Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 toegekend aan F. Hoerndli). We willen ook Dr. Attila Stetak bedanken voor het pAS1 plasmide.

1. Transgene stammen creëren
<ol><li>Met behulp van een kloonmethode naar keuze8,9, kloon expressievectoren om de Pflp-18 of Prig-3 promotor te bevatten (voor AVA-specifiek signaal in de ventrale zenuwstreng), gevolgd door de Ca2+ indicator naar keuze, en vervolgens een 3' UTR (zie de discussie voor meer informatie)10. Een lijst van plasmiden en hun bronnen is te vinden in aanvullend...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

De eerste overweging bij het implementeren van de beschreven methode betreft de selectie van een Ca2+ indicator met ideale eigenschappen voor de gegeven onderzoeksvraag. Cytoplasmatische Ca 2+ indicatoren hebben doorgaans een hoge affiniteit voor Ca 2+, en de gevoeligheid van deze indicatoren voor Ca 2+ is omgekeerd evenredig met de kinetiek (aan/uit snelheid)16,17. Dit betekent dat Ca2+ gevoeligheid of kinet...

Calciumionen (Ca2+) zijn zeer veelzijdige dragers van informatie in veel celtypen. In neuronen is Ca2+ verantwoordelijk voor de activiteitsafhankelijke afgifte van neurotransmitters, de regulatie van cytoskeletale motiliteit, de fijnafstemming van metabole processen, evenals vele andere mechanismen die nodig zijn voor een goed neuronaal onderhoud en functie 1,2. Om effectieve intracellulaire signalering te garanderen, moeten neuronen lage basale Ca2 + -niveaus in hun cytoplasma3 handhaven. Dit wordt bereikt door coöperatieve Ca 2+ behandelingsmechanismen, waaronder de opname van Ca2+ in organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriën. Deze processen, naast de rangschikking van Ca 2+-permeabele ionkanalen in het plasmamembraan, resulteren in heterogene niveaus van cytoplasmatisch Ca2+ door het neuron.
Ca2+ heterogeniteit tijdens rust en neuronale activatie zorgt voor de diverse, locatiespecifieke regulatie van Ca2+-afhankelijke mechanismen1. Een voorbeeld van de concentratiespecifieke effecten van Ca 2 + is de afgifte van Ca2 + uit het ER via inositol 1,4,5-trisfosfaat (InsP3) receptoren. Lage Ca2+ niveaus in combinatie met InsP3 zijn vereist voor het openen van de calciumdoorlatende porie van de receptor. Als alternatief remmen hoge Ca2+ niveaus, zowel direct als indirect, de receptor4. Het belang van Ca 2+ homeostase voor een goede neuronale functie wordt ondersteund door bewijs dat suggereert dat verstoorde intracellulaire Ca2+ behandeling en signalering een vroege stap is in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen en natuurlijke veroudering 5,6. In het bijzonder zijn abnormale Ca2+ opname en afgifte door het ER en mitochondriën gekoppeld aan het begin van neuronale disfunctie bij de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington 6,7.
De studie van Ca 2+ dyshomeostase tijdens natuurlijke veroudering of neurodegeneratie vereist de longitudinale observatie van Ca2+ niveaus met subcellulaire resolutie in een levend, intact organisme waarin de inheemse cellulaire architectuur (d.w.z. de rangschikking van synapsen en distributie van ionkanalen) wordt gehandhaafd. Hiertoe biedt dit protocol richtlijnen voor het gebruik van twee direct beschikbare, genetisch gecodeerde Ca 2+ sensoren voor het registreren van Ca2+ dynamica in vivo met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. De representatieve resultaten verkregen met behulp van de beschreven methode in C. elegans laten zien hoe de expressie van Ca 2+ indicatoren in het cytoplasma of mitochondriale matrix van afzonderlijke neuronen de snelle verwerving van fluorescerende beelden (tot 50 Hz) mogelijk kan maken die de Ca 2+ dynamiek illustreren met het extra vermogen om de Ca 2+ niveaus te onderscheiden binnen enkele wervelkolomachtige structuren en individuele mitochondriën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Calcium (Ca 2+) beeldvorming is grotendeels gebruikt om neuronale activiteit te onderzoeken, maar het wordt steeds duidelijker dat subcellulaire Ca2+ handling een cruciaal onderdeel is van intracellulaire signalering. De visualisatie van subcellulaire Ca2+ dynamica in vivo, waarbij neuronen kunnen worden bestudeerd in hun oorspronkelijke, intacte circuits, is technisch uitdagend gebleken in complexe