Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01- NS115947 הוענק F. Hoerndli). ברצוננו להודות גם לד"ר אטילה סטק על פלסמיד pAS1.

1. יצירת זנים טרנסגניים
<ol><li>באמצעות שיטת שיבוט של בחירה8,9, וקטורי ביטוי שיבוט כדי להכיל את מקדם Pflp-18 או Prig-3 (עבור אות ספציפי AVA בחוט העצב הגחוני), ואחריו מחוון Ca2+ של בחירה, ולאחר מכן 3' UTR (ראה דיון למידע נוסף)10. רשימה של פלסמ...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

השיקול הראשון ביישום השיטה המתוארת כרוך בבחירת אינדיקטור Ca2+ עם מאפיינים אידיאליים לשאלת המחקר הנתונה. לאינדיקטורים ציטופלזמיים Ca 2+ יש בדרך כלל זיקה גבוהה ל- Ca 2+, והרגישות של אינדיקטורים אלה ל- Ca 2+ קשורה ביחס הפוך לקינטיקה (קצב הפעלה/כיבוי)16,17<sup class...

יוני סידן (Ca2+) הם נשאים רב-תכליתיים ביותר של מידע בסוגי תאים רבים. בנוירונים, Ca2+ אחראי על שחרור תלוי פעילות של מוליכים עצביים, ויסות תנועתיות השלד הציטו-שלד, כוונון עדין של תהליכים מטבוליים, כמו גם מנגנונים רבים אחרים הדרושים לתחזוקה עצבית נאותה ותפקוד 1,2. כדי להבטיח איתות תוך-תאי יעיל, תאי עצב חייבים לשמור על רמות נמוכות של Ca2+ בסיסי בציטופלסמה3 שלהם. זה מושג על ידי מנגנוני טיפול Ca 2+ שיתופיים, כולל ספיגה של Ca2+ לתוך אברונים כגון הרשתית האנדופלסמית (ER) והמיטוכונדריה. תהליכים אלה, בנוסף לסידור של תעלות יונים חדירות Ca 2+ בקרום הפלזמה, גורמים לרמות הטרוגניות של Ca2+ ציטופלזמי בכל תא העצב.
הטרוגניות Ca 2+ במהלך מנוחה והפעלה עצבית מאפשרת ויסות מגוון וספציפי למיקום של מנגנונים תלויי Ca2+ 1. דוגמה אחת להשפעות הספציפיות לריכוז של Ca 2+ היא שחרור Ca2+ מהמיון דרך קולטני אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (InsP3). רמות נמוכות של Ca2+ בשילוב עם InsP3 נדרשות לפתיחת נקבובית הסידן החדירה של הקולטן. לחלופין, רמות גבוהות של Ca2+ מעכבות באופן ישיר ועקיף את הקולטן4. החשיבות של Ca 2+ הומאוסטזיס לתפקוד עצבי תקין נתמכת על ידי ראיות המצביעות על כך שטיפול ואיתות תוך תאי Ca2+ משובש הוא צעד מוקדם בפתוגנזה של הפרעות נוירודגנרטיביות והזדקנות טבעית 5,6. באופן ספציפי, ספיגה חריגה של Ca2+ ושחרור על ידי המיון והמיטוכונדריה קשורים להופעת תפקוד עצבי לקוי במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון 6,7.
המחקר של Ca 2+ dyshomeostasis במהלך הזדקנות טבעית או ניוון עצבי דורש תצפית אורכית של רמות Ca2+ עם רזולוציה תת-תאית באורגניזם חי ושלם שבו נשמרת הארכיטקטורה התאית הטבעית (כלומר, סידור הסינפסות ופיזור תעלות היונים). לשם כך, פרוטוקול זה מספק הנחיות לשימוש בשני חיישני Ca 2+ זמינים ומקודדים גנטית להקלטת דינמיקת Ca2+ in vivo ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. התוצאות המייצגות שהתקבלו בשיטה המתוארת ב- C. elegans מדגימות כיצד ביטוי של אינדיקטורים Ca 2+ בציטופלסמה או במטריצה המיטוכונדריאלית של נוירונים בודדים יכול לאפשר רכישה מהירה של תמונות פלואורסצנטיות (עד 50 הרץ) הממחישות את הדינמיקה של Ca 2+ עם יכולת נוספת להבחין ברמות Ca 2+ בתוך מבנים דמויי עמוד שדרה יחיד ומיטוכונדריה בודדת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

