Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर 01- एनएस 115947 एफ होर्न्डली को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था। हम पीएएस 1 प्लास्मिड के लिए डॉ अटिला स्टेटक को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

1. ट्रांसजेनिक उपभेदों का निर्माण
<ol><li>विकल्प 8,9 की क्लोनिंग विधि का उपयोग करते हुए, क्लोन अभिव्यक्ति वैक्टर में पीएफएलपी -18 या प्रिग -3 प्रमोटर (वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में एवीए-विशिष्ट ?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. 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O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. 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E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

वर्णित विधि को लागू करते समय पहले विचार में दिए गए शोध प्रश्न के लिए आदर्श विशेषताओं के साथ सीए2 + संकेतक का चयन शामिल है। साइटोप्लाज्मिक सीए 2 + संकेतकों में आमतौर पर सीए 2 + के लिए एक उच्च संबंध होता है,...

कैल्शियम आयन (सीए2 +) कई सेल प्रकारों में जानकारी के अत्यधिक बहुमुखी वाहक हैं। न्यूरॉन्स में, सीए 2 + न्यूरोट्रांसमीटर की गतिविधि-निर्भर रिहाई, साइटोस्केलेटल गतिशीलता के विनियमन, चयापचय प्रक्रियाओं की बारीक-ट्यूनिंग, साथ ही उचित न्यूरोनल रखरखाव और कार्य 1,2 के लिए आवश्यक कई अन्य तंत्रों के लिए जिम्मेदार है। प्रभावी इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग सुनिश्चित करने के लिए, न्यूरॉन्स को अपने साइटोप्लाज्म3 में कम बेसल सीए2 + स्तर बनाए रखना चाहिए। यह सहकारी सीए 2 + हैंडलिंग तंत्र द्वारा पूरा किया जाता है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे ऑर्गेनेल में सीए2 + का उत्थान शामिल है। ये प्रक्रियाएं, प्लाज्मा झिल्ली में सीए 2 + -पारगम्य आयन चैनलों की व्यवस्था के अलावा, पूरे न्यूरॉन में साइटोप्लाज्मिक सीए2 + के विषम स्तर के परिणामस्वरूप होती हैं।
आराम और न्यूरोनल सक्रियण के दौरान सीए 2 + विषमता सीए2 + -निर्भर तंत्र1 के विविध, स्थान-विशिष्ट विनियमन की अनुमति देती है। सीए 2 + के एकाग्रता-विशिष्ट प्रभावों का एक उदाहरण इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइस्फॉस्फेट (आईएनएसपी3) रिसेप्टर्स के माध्यम से ईआर से सीए2 + की रिहाई है। रिसेप्टर के कैल्शियम-पारगम्य छिद्र के उद्घाटन के लिए आईएनएसपी3 के साथ संयोजन में कम सीए2 + स्तर की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, उच्च सीए2 + स्तर प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से रिसेप्टर4 को रोकते हैं। उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए सीए 2 + होमियोस्टैसिस का महत्व सबूतों से समर्थित है जो बताते हैं कि बाधित इंट्रासेल्युलर सीए2 + हैंडलिंग और सिग्नलिंग न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों औरप्राकृतिक उम्र बढ़ने 5,6 के रोगजनन में एक प्रारंभिक कदम है। विशेष रूप से, ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा असामान्य सीए2 + अपटेक और रिलीज अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग और हंटिंगटन रोग 6,7 में न्यूरोनल डिसफंक्शन की शुरुआत से जुड़ा हुआ है।
प्राकृतिक उम्र बढ़ने या न्यूरोडीजेनेरेशन के दौरान सीए 2 + डिस्होमोस्टेसिस के अध्ययन के लिए एक जीवित, बरकरार जीव में उपकोशिकीय संकल्प के साथ सीए2 + स्तरों के अनुदैर्ध्य अवलोकन की आवश्यकता होती है जिसमें देशी सेलुलर वास्तुकला (यानी, सिनैप्स की व्यवस्था और आयन चैनलों का वितरण) बनाए रखा जाता है। इसके लिए, यह प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो में सीए 2 + गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए दो आसानी से उपलब्ध, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + सेंसर के उपयोग पर मार्गदर्शन प्रदान करता है। एलिगेंस में वर्णित विधि का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि एकल न्यूरॉन्स के साइटोप्लाज्म या माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में सीए 2 + संकेतकों की अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट छवियों (50 हर्ट्ज तक) के तेजी से अधिग्रहण की अनुमति दे सकती है जो एकल रीढ़ जैसी संरचनाओं और व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सीए 2 + स्तरों को समझने की अतिरिक्त क्षमता के साथ सीए 2 + गतिशीलता को चित्रित करती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