zenuwstelsels. De transparantie en het relatief eenvoudige zenuwstelsel van de nematode Caenorhabditis elegans maken de celspecifieke expressie en in vivo visualisatie van fluorescerende tags en indicatoren mogelijk. Onder deze zijn fluorescerende indicatoren die zijn aangepast voor gebruik in het cytoplasma, evenals verschillende subcellulaire compartimenten, zoals de mitochondriën. Dit protocol maakt niet-ratiometrische Ca 2+ beeldvorming in vivo mogelijk met een subcellulaire resolutie die de analyse van Ca2+ dynamiek tot op het niveau van individuele dendritische stekels en mitochondriën mogelijk maakt. Hier worden twee beschikbare genetisch gecodeerde indicatoren met verschillende Ca 2+ affiniteiten gebruikt om het gebruik van dit protocol aan te tonen voor het meten van relatieve Ca2+ niveaus binnen het cytoplasma of mitochondriale matrix in een enkel paar exciterende interneuronen (AVA). Samen met de genetische manipulaties en longitudinale observaties die mogelijk zijn bij C. elegans, kan dit beeldvormingsprotocol nuttig zijn voor het beantwoorden van vragen over hoe Ca2+ behandeling de neuronale functie en plasticiteit reguleert.

Deze twee protocollen maken de snelle verwerving van differentiële Ca2+ niveaus binnen de subcellulaire regio's en organellen van individuele neurieten in vivo met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk. Het eerste protocol maakt het mogelijk om cytoplasmatisch Ca2+ te meten met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit wordt hier gedemonstreerd met behulp van de celspecifieke expressie van GCaMP6f in het glutamaterge AVA-commandointerneuronen 15, waarvan de neu...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Deze techniek kan worden gebruikt om ons begrip van calciumbehandeling in neuronen te vergroten en hoe gecompartimenteerd calcium verschillende mechanismen kan reguleren die belangrijk zijn voor de neuronale functie in vivo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snellere in vivo beeldvorming met een hogere resolutie mogelijk maakt onder fysiologische omstandigheden in C.elegans die kunnen worden gecombineerd met andere fluorescerende hulpmiddelen. Deze techniek kan inzicht geven in het mechanisme dat calciumsignalering in neuronen reguleert in veel verschillende contexten.Bijvoorbeeld tijdens veroudering, neuronaal letsel en neurodegeneratie. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Ennis Deihl, onderzoekstechnicus. Kaz Knight, een promovendus, en Rachel Doser, een postdoctoraal onderzoeker van mijn lab.Begin met het klonen van expressievectoren die een promotor bevatten, gevolgd door een calciumindicator en drie primaire UTR naar keuze. Creëer transgene C.elegans-stammen door micro-injectie van een DNA-mix met het reddings-DNA Lin-15 plus in het calciumindicatortransgen in de gonade van een één dag oude volwassen C.elegans. Houd de geïnjecteerde ouderwormen op 20 graden Celsius totdat de F1-nakomelingen de volwassen leeftijd bereiken.Selecteer transgene volwassenen door te screenen op de afwezigheid van het multi-vulvafenotype. Dat duidt op expressie van de extra chromosomale array met de calciumindicator. Klonaal passage volwassen F1 nakomelingen die niet het multi-vulva fenotype hebben.Voer experimenten uit op volgende generaties van de transgene stammen met een optimale expressie van de calciumindicator. Gebruik een microscoop die in staat is om time-lapse beeldvorming op lange termijn te maken. Lokaliseer de worm onder een laag vergrotingsobjectief en schakel vervolgens over naar een doel met een hoge vergroting om de neuronen te lokaliseren.Verkrijg de beelden met behulp van een ultragevoelige camera die in staat is tot snelle beeldacquisitie met meer dan 50 FPS. Gebruik vervolgens een standaard emissiefilter voor de calciumindicator. Voeg een Z-drift corrector toe voor het verkrijgen van beeldstromen langer dan 10 seconden.Bereid in een glazen kweekbuis van 13 bij 100 millimeter drie milliliter 10% agar door agar van moleculaire kwaliteit op te lossen in M9 en de magnetron gedurende enkele seconden. Om de agarpads te maken, bereidt u eerst twee dia's voor door twee lagen laboratoriumtape toe te voegen. Plaats vervolgens een microscoopglaasje tussen de twee dia's.Snijd de punt van een pipetpunt van 