הדמיית סידן (Ca 2+) שימשה בעיקר לבחינת הפעילות העצבית, אך מתברר יותר ויותר כי טיפול תת-תאי ב- Ca2+ הוא מרכיב חיוני באיתות תוך תאי. ההדמיה של דינמיקת Ca2+ in vivo תת-תאית, שבה ניתן לחקור נוירונים במעגלים הטבעיים והשלמים שלהם, הוכחה כמאתגרת מבחינה טכנית במערכות עצבים מורכבות. השקיפות ומערכת העצבים הפשוטה יחסית של הנמטודה Caenorhabditis elegans מאפשרות ביטוי ספציפי לתא והדמיה in vivo של תגים ואינדיקטורים פלואורסצנטיים. בין אלה הם אינדיקטורים פלואורסצנטיים שהותאמו לשימוש בציטופלסמה, כמו גם תאים תת-תאיים שונים, כגון המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה לא רציומטרית של Ca 2+ in vivo עם רזולוציה תת-תאית המאפשרת ניתוח של דינמיקת Ca2+ עד לרמת עמוד השדרה הדנדריטי והמיטוכונדריה הבודדים. כאן, שני אינדיקטורים מקודדים גנטית זמינים עם זיקות Ca 2+ שונות משמשים כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה למדידת רמות Ca2+ יחסיות בתוך הציטופלסמה או המטריצה המיטוכונדריאלית בזוג יחיד של נוירונים מעוררים (AVA). יחד עם המניפולציות הגנטיות ותצפיות האורך האפשריות ב- C. elegans, פרוטוקול הדמיה זה עשוי להיות שימושי לענות על שאלות לגבי האופן שבו טיפול Ca2+ מווסת את התפקוד העצבי ואת הפלסטיות.

