implementering af den beskrevne metode indebærer valg af en Ca2+ indikator med ideelle egenskaber for det givne forskningsspørgsmål. Cytoplasmatiske Ca 2+ indikatorer har typisk en høj affinitet for Ca 2+, og følsomheden af disse indikatorer over for Ca2+ er omvendt relateret til kinetikken (on/off rate)16,17. Det betyder, at enten Ca2+ følsomhed eller kinetik skal prioritere...

Calciumioner (Ca2+) er meget alsidige bærere af information i mange celletyper. I neuroner er Ca2+ ansvarlig for den aktivitetsafhængige frigivelse af neurotransmittere, reguleringen af cytoskeletal motilitet, finjustering af metaboliske processer samt mange andre mekanismer, der kræves for korrekt neuronal vedligeholdelse og funktion 1,2. For at sikre effektiv intracellulær signalering skal neuroner opretholde lave basale Ca2+ niveauer i deres cytoplasma3. Dette opnås ved hjælp af kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, herunder optagelse af Ca2+ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse processer, ud over arrangementet af Ca 2+-permeable ionkanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene niveauer af cytoplasmatisk Ca2+ i hele neuronen.
Ca 2+ heterogenitet under hvile og neuronal aktivering giver mulighed for forskelligartet, placeringsspecifik regulering af Ca 2+-afhængige mekanismer 1. Et eksempel på de koncentrationsspecifikke virkninger af Ca 2+ er frigivelsen af Ca 2+ fra ER gennem inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP 3) receptorer. Lave Ca2+ niveauer i kombination med InsP3 er nødvendige for åbningen af receptorens calciumgennemtrængelige pore. Alternativt hæmmer høje Ca2+ niveauer både direkte og indirekte receptoren4. Betydningen af Ca 2+ homeostase for korrekt neuronal funktion understøttes af beviser, der tyder på, at forstyrret intracellulær Ca2+ håndtering og signalering er et tidligt skridt i patogenesen af neurodegenerative lidelser og naturlig aldring 5,6. Specifikt er unormal Ca2+ optagelse og frigivelse af ER og mitokondrier forbundet med begyndelsen af neuronal dysfunktion ved Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom 6,7.
Undersøgelsen af Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller neurodegeneration kræver langsgående observation af Ca2+ niveauer med subcellulær opløsning i en levende, intakt organisme, hvor den oprindelige cellulære arkitektur (dvs. arrangementet af synapser og fordeling af ionkanaler) opretholdes. Til dette formål giver denne protokol vejledning om brugen af to let tilgængelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer til registrering af Ca2+ dynamik in vivo med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. De repræsentative resultater opnået ved hjælp af den beskrevne metode i C. elegans demonstrerer, hvordan ekspressionen af Ca 2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriematrix af enkelte neuroner kan muliggøre hurtig erhvervelse af fluorescerende billeder (op til 50 Hz), der illustrerer Ca 2+ dynamikken med den ekstra evne til at skelne Ca 2+ niveauerne inden for enkelt rygsøjlelignende strukturer og individuelle mitokondrier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Calcium (Ca 2+) billeddannelse er i vid udstrækning blevet brugt til at undersøge neuronal aktivitet, men det bliver stadig mere klart, at subcellulær Ca2+ håndtering er en afgørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen af subcellulær Ca2+ dynamik in vivo, hvor neuroner kan studeres i deres oprindelige, intakte kredsløb, har vist sig teknisk udfordrende i komplekse nervesystemer. Gennemsigtigheden og det relativt enkle nervesystem hos nematoden Caenorhabditis elegans muliggør cellespecifik ekspression og in vivo-visualisering af fluorescerende tags og indikatorer. Blandt disse er fluorescerende indikatorer, der er blevet modificeret til brug i cytoplasmaet, såvel som forskellige subcellulære rum, såsom mitokondrier. Denne protokol muliggør ikke-ratiometrisk Ca 2+ billeddannelse in vivo med en subcellulær opløsning, der tillader analyse af Ca2+ dynamik ned til niveauet for individuelle dendritiske rygsøjler og mitokondrier. Her bruges to tilgængelige genetisk kodede indikatorer med forskellige Ca 2+ affiniteter til at demonstrere brugen af denne protokol til måling af relative Ca2+ niveauer inden for cytoplasma eller mitokondriematrix i et enkelt par excitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulationer og langsgående observationer, der er mulige i C. elegans, kan denne billeddannelsesprotokol være nyttig til at besvare spørgsmål om, hvordan Ca2+ håndtering regulerer neuronal funktion og plasticitet.

