Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt (R01- NS115947 verliehen an F. Hoerndli). Wir bedanken uns auch bei Dr. Attila Stetak für das pAS1-Plasmid.

1. Erzeugung transgener Stämme
<ol><li>Klonieren Sie Expressionsvektoren unter Verwendung einer Klonierungsmethode Ihrer Wahl8,9 so, dass sie den Pflp-18- oder Prig-3-Promotor (für AVA-spezifisches Signal im ventralen Nervenstrang) enthalten, gefolgt vom Ca2+-Indikator der Wahl und dann einer 3'-UTR (siehe Diskussion für weitere Informationen)10. Eine Liste der Plasmide und ihrer Quellen f...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. 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E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

Die erste Überlegung bei der Implementierung der beschriebenen Methode betrifft die Auswahl eines Ca2+ Indikators mit idealen Eigenschaften für die gegebene Forschungsfrage. Zytoplasmatische Ca 2+-Indikatoren haben typischerweise eine hohe Affinität zu Ca 2+, und die Sensitivität dieser Indikatoren gegenüber Ca 2+ steht in umgekehrtem Verhältnis zur Kinetik (Ein-/Ausschaltrate)16,17. Dies bedeutet, dass entweder d...

Calcium-Ionen (Ca2+) sind in vielen Zelltypen sehr vielseitige Informationsträger. In Neuronen ist Ca2+ für die aktivitätsabhängige Freisetzung von Neurotransmittern, die Regulierung der Zytoskelettmotilität, die Feinabstimmung von Stoffwechselprozessen sowie viele andere Mechanismen verantwortlich, die für eine ordnungsgemäße Aufrechterhaltung und Funktion der Nervenzellen erforderlich sind 1,2. Um eine effektive intrazelluläre Signalübertragung zu gewährleisten, müssen Neuronen einen niedrigen basalen Ca2+-Spiegel in ihrem Zytoplasmaaufrechterhalten 3. Dies wird durch kooperative Ca 2+-Handhabungsmechanismen erreicht, einschließlich der Aufnahme von Ca2+ in Organellen wie das Endoplasmatische Retikulum (ER) und Mitochondrien. Diese Prozesse, zusätzlich zur Anordnung von Ca 2+-permeablen Ionenkanälen in der Plasmamembran, führen zu heterogenen Konzentrationen von zytoplasmatischem Ca2+ im gesamten Neuron.
Die Ca 2+-Heterogenität während der Ruhephase und der neuronalen Aktivierung ermöglicht die vielfältige, ortsspezifische Regulation von Ca2+-abhängigen Mechanismen1. Ein Beispiel für die konzentrationsspezifischen Effekte von Ca 2+ ist die Freisetzung von Ca2+ aus dem ER durch Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3)-Rezeptoren. NiedrigeCa2+-Spiegel in Kombination mit InsP3 sind für die Öffnung der kalziumdurchlässigen Pore des Rezeptors erforderlich. Alternativ hemmen hoheCa2+-Spiegel sowohl direkt als auch indirekt den Rezeptor4. Die Bedeutung der Ca 2+-Homöostase für die ordnungsgemäße neuronale Funktion wird durch Hinweise gestützt, die darauf hindeuten, dass eine gestörte intrazelluläre Ca2+-Handhabung und -Signalübertragung ein früher Schritt in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen und des natürlichen Alterns ist 5,6. Insbesondere die abnorme Aufnahme und Freisetzung von Ca2+ durch das ER und die Mitochondrien wird mit dem Auftreten neuronaler Dysfunktion bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit in Verbindung gebracht 6,7.