שני פרוטוקולים אלה מאפשרים רכישה מהירה של רמות Ca2+ דיפרנציאליות בתוך האזורים התת-תאיים והאברונים של נוירוטים בודדים in vivo עם רזולוציה מרחבית גבוהה. הפרוטוקול הראשון מאפשר מדידה של Ca2+ ציטופלזמי ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה. זה מודגם כאן באמצעות ביטוי ספציפי לתא של GCaMP6f ...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקדם את הבנתנו את הטיפול בסידן בתאי עצב, וכיצד סידן ממודר יכול לווסת מנגנונים שונים החשובים לתפקוד העצבי in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת דימות מהיר ברזולוציה גבוהה יותר in vivo בתנאים פיזיולוגיים ב- C.elegans שניתן לשלב עם כלים פלואורסצנטיים אחרים. טכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנון המווסת איתות סידן בתאי עצב בהקשרים רבים ושונים.לדוגמה, במהלך הזדקנות, פגיעה עצבית, ניוון עצבי. מי שידגים הליך זה יהיה אניס דייהל, טכנאי מחקר. קז נייט, דוקטורנטית, ורייצ'ל דוזר, חוקרת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.התחל בשיבוט וקטורי ביטוי המכילים מקדם ואחריו מחוון סידן, ושלושה UTR ראשוניים לבחירה. יצירת זנים טרנסגניים של C.elegans על ידי מיקרו-הזרקה של תערובת DNA המכילה את DNA ההצלה Lin-15 בתוספת בטרנסגן אינדיקטור הסידן לגונד של C.elegans בוגר בן יום אחד. שמרו על תולעי ההורה המוזרקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שצאצאי F1 יגיעו לבגרות.בחר מבוגרים טרנסגניים על ידי הקרנה להיעדר פנוטיפ רב פות. זה מצביע על ביטוי של המערך הכרומוזומלי הנוסף המכיל את מחוון הסידן. מעבר קלונלי צאצאי F1 בוגרים שאין להם את הפנוטיפ הרב-פותי.בצע ניסויים על הדורות הבאים של הזנים הטרנסגניים עם ביטוי אופטימלי של מחוון הסידן. השתמש במיקרוסקופ המסוגל לבצע הדמיה בהילוך מהיר לטווח ארוך. אתר את התולעת תחת יעד הגדלה נמוכה ולאחר מכן עבור ליעד הגדלה גבוהה כדי למקם את הנוירונים.השג את התמונות באמצעות מצלמה רגישה במיוחד המסוגלת לקלוט תמונה במהירות של יותר מ- 50 FPS. לאחר מכן, השתמש במסנן פליטה סטנדרטי עבור מחוון הסידן. הוסף מתקן Z-drift לקבלת זרמי תמונה ארוכים מ- 10 שניות.בשפופרת תרבית זכוכית בגודל 13 על 100 מילימטר, הכינו שלושה מיליליטר של 10% אגר על ידי המסת אגר ברמה מולקולרית ב-M9 וחממו במיקרוגל למשך מספר שניות. כדי להכין את רפידות האגר, ראשית, הכינו שתי שקופיות על ידי הוספת שתי שכבות של סרט מעבדה. לאחר מכן הניחו שקופית מיקרוסקופ בין שתי השקפים.חתכו קצה של קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר והשתמשו בו כדי לקלוט טיפה קטנה של אגר למרכז חלקת הכיסוי. שטח את האגר על ידי לחיצה על שקופית נוספת למטה על גבי האגר. לאחר הקירור, חותכים את האגר לדיסק קטן באמצעות פתיחת צינור 10 מיליליטר, ולאחר מכן מסירים את האגר שמסביב.לאחר מכן, הכינו את תמיסת גלגול התולעים על ידי המסת אבקת מוסצימול ב-M9 ליצירת ציר של 30 מילימולרי. לדלל את המלאי ביחס של אחד לאחד עם חרוזי פוליסטירן כדי ליצור את הפתרון המתגלגל. כדי למקם את התולעת להדמיה, ראשית, הניחו 1.6 מיקרוליטר של התמיסה המתגלגלת על מרכז כרית האגר.לאחר מכן באמצעות קוטף תולעים מועדף, מעבירים תולעת בגיל הרצוי לתמיסת הגלגול על כרית האגר. המתן כחמש דקות עד שהמוצימול יפחית את תנועת התולעת, ולאחר מכן שחרר כיסוי בגודל 22 על 22 מ"מ על גבי כרית האגר. להדמיית נוירוטים בחוט העצב הגחוני, גלגלו את התולעת על ידי החלקה קלה של החלקת הכיסוי.כדי להרכיב את התולעת על המיקרוסקופ, הניחו טיפת שמן טבילה על חלקת הכיסוי. מצא את התולעת באמצעות מטרת הגדלה נמוכה בשדה בהיר. לאחר מכן עבור למטרה של 100x ואתר את נוירוט AVA באמצעות ההארה של GCaMP או mito GCaMP עם לייזר הדמיה של 488 ננומטר.להדמיית GCaMP in vivo, כוונן את לייזר ההדמיה בהגדרות הרכישה עד שהפלואורסצנטיות של GCaMP בזיליקום תהיה בטווח האמצעי של הטווח הדינמי של המצלמה והגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות השנייה. לאחר איתור הנוירוט AVA באמצעות פלואורסצנטיות GCaMP בהגדלה של פי 100, הגדר את מתקן Z-drift והתחל מיקוד אוטומטי רציף. תקן ידנית את מישור המוקד לפי הצורך לפני ההדמיה.קבל זרם של תמונות בהגדלה של פי 100. באמצעות פרוטוקול זה, סידן ציטופלזמי נמדד ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה. הביטוי הספציפי לתא של GCaMP6F בתאי העצב הבין-עצביים של פיקוד AVA הגלוטמטרגי חשף התפשטות כיוונית של זרם הסידן.הכימות התת-תאי של פלואורסצנטיות GCaMP6F הראה כי תחילת זרימת הסידן התעכבה בחלק של הנוריט הממוקם במרחק של 10 מיקרומטר בלבד. כמו כן, מבנים דמויי עמוד שדרה דנדריטיים שנמצאו לאורך נוריט AVA הראו הבזקים בפלואורסצנטיות GCaMP6F שהתרחשו ללא תלות בהפעלת הנוריט ולא הובילו להתפשטות של זרם הסידן. יתר על כן, רמות הסידן היחסיות נמדדו במיטוכונדריה בודדת בנוירונים בודדים באמצעות זן תולעת עם ביטוי ספציפי AVA של המטריצה המיטוכונדריאלית המקומית אינדיקטור סידן mito GCaMP.התוצאות הראו ספיגה סינכרונית של כמות גדולה יחסית של סידן לתת-קבוצה של מיטוכונדריה. באופן ספציפי, ספיגת הסידן בחלק מהמיטוכונדריה הייתה מסונכרנת, בעוד שבמיטוכונדריה שכנים לא נראה שהם סופגים סידן. באופן דומה, תת-קבוצות של מיטוכונדריה הראו ספיגה ושחרור מהירים של כמויות קטנות של סידן.גם זה נראה סינכרוני, אבל רק עבור תת-קבוצה של מיטוכונדריה. מהירות ומניפולציות עדינות חיוניות למיקום בעלי חיים ולשמירה על תפקוד עצבי. גם בריאות בעלי החיים היא בעלת חשיבות עליונה.אפילו קצת רעב הוא בעייתי. החלק הקשה ביותר ללמוד הוא ההתמצאות המהירה של בעלי החיים למיקרוסקופ קונפוקלי ללא נזק. העצה שלי היא הרבה תרגול ובקרות טובות.פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בניסויים שבהם סידן משתחרר ממקומות תת-תאיים אחרים בנוירונים, נוירונים אחרים או תאים שאינם נוירונים ב- C.elegans. מכיוון שגישה זו ב- C.elegans משאירה בעלי חיים ללא פגע, ניתן לענות על שאלות לגבי ויסות הטיפול בסידן תת-תאי in vivo בתאי עצב בודדים של מערכת עצבים שלמה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...