Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 attribué à F. Hoerndli). Nous tenons également à remercier le Dr Attila Stetak pour le plasmide pAS1.

1. Création de souches transgéniques
<ol><li>En utilisant une méthode de clonage de choix8,9, cloner des vecteurs d’expression pour contenir le promoteur Pflp-18 ou Prig-3 (pour le signal spécifique à AVA dans le cordon nerveux ventral), suivi de l’indicateur Ca2+ de choix, puis d’un UTR 3' (voir la discussion pour plus d’informations)10. Une liste des plasmides et de leurs sourc...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. 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E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

La première considération lors de la mise en œuvre de la méthode décrite implique la sélection d’un indicateur Ca2+ avec des caractéristiques idéales pour la question de recherche donnée. Les indicateurs cytoplasmiques Ca 2+ ont généralement une forte affinité pour Ca 2+, et la sensibilité de ces indicateurs au Ca2+ est inversement liée à la cinétique (taux marche/arrêt)16,17. Cela signifie que la sen...

Les ions calcium (Ca2+) sont des vecteurs d’information très polyvalents dans de nombreux types de cellules. Dans les neurones, Ca2+ est responsable de la libération dépendante de l’activité des neurotransmetteurs, de la régulation de la motilité cytosquelettique, du réglage fin des processus métaboliques, ainsi que de nombreux autres mécanismes nécessaires au bon entretien et au bon fonctionnementneuronal 1,2. Pour assurer une signalisation intracellulaire efficace, les neurones doivent maintenir de faibles niveaux basaux de Ca2+ dans leur cytoplasme3. Ceci est accompli par des mécanismes coopératifs de manipulation du Ca 2+, y compris l’absorption de Ca2+ dans des organites tels que le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Ces processus, en plus de l’arrangement des canaux ioniques perméables Ca 2+ dans la membrane plasmique, entraînent des niveaux hétérogènes de Ca2+ cytoplasmique dans tout le neurone.
L’hétérogénéité Ca 2+ pendant le repos et l’activation neuronale permet la régulation diversifiée et spécifique à l’emplacement des mécanismes dépendants de Ca 2+ 1. Un exemple des effets spécifiques à la concentration de Ca 2+ est la libération de Ca 2+ du RE par les récepteurs de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). De faibles niveaux de Ca2+ en combinaison avec InsP3 sont nécessaires pour l’ouverture du pore perméable au calcium du récepteur. Alternativement, des niveaux élevés de Ca2+ inhibent directement et indirectement le récepteur4. L’importance de l’homéostasie Ca 2+ pour la fonction neuronale appropriée est étayée par des preuves suggérant que la manipulation et la signalisation intracellulaires du Ca2+ perturbées constituent une étape précoce de la pathogenèse des troubles neurodégénératifs et du vieillissement naturel 5,6. Plus précisément, l’absorption et la libération anormales de Ca2+ par le RE et les mitochondries sont liées à l’apparition d’un dysfonctionnement neuronal dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington 6,7.
L’étude de la dyshoméostasie Ca 2+ au cours du vieillissement naturel ou de la neurodégénérescence nécessite l’observation longitudinale des niveaux de Ca2+ avec une résolution subcellulaire dans un organisme vivant et intact dans lequel l’architecture cellulaire native (c’est-à-dire la disposition des synapses et la distribution des canaux ioniques) est maintenue. À cette fin, ce protocole fournit des conseils sur l’utilisation de deux capteurs Ca 2+ génétiquement codés facilement disponibles pour enregistrer la dynamique Ca2+ in vivo avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Les résultats représentatifs obtenus à l’aide de la méthode décrite chez C. elegans démontrent comment l’expression des indicateurs Ca 2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale de neurones individuels peut permettre l’acquisition rapide d’images fluorescentes (jusqu’à 50 Hz) qui illustrent la dynamique Ca 2+ avec la capacité supplémentaire de discerner les niveaux de Ca 2+ dans des structures semblables à une seule colonne vertébrale et des mitochondries individuelles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