1000 microliter en gebruik deze om een kleine druppel agar op het midden van de afdekslip te pipetteren. Druk de agar plat door een andere schuif naar beneden te drukken bovenop de agar. Snijd na het afkoelen de agar in een kleine schijf met behulp van de opening van een buis van 10 milliliter en verwijder vervolgens de omliggende agar.Bereid vervolgens de wormroloplossing voor door muscimolpoeder op te lossen in M9 om een 30-millimolaire kolf te creëren. Verdun de bouillon in een één-op-één verhouding met polystyreenparels om de rollende oplossing te maken. Om de worm voor beeldvorming te plaatsen, plaatst u eerst 1,6 microliter van de rollende oplossing op het midden van het agarpad.Gebruik vervolgens een voorkeurswormprikker en breng vervolgens een worm van de gewenste leeftijd over in de rollende oplossing op het agarpad. Wacht ongeveer vijf minuten tot de muscimol de wormbeweging vermindert en laat dan een afdekslip van 22 bij 22 millimeter bovenop het agarpad vallen. Voor het afbeelden van neurieten in het ventrale zenuwkoord, rolt u de worm door de afdekslip lichtjes te schuiven.Om de worm op de microscoop te monteren, plaatst u een druppel dompelolie op de afdekslip. Zoek de worm met behulp van een objectief met een lage vergroting in het helderveld. Schakel vervolgens over naar het 100x-objectief en lokaliseer de AVA-neuriet met behulp van de verlichting van de GCaMP of mito GCaMP met de 488-nanometer beeldlaser.Voor in vivo GCaMP-beeldvorming past u de beeldlaser in acquisitie-instellingen aan totdat de basilicum GCaMP-fluorescentie zich in het middenbereik van het dynamische bereik van de camera bevindt en stelt u de belichtingstijd in op 20 milliseconden. Nadat het AVA-neuriet is gelokaliseerd met behulp van de GCaMP-fluorescentie bij 100 keer vergroting, stelt u de Z-driftcorrector in en start u continue autofocus. Corrigeer het brandpuntsvlak indien nodig handmatig voordat u een afbeelding maakt.Verkrijg een stroom afbeeldingen met een vergroting van 100 keer. Met behulp van dit protocol werd cytoplasmatisch calcium gemeten met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. De celspecifieke expressie van GCaMP6F in de glutamaterge AVA-commando-interneuronen onthulde een directionele voortplanting van calciuminstroom.De subcellulaire kwantificering van GCaMP6F-fluorescentie toonde aan dat het begin van calciuminstroom vertraagd was in een deel van het neuriet op slechts 10 micrometer afstand. Ook vertoonden dendritische wervelkolomachtige structuren langs het AVA-neuriet flitsen in GCaMP6F-fluorescentie die onafhankelijk van neurietactivering optraden en niet leidden tot een voortplanting van calciuminstroom. Verder werden de relatieve calciumspiegels gemeten in de individuele mitochondriën in enkele neurieten met behulp van een wormstam met een AVA-specifieke expressie van de mitochondriale matrix gelokaliseerde calciumindicator mito GCaMP.De resultaten toonden de synchrone opname van een relatief grote hoeveelheid calcium in een subset van mitochondriën. In het bijzonder werd de calciumopname in sommige mitochondriën gesynchroniseerd, terwijl naburige mitochondriën geen calcium leken op te nemen. Evenzo vertoonden subsets van mitochondriën een snelle opname en afgifte van kleine hoeveelheden calcium.Dit bleek ook synchroon te zijn, maar alleen voor een subset van mitochondriën. Snelheid en fijne manipulaties zijn essentieel voor het positioneren van dieren en het behouden van de neuronale functie. Ook de diergezondheid staat voorop.Zelfs een beetje honger is problematisch. Het moeilijkste om te leren is de snelle oriëntatie van de dieren voor confocale microscopie zonder schade. Mijn advies is veel oefenen en goede controles.Dit protocol kan worden toegepast op experimenten waarbij calcium wordt vrijgegeven uit andere subcellulaire locaties in neuronen, andere neuronen of cellen anders dan neuronen in C.elegans. Omdat deze benadering bij C.elegans dieren intact laat, is het mogelijk om vragen te beantwoorden over de regulatie van subcellulaire calciumbehandeling in vivo in enkele neuronen van een compleet zenuwstelsel.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo beeldvorming van Dauer-specifieke neuronale Verbouwing in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...