Disse to protokoller muliggør hurtig erhvervelse af differentielle Ca2+ niveauer inden for de subcellulære regioner og organeller af individuelle neuritter in vivo med høj rumlig opløsning. Den første protokol muliggør måling af cytoplasmatisk Ca2+ med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette demonstreres her ved hjælp af det cellespecifikke udtryk for GCaMP6f i den glutamaterge AVA-kommando interneuroner15, hvis neuritter løber hele længden af den vent...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

De nuværende metoder beskriver en ikke-ratiometrisk tilgang til calciumbilleddannelse i høj opløsning i subcompartment in vivo i Caenorhabditis elegans ved hjælp af let tilgængelige genetisk kodede calciumindikatorer.

Subcellulær billeddannelse af neuronal calciumhåndtering in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Denne teknik kan bruges til at fremme vores forståelse af calciumhåndtering i neuroner, og hvordan opdelt calcium kan regulere forskellige mekanismer, der er vigtige for neuronal funktion in vivo. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for hurtig in vivo-billeddannelse med højere opløsning under fysiologiske forhold i C.elegans, der kan kombineres med andre fluorescerende værktøjer. Denne teknik kunne give indsigt i mekanisme, der regulerer calciumsignalering i neuroner i mange forskellige sammenhænge.For eksempel under aldring, neuronal skade og neurodegeneration. Ennis Deihl, forskningstekniker, demonstrerer denne procedure. Kaz Knight, en ph.d.-kandidat, og Rachel Doser, en postdoc-forsker fra mit laboratorium.Begynd med at klone ekspressionsvektorer, der indeholder en promotor efterfulgt af en calciumindikator og tre primære UTR efter eget valg. Opret transgene C.elegans-stammer ved mikroinjektion af en DNA-blanding indeholdende rednings-DNA Lin-15 plus i calciumindikatortransgenet ind i gonaden hos en dag gammel voksen C.elegans. Oprethold de injicerede forældreorm ved 20 grader Celsius, indtil F1-afkom når voksenalderen.Vælg transgene voksne ved screening for fravær af multi-vulva-fænotypen. Det indikerer ekspression af det ekstra kromosomale array, der indeholder calciumindikatoren. Klonalt passage voksne F1 afkom, der ikke har multi-vulva fænotypen.Udfør eksperimenter på efterfølgende generationer af de transgene stammer med et optimalt udtryk for calciumindikatoren. Brug et mikroskop, der er i stand til langsigtet Time-lapse-billeddannelse. Find ormen under et mål med lav forstørrelse, og skift derefter til et højt forstørrelsesmål for at lokalisere neuronerne.Få billederne ved hjælp af et ultrafølsomt kamera, der er i stand til hurtig billedoptagelse ved mere end 50 FPS. Brug derefter et standardemissionsfilter til calciumindikatoren. Tilføj en Z-drift korrektor til erhvervelse af billedstrømme længere end 10 sekunder.I et 13 x 100 millimeter glaskulturrør fremstilles tre milliliter 10% agar ved at opløse agar af molekylær kvalitet i M9 og mikrobølgeovn i flere sekunder. For at fremstille agarpuderne skal du først forberede to dias ved at tilføje to lag laboratorietape. Placer derefter et mikroskopglas mellem de to dias.Skær spidsen af en pipettespids på 1000 mikroliter og brug den til at pipette en lille dråbe agar på midten af dækselsedlen. Flad agaren ved at trykke et andet dias ned oven på agaren. Efter afkøling skæres agaren i en lille skive ved hjælp af åbningen af et 10 ml rør, og fjern derefter den omgivende agar.Forbered derefter ormevalseopløsningen ved at opløse muscimolpulver i M9 for at skabe en 30 millimolær bestand. Fortynd bestanden i et en-til-en-forhold med polystyrenperler for at fremstille rulleopløsningen. For at placere ormen til billeddannelse skal du