L’imagerie calcique (Ca 2+) a été largement utilisée pour examiner l’activité neuronale, mais il devient de plus en plus clair que la manipulation subcellulaire du Ca2+ est un élément crucial de la signalisation intracellulaire. La visualisation de la dynamique subcellulaire Ca2+ in vivo, où les neurones peuvent être étudiés dans leurs circuits natifs intacts, s’est avérée techniquement difficile dans des systèmes nerveux complexes. La transparence et le système nerveux relativement simple du nématode Caenorhabditis elegans permettent l’expression spécifique de la cellule et la visualisation in vivo de marqueurs fluorescents et d’indicateurs. Parmi ceux-ci figurent des indicateurs fluorescents qui ont été modifiés pour être utilisés dans le cytoplasme ainsi que dans divers compartiments subcellulaires, tels que les mitochondries. Ce protocole permet l’imagerie non ratiométrique Ca 2+ in vivo avec une résolution subcellulaire qui permet l’analyse de la dynamique Ca2+ jusqu’au niveau des épines dendritiques individuelles et des mitochondries. Ici, deux indicateurs génétiquement codés disponibles avec des affinités Ca 2+ différentes sont utilisés pour démontrer l’utilisation de ce protocole pour mesurer les niveaux relatifs de Ca2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale dans une seule paire d’interneurones excitateurs (AVA). Avec les manipulations génétiques et les observations longitudinales possibles chez C. elegans, ce protocole d’imagerie peut être utile pour répondre aux questions sur la façon dont la manipulation du Ca2+ régule la fonction neuronale et la plasticité.