कैल्शियम (सीए 2 +) इमेजिंग का उपयोग बड़े पैमाने पर न्यूरोनल गतिविधि की जांच करने के लिए किया गया है, लेकिन यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि उपकोशिकीय सीए2 + हैंडलिंग इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग का एक महत्वपूर्ण घटक है। विवो में उपकोशिकीय सीए2 + गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन, जहां न्यूरॉन्स को उनके मूल, बरकरार सर्किटरी में अध्ययन किया जा सकता है, जटिल तंत्रिका तंत्र में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस की पारदर्शिता और अपेक्षाकृत सरल तंत्रिका तंत्र सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट टैग और संकेतकों के विवो विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम करता है। इनमें फ्लोरोसेंट संकेतक हैं जिन्हें साइटोप्लाज्म के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया जैसे विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक उपकोशिकीय संकल्प के साथ विवो में गैर-अनुपातमीट्रिक सीए 2 + इमेजिंग को सक्षम करता है जो व्यक्तिगत डेंड्राइटिक स्पाइन और माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर तक सीए2 + गतिशीलता के विश्लेषण की अनुमति देता है। यहां, विभिन्न सीए 2 + समानताओं के साथ दो उपलब्ध आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों का उपयोग उत्तेजक इंटरन्यूरॉन (एवीए) की एक जोड़ी में साइटोप्लाज्म या माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के भीतर सापेक्ष सीए2 + स्तरों को मापने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। एलिगेंस में संभव आनुवंशिक जोड़तोड़ और अनुदैर्ध्य टिप्पणियों के साथ, यह इमेजिंग प्रोटोकॉल इस बारे में सवालों के जवाब देने के लिए उपयोगी हो सकता है कि सीए2 + हैंडलिंग न्यूरोनल फ़ंक्शन और प्लास्टिसिटी को कैसे नियंत्रित करता है।

ये दो प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो में व्यक्तिगत न्यूरॉइट्स के उप-कोशिकीय क्षेत्रों और ऑर्गेनेल के भीतर अंतर सीए2 + स्तरों के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम करते हैं। पहला प्रोटोक...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

वर्तमान तरीकों में आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके केनोरहाब्डिस एलिगेंस में विवो में उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उप-कंपार्टमेंटल कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक गैर-अनुपातमीट्रिक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है।