først placere 1,6 mikroliter af den rullende opløsning på midten af agarpuden.Brug derefter en foretrukken ormplukning til at overføre en orm af den ønskede alder til rulleopløsningen på agarpuden. Vent i ca. fem minutter på, at muscimol reducerer ormens bevægelse, og slip derefter et 22 x 22 millimeter dæksel oven på agarpuden. Til billeddannelse af neuritter i den ventrale nerveledning skal du rulle ormen ved let at skubbe dækslet.For at montere ormen på mikroskopet skal du placere en dråbe nedsænkningsolie på dæksedlen. Find ormen ved hjælp af et mål med lav forstørrelse i brightfield. Skift derefter til 100x mål, og find AVA-neuritten ved hjælp af belysningen af GCaMP eller mito GCaMP med 488-nanometer billeddannelseslaseren.For in vivo GCaMP-billeddannelse skal du justere billedlaseren i anskaffelsesindstillinger, indtil basilikum GCaMP-fluorescensen er i mellemområdet for kameraets dynamiske område, og indstil eksponeringstiden til 20 millisekunder. Når AVA-neuritten er placeret ved hjælp af GCaMP-fluorescensen ved 100 gange forstørrelse, skal du indstille Z-drift-korrektoren og starte kontinuerlig autofokusering. Korriger brændplanet manuelt efter behov før billeddannelse.Få en strøm af billeder med 100 gange forstørrelse. Ved hjælp af denne protokol blev cytoplasmatisk calcium målt med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Det cellespecifikke udtryk for GCaMP6F i de glutamaterge AVA-kommandointerneuroner afslørede en retningsbestemt udbredelse af calciumtilstrømning.Den subcellulære kvantificering af GCaMP6F-fluorescens viste, at begyndelsen af calciumtilstrømning blev forsinket i en del af neuritten, der ligger kun 10 mikrometer væk. Dendritiske rygsøjlelignende strukturer fundet langs AVA-neuritten viste også blink i GCaMP6F-fluorescens, der opstod uafhængigt af neuritaktivering og ikke førte til udbredelse af calciumtilstrømning. Endvidere blev de relative calciumniveauer målt i de enkelte mitokondrier i enkeltneuritter ved anvendelse af en ormstamme med et AVA-specifikt udtryk for mitokondriematrixen lokaliseret calciumindikator mito GCaMP.Resultaterne viste den synkrone optagelse af en relativt stor mængde calcium i en delmængde af mitokondrier. Specifikt blev calciumoptagelsen i nogle mitokondrier synkroniseret, mens nærliggende mitokondrier ikke syntes at optage calcium. Tilsvarende viste undergrupper af mitokondrier hurtig optagelse og frigivelse af små mængder calcium.Dette syntes også at være synkront, men kun for en delmængde af mitokondrier. Hastighed og fine manipulationer er afgørende for at placere dyr og bevare neuronal funktion. Dyresundhed er også altafgørende.Selv lidt sult er problematisk. Den sværeste del at lære er dyrenes hurtige orientering til konfokal mikroskopi uden skade. Mit råd er en masse øvelse og god kontrol.Denne protokol kan anvendes til eksperimenter, hvor calcium frigives fra andre subcellulære steder i neuroner, andre neuroner eller andre celler end neuroner i C.elegans. Fordi denne tilgang i C.elegans efterlader dyr intakte, er det muligt at behandle spørgsmål om regulering af subcellulær calciumhåndtering in vivo i enkelte neuroner i et komplet nervesystem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-opløsning Imaging af neuronale Dense-core blærer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo billeddannelse af Dauer-specifik neuronal Remodeling i C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Langvarig Inkubation af akut neuronalt væv for Elektrofysiologi og Calcium-billeddannelse

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo optisk calcium billeddannelse af indlærings induceret synaptisk plasticitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...