Ces deux protocoles permettent l’acquisition rapide de niveaux différentiels de Ca2+ dans les régions subcellulaires et les organites des neurites individuels in vivo avec une résolution spatiale élevée. Le premier protocole permet la mesure du Ca2+ cytoplasmique avec une résolution temporelle et spatiale élevée. Ceci est démontré ici en utilisant l’expression spécifique à la cellule de GCaMP6f dans les interneurones de commande AVA glutamatergiques15...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Cette technique peut être utilisée pour faire progresser notre compréhension de la manipulation du calcium dans les neurones et de la façon dont le calcium compartimenté peut réguler différents mécanismes importants pour la fonction neuronale in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une imagerie in vivo rapide à plus haute résolution dans des conditions physiologiques chez C. elegans qui peut être combinée avec d’autres outils fluorescents. Cette technique pourrait fournir des informations sur le mécanisme de régulation de la signalisation du calcium dans les neurones dans de nombreux contextes différents.Par exemple, pendant le vieillissement, les lésions neuronales et la neurodégénérescence. Ennis Deihl, technicien de recherche, fera la démonstration de cette procédure. Kaz Knight, candidat au doctorat, et Rachel Doser, chercheuse postdoctorale de mon laboratoire.Commencez par cloner les vecteurs d’expression qui contiennent un promoteur suivi d’un indicateur de calcium et de trois UTR principaux de choix. Créer des souches transgéniques de C.elegans par microinjection d’un mélange d’ADN contenant l’ADN de secours Lin-15 plus dans le transgène indicateur de calcium dans la gonade d’un adulte d’un jour C.elegans. Maintenez les vers parents injectés à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la descendance F1 atteigne l’âge adulte.Sélectionner les adultes transgéniques en dépistant l’absence du phénotype multi-vulvaire. Cela indique l’expression de la matrice chromosomique supplémentaire contenant l’indicateur de calcium. Descendance F1 adulte à passage clonal qui n’a pas le phénotype multi-vulvaire.Effectuer des expériences sur les générations suivantes des souches transgéniques avec une expression optimale de l’indicateur de calcium. Utilisez un microscope capable d’imager en accéléré à long terme. Localisez le ver sous un objectif à faible grossissement, puis passez à un objectif à fort grossissement pour localiser les neurones.Acquérir les images à l’aide d’une caméra ultrasensible capable d’acquérir rapidement des images à plus de 50 FPS. Ensuite, utilisez un filtre antipollution standard pour l’indicateur de calcium. Ajoutez un correcteur Z-drift pour l’acquisition de flux d’images de plus de 10 secondes.Dans un tube de culture en verre de 13 x 100 millimètres, préparez trois millilitres d’agar à 10% en dissolvant de la gélose de qualité moléculaire dans M9 et au micro-ondes pendant plusieurs secondes. Pour fabriquer les tampons d’agar, préparez d’abord deux lames en ajoutant deux couches de ruban adhésif de laboratoire. Placez ensuite une lame de microscope entre les deux lames.Coupez l’embout d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et utilisez-la pour pipeter une petite goutte d’agar au centre de la lamelle de couvercle. Aplatir la gélose en appuyant sur une autre glissière sur le dessus de l’agar. Après refroidissement, coupez la gélose en un petit disque à l’aide de l’ouverture d’un tube de 10 millilitres, puis retirez la gélose environnante.Ensuite, préparez la solution de laminage de la vers en dissolvant la poudre de muscimol dans M9 pour créer un stock de 30 millimolaires. Diluer le bouillon dans un rapport de un pour un avec des billes de polystyrène pour obtenir la solution de laminage. Pour positionner le ver pour l’imagerie, placez d’abord 1,6 microlitre de la solution à rouler au centre du tampon de gélose .Ensuite, à l’aide d’un pic de vers préféré, transférer un ver de l’âge désiré dans la solution à rouler sur le tampon de gélose . Attendez environ cinq minutes que le muscimol réduise le mouvement du ver, puis déposez un couvercle de 22 millimètres sur 22 millimètres sur le dessus du tampon de gélose. Pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux ventral, roulez le ver en faisant légèrement glisser le couvercle.Pour monter le ver sur le microscope, placez une goutte d’huile d’immersion sur le couvercle. Trouvez le ver à l’aide d’un objectif à faible grossissement en fond clair. Ensuite, passez à l’objectif 100x et localisez le neurite AVA en utilisant l’éclairage du GCaMP ou du mito GCaMP avec le laser d’imagerie de 488 nanomètres.Pour l’imagerie GCaMP in vivo, ajustez le laser d’imagerie dans les paramètres d’acquisition jusqu’à ce que la fluorescence GCaMP au basilic soit dans la plage médiane de la plage dynamique de la caméra et réglez le temps d’exposition sur 20 millisecondes. Une fois que le neurite AVA est localisé à l’aide de la fluorescence GCaMP à un grossissement 100 fois, réglez le correcteur Z-drift et lancez la mise au point automatique continue. Corrigez manuellement le plan focal si nécessaire avant l’imagerie.Acquérir un flux d’images à un grossissement 100 fois. À l’aide de ce protocole, le calcium cytoplasmique a été mesuré avec une résolution temporelle et spatiale élevée. L’expression cellulaire spécifique de GCaMP6F dans les interneurones de commande AVA glutamatergique a révélé une propagation directionnelle de l’afflux de calcium.La quantification subcellulaire de la fluorescence GCaMP6F a montré que l’apparition de l’afflux de calcium était retardée dans une partie du neurite située à seulement 10 micromètres. En outre, les structures dendritiques en forme de colonne vertébrale trouvées le long du neurite AVA ont montré des éclairs dans la fluorescence GCaMP6F qui se sont produits indépendamment de l’activation des neurites et n’ont pas conduit à une propagation de l’afflux de calcium. De plus, les niveaux relatifs de calcium ont été mesurés dans les mitochondries individuelles dans des neurites simples à l’aide d’une souche de ver avec une expression spécifique AVA de l’indicateur de calcium localisé de la matrice mitochondriale mito GCaMP.Les résultats ont montré l’absorption synchrone d’une quantité relativement importante de calcium dans un sous-ensemble de mitochondries. Plus précisément, l’absorption du calcium dans certaines mitochondries était synchronisée, alors que les mitochondries voisines ne semblaient pas absorber le calcium. De même, des sous-ensembles de mitochondries ont montré une absorption et une libération rapides de petites quantités de calcium.Cela semblait également être synchrone, mais seulement pour un sous-ensemble de mitochondries. La vitesse et les manipulations fines sont essentielles pour positionner les animaux et conserver la fonction neuronale. La santé animale est également primordiale.Même un peu de famine est problématique. La partie la plus difficile à apprendre est l’orientation rapide des animaux pour la microscopie confocale sans dommage. Mon conseil est beaucoup de pratique et de bons contrôles.Ce protocole pourrait être appliqué à des expériences où le calcium est libéré à partir d’autres emplacements subcellulaires dans les neurones, d’autres neurones ou des cellules autres que les neurones dans C. elegans. Parce que cette approche chez C. elegans laisse les animaux intacts, il est possible de répondre aux questions sur la régulation de la manipulation subcellulaire du calcium in vivo dans des neurones uniques d’un système nerveux complet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

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In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

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