Die Untersuchung der Ca 2+ Dyshomöostase während des natürlichen Alterns oder der Neurodegeneration erfordert die longitudinale Beobachtung der Ca2+ Spiegel mit subzellulärer Auflösung in einem lebenden, intakten Organismus, in dem die native zelluläre Architektur (d.h. die Anordnung der Synapsen und die Verteilung der Ionenkanäle) erhalten bleibt. Zu diesem Zweck bietet dieses Protokoll eine Anleitung für den Einsatz von zwei leicht verfügbaren, genetisch kodierten Ca 2+ Sensoren zur Erfassung der Ca2+ Dynamik in vivo mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Die repräsentativen Ergebnisse, die mit der beschriebenen Methode in C. elegans gewonnen wurden, zeigen, wie die Expression von Ca 2+-Indikatoren im Zytoplasma oder in der mitochondrialen Matrix einzelner Neuronen die schnelle Aufnahme von Fluoreszenzbildern (bis zu 50 Hz) ermöglichen kann, die die Ca 2+-Dynamik veranschaulichen, mit der zusätzlichen Fähigkeit, die Ca 2+-Spiegel innerhalb einzelner stachelähnlicher Strukturen und einzelner Mitochondrien zu erkennen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
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subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Die Bildgebung von Kalzium (Ca 2+) wurde bisher weitgehend zur Untersuchung der neuronalen Aktivität eingesetzt, aber es wird immer deutlicher, dass die subzelluläre Ca2+-Handhabung eine entscheidende Komponente der intrazellulären Signalübertragung ist. Die Visualisierung der subzellulären Ca2+-Dynamik in vivo, bei der Neuronen in ihren nativen, intakten Schaltkreisen untersucht werden können, hat sich in komplexen Nervensystemen als technisch anspruchsvoll erwiesen. Die Transparenz und das relativ einfache Nervensystem des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ermöglichen die zellspezifische Expression und in vivo Visualisierung von fluoreszierenden Tags und Indikatoren. Darunter befinden sich Fluoreszenzindikatoren, die für den Einsatz im Zytoplasma modifiziert wurden, sowie verschiedene subzelluläre Kompartimente, wie z.B. die Mitochondrien. Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-ratiometrische Ca 2+ Bildgebung in vivo mit einer subzellulären Auflösung, die die Analyse der Ca2+ Dynamik bis auf die Ebene einzelner dendritischer Dornen und Mitochondrien ermöglicht. In dieser Arbeit werden zwei genetisch kodierte Indikatoren mit unterschiedlichen Ca 2+-Affinitäten verwendet, um die Verwendung dieses Protokolls zur Messung relativer Ca2+-Spiegel innerhalb des Zytoplasmas oder der mitochondrialen Matrix in einem einzigen Paar exzitatorischer Interneuronen (AVA) zu demonstrieren. Zusammen mit den genetischen Manipulationen und Längsschnittbeobachtungen, die in C. elegans möglich sind, könnte dieses Bildgebungsprotokoll nützlich sein, um Fragen zu beantworten, wie der Umgang mit Ca2+ die neuronale Funktion und Plastizität reguliert.

Diese beiden Protokolle ermöglichen die schnelle Erfassung von differentiellen Ca2+-Spiegeln innerhalb der subzellulären Regionen und Organellen einzelner Neuriten in vivo mit hoher räumlicher Auflösung. Das erste Protokoll ermöglicht die Messung von zytoplasmatischem Ca2+ mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies wird hier anhand der zellspezifischen Expression von GCaMP6f in den glutamatergen AVA-Befehlsinterneuronen15 demonstriert, deren Neuriten ...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Diese Technik kann verwendet werden, um unser Verständnis des Umgangs mit Kalzium in Neuronen zu verbessern und zu verstehen, wie kompartimentiertes Kalzium verschiedene Mechanismen regulieren kann, die für die neuronale Funktion in vivo wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnellere In-vivo-Bildgebung mit höherer Auflösung unter physiologischen Bedingungen in C. elegans ermöglicht, die mit anderen fluoreszierenden Werkzeugen kombiniert werden kann. Diese Technik könnte Einblicke in den Mechanismus geben, der die Kalzium-Signalübertragung in Neuronen in vielen verschiedenen Kontexten reguliert.Zum Beispiel während des Alterns, neuronaler Verletzungen und Neurodegeneration. Dieses Verfahren demonstriert Ennis Deihl, Forschungstechniker. Kaz Knight, eine Doktorandin, und Rachel Doser, eine Postdoktorandin aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Klonierung von Expressionsvektoren, die einen Promotor enthalten, gefolgt von einem Kalziumindikator und drei primären UTRs Ihrer Wahl. Erzeugung transgener C. elegans-Stämme durch Mikroinjektion einer DNA-Mischung, die die Rettungs-DNA Lin-15 plus im Kalziumindikator-Transgen enthält, in die Keimdrüse eines einen Tag alten erwachsenen C. elegans. Halten Sie die injizierten Elternwürmer bei 20 Grad Celsius, bis die F1-Nachkommen das Erwachsenenalter erreichen.Wählen Sie transgene Erwachsene aus, indem Sie auf das Fehlen des Multivulva-Phänotyps screenen. Dies deutet auf die Expression des extrachromosomalen Arrays hin, das den Kalziumindikator enthält. Klonale Passage adulter F1-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp haben.Durchführung von Experimenten an nachfolgenden Generationen der transgenen Stämme mit optimaler Expression des Calcium-Indikators. Verwenden Sie ein Mikroskop, das Langzeitaufnahmen im Zeitraffer ermöglicht. Lokalisieren Sie den Wurm unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung und wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit hoher Vergrößerung, um die Neuronen zu lokalisieren.Nehmen Sie die Bilder mit einer hochempfindlichen Kamera auf, die eine schnelle Bildaufnahme mit mehr als 50 Bildern pro Sekunde ermöglicht. Verwenden Sie als Nächstes einen Standard-Emissionsfilter für den Kalziumindikator. Fügen Sie einen Z-Drift-Korrektor für die Aufnahme von Bildströmen hinzu, die länger als 10 Sekunden sind.Bereiten Sie in einem 13 x 100 Millimeter großen Glaskulturröhrchen drei Milliliter 10%iges Agar vor, indem Sie molekularen Agar in M9 auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen. Um die Agar-Pads herzustellen, bereiten Sie zunächst zwei Objektträger vor, indem Sie zwei Schichten Laborklebeband hinzufügen. Legen Sie dann einen Objektträger zwischen die beiden Objektträger.Schneiden Sie die Spitze einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf die Mitte des Deckglases. Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken. Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 10-Milliliter-Röhrchens in eine kleine Scheibe und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.Als nächstes bereiten Sie die Schneckenwalzlösung vor, indem Sie Muscimol-Pulver in M9 auflösen, um einen 30-Millimol-Bestand zu erzeugen. Verdünnen Sie das Material im Verhältnis eins zu eins mit Styroporperlen, um die Walzlösung herzustellen. Um den Wurm für die Bildgebung zu positionieren, geben Sie zunächst 1,6 Mikroliter der Rolllösung auf die Mitte des Agarpads.Übertragen Sie dann mit einem bevorzugten Schneckenpickel eine Schnecke des gewünschten Alters in die Rolllösung auf dem Agarpad. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis das Muscimol die Bewegung des Wurms reduziert hat, und legen Sie dann ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas auf das Agar-Pad. Für die Bildgebung von Neuriten im ventralen Nervenstrang rollen Sie den Wurm durch leichtes Schieben des Deckglases.Um die Schnecke auf dem Mikroskop zu montieren, geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas. Finden Sie den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Hellfeld. Wechseln Sie dann zum 100x-Objektiv und lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mit der Beleuchtung des GCaMP oder mito GCaMP mit dem 488-Nanometer-Bildgebungslaser.Passen Sie für die In-vivo-GCaMP-Bildgebung den Bildgebungslaser in den Aufnahmeeinstellungen an, bis die Basilikum-GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kamera liegt, und stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 Millisekunden ein. Nachdem der AVA-Neurit mit der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den Z-Drift-Korrektor ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung nach Bedarf manuell.Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung. Mit Hilfe dieses Protokolls wurde zytoplasmatisches Kalzium mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gemessen. Die zellspezifische Expression von GCaMP6F in den glutamatergen Interneuronen des AVA-Kommandos zeigte eine gerichtete Ausbreitung des Calciumeinstroms.Die subzelluläre Quantifizierung der GCaMP6F-Fluoreszenz zeigte, dass der Beginn des Kalziumeinstroms in einem nur 10 Mikrometer entfernten Teil des Neuriten verzögert war. Auch dendritische wirbelsäulenartige Strukturen, die entlang des AVA-Neuriten gefunden wurden, zeigten Blitze in der GCaMP6F-Fluoreszenz, die unabhängig von der Neuritenaktivierung auftraten und nicht zu einer Ausbreitung des Kalziumeinstroms führten. Weiterhin wurden die relativen Calciumspiegel in den einzelnen Mitochondrien in einzelnen Neuriten mit Hilfe eines Wurmstammes mit einer AVA-spezifischen Expression des mitochondrialen Matrix-lokalisierten Calciumindikators mito GCaMP gemessen.Die Ergebnisse zeigten die synchrone Aufnahme einer relativ großen Menge Kalzium in eine Untergruppe von Mitochondrien. Insbesondere war die Kalziumaufnahme in einige Mitochondrien synchronisiert, während benachbarte Mitochondrien kein Kalzium aufzunehmen schienen. In ähnlicher Weise zeigten Untergruppen von Mitochondrien eine schnelle Aufnahme und Freisetzung kleiner Mengen an Kalzium.Dies schien auch synchron zu sein, aber nur für eine Untergruppe von Mitochondrien. Schnelligkeit und feine Manipulationen sind unerlässlich, um Tiere zu positionieren und die neuronale Funktion zu erhalten. Auch die Tiergesundheit steht an erster Stelle.Schon ein wenig Hunger ist problematisch. Am schwierigsten zu erlernen ist die schnelle Orientierung der Tiere für die konfokale Mikroskopie ohne Schäden. Mein Rat ist viel Übung und eine gute Kontrolle.Dieses Protokoll könnte auf Experimente angewendet werden, bei denen Kalzium von anderen subzellulären Stellen in Neuronen, anderen Neuronen oder anderen Zellen als Neuronen in C. elegans freigesetzt wird. Da dieser Ansatz bei C. elegans die Tiere intakt lässt, ist es möglich, Fragen zur Regulation des subzellulären Kalziumhandlings in vivo in einzelnen Neuronen eines kompletten Nervensystems zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...