विवो में न्यूरोनल कैल्शियम हैंडलिंग की उपकोशिकीय इमेजिंग

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

इस तकनीक का उपयोग न्यूरॉन्स में कैल्शियम हैंडलिंग की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है, और कैसे कंपार्टमेंटल कैल्शियम विवो में न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण विभिन्न तंत्रों को विनियमित कर सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह सी.एलिगेंस में शारीरिक स्थितियों के तहत विवो इमेजिंग में तेजी से उच्च रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है जिसे अन्य फ्लोरोसेंट टूल के साथ जोड़ा जा सकता है। यह तकनीक कई अलग-अलग संदर्भों में न्यूरॉन्स में कैल्शियम सिग्नलिंग को विनियमित करने वाले तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।उदाहरण के लिए, उम्र बढ़ने के दौरान, न्यूरोनल चोट, और न्यूरोडीजेनेरेशन। इस प्रक्रिया का प्रदर्शन अनुसंधान तकनीशियन एनीस डीहल करेंगे। काज़ नाइट, एक पीएचडी उम्मीदवार, और राहेल डोसर, मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्टडॉक्टरल शोधकर्ता।अभिव्यक्ति वैक्टर की क्लोनिंग करके शुरू करें जिसमें एक प्रमोटर होता है जिसके बाद कैल्शियम संकेतक होता है, और पसंद के तीन प्रमुख यूटीआर होते हैं। एक दिन के वयस्क सी.एलिगेंस के गोनाड में कैल्शियम इंडिकेटर ट्रांसजीन में बचाव डीएनए लिन -15 प्लस युक्त डीएनए मिश्रण के माइक्रोइंजेक्शन द्वारा ट्रांसजेनिक सी.एलिगेंस उपभेदों का निर्माण करें। इंजेक्शन वाले माता-पिता के कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें जब तक कि एफ 1 संतान वयस्कता तक नहीं पहुंच जाती।मल्टी-वल्वा फेनोटाइप की अनुपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग द्वारा ट्रांसजेनिक वयस्कों का चयन करें। यह कैल्शियम संकेतक युक्त अतिरिक्त क्रोमोसोमल सरणी की अभिव्यक्ति को इंगित करता है। क्लोनल रूप से वयस्क एफ 1 संतान जिसमें बहु-वल्वा फेनोटाइप नहीं होता है।कैल्शियम संकेतक की इष्टतम अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक उपभेदों की बाद की पीढ़ियों पर प्रयोग करें। दीर्घकालिक टाइम-लैप्स इमेजिंग में सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। कम आवर्धन उद्देश्य के तहत कीड़े का पता लगाएं और फिर न्यूरॉन्स को स्थानीयकृत करने के लिए उच्च आवर्धन उद्देश्य पर स्विच करें।50 से अधिक एफपीएस पर तेजी से छवि अधिग्रहण में सक्षम एक अल्ट्रासेंसिटिव कैमरे का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें। इसके बाद, कैल्शियम संकेतक के लिए एक मानक उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें। 10 सेकंड से अधिक समय तक छवि धाराओं के अधिग्रहण के लिए जेड-ड्रिफ्ट सुधारक जोड़ें।13-बाय-100-मिलीमीटर ग्लास कल्चर ट्यूब में एम 9 में आणविक ग्रेड एगर को घोलकर और कई सेकंड के लिए माइक्रोवेव करके 10% एगर के तीन मिलीलीटर तैयार करें। अगर पैड बनाने के लिए सबसे पहले लेबोरेटरी टेप की दो परतें जोड़कर दो स्लाइड तैयार करें। फिर दो स्लाइडों के बीच एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें।1000-माइक्रोलीटर पिपेट टिप की नोक को काटें और इसका उपयोग कवर स्लिप के केंद्र पर आगर की एक छोटी बूंद को पाइप करने के लिए करें। आगर के ऊपर नीचे एक और स्लाइड दबाकर आगर को समतल करें। ठंडा होने के बाद, 10-मिलीलीटर ट्यूब के उद्घाटन का उपयोग करके आगर को एक छोटी डिस्क में काट लें, और फिर आसपास के आगर को हटा दें।इसके बाद, 30-मिलीमोलर स्टॉक बनाने के लिए एम 9 में म्यूसिमोल पाउडर को घोलकर वर्म रोलिंग समाधान तैयार करें। रोलिंग समाधान बनाने के लिए पॉलीस्टाइनिन मोतियों के साथ एक-से-एक अनुपात में स्टॉक को पतला करें। इमेजिंग के लिए कीड़े को रखने के लिए, सबसे पहले, आगर पैड के केंद्र पर रोलिंग समाधान के 1.6 माइक्रोलीटर रखें।फिर एक पसंदीदा वर्म पिक का उपयोग करके, वांछित उम्र के एक कीड़े को आगर पैड पर रोलिंग समाधान में स्थानांतरित करें। कीड़े की गति को कम करने के लिए म्यूसिमोल के लिए लगभग पांच मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर आगर पैड के शीर्ष पर 22-बाय-22-मिलीमीटर कवर स्लिप गिराएं। वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में इमेजिंग न्यूरॉइट्स के लिए, कवर स्लिप को थोड़ा स्लाइड करके कीड़े को रोल करें।माइक्रोस्कोप पर कीड़े को माउंट करने के लिए, कवर स्लिप पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें। ब्राइटफील्ड में कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करके कीड़े का पता लगाएं। फिर 100x उद्देश्य पर स्विच करें और 488-नैनोमीटर इमेजिंग लेजर के साथ GCaMP या mito GCaMP की रोशनी का उपयोग करके AVA न्यूराइट का पता लगाएं।विवो जीसीएएमपी इमेजिंग के लिए, अधिग्रहण सेटिंग्स में इमेजिंग लेजर को समायोजित करें जब तक कि बेसिल जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस कैमरे की गतिशील सीमा की मध्य सीमा में न हो और एक्सपोज़र समय को 20 मिलीसेकंड तक सेट करें। एवीए न्यूराइट को 100 गुना आवर्धन पर जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस का उपयोग करके स्थित होने के बाद, जेड-ड्रिफ्ट सुधारक सेट करें, और निरंतर ऑटोफोकसिंग शुरू करें। इमेजिंग से पहले आवश्यकतानुसार फोकल प्लेन को मैन्युअल रूप से सही करें।100 गुना आवर्धन पर छवियों की एक धारा प्राप्त करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम को उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ मापा गया था। ग्लूटामेटर्जिक एवीए कमांड इंटरन्यूरॉन में जीसीएएमपी 6 एफ की सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति ने कैल्शियम प्रवाह के दिशात्मक प्रसार का खुलासा किया।जीसीएएमपी 6 एफ फ्लोरेसेंस के उपकोशिकीय परिमाणीकरण से पता चला है कि कैल्शियम प्रवाह की शुरुआत केवल 10 माइक्रोमीटर दूर स्थित न्यूराइट के एक हिस्से में देरी हुई थी। इसके अलावा, एवीए न्यूराइट के साथ पाए जाने वाले डेंड्राइटिक स्पाइन जैसी संरचनाओं ने जीसीएएमपी 6 एफ फ्लोरेसेंस में चमक दिखाई जो न्यूराइट सक्रियण से स्वतंत्र रूप से हुई और कैल्शियम प्रवाह के प्रसार का कारण नहीं बनी। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स स्थानीयकृत कैल्शियम संकेतक माइटो जीसीएएमपी की एवीए विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ एक कृमि तनाव का उपयोग करके एकल न्यूरॉइट्स में व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में सापेक्ष कैल्शियम के स्तर को मापा गया था।परिणामों ने माइटोकॉन्ड्रिया के उप-समूह में अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में कैल्शियम के तुल्यकालिक उत्थान को दिखाया। विशेष रूप से, कुछ माइटोकॉन्ड्रिया में कैल्शियम अपटेक सिंक्रनाइज़ किया गया था, जबकि पड़ोसी माइटोकॉन्ड्रिया कैल्शियम लेने के लिए दिखाई नहीं देते थे। इसी तरह, माइटोकॉन्ड्रिया के उपसमुच्चय ने कैल्शियम की थोड़ी मात्रा में तेजी से उत्थान और रिहाई दिखाई।यह भी तुल्यकालिक प्रतीत होता है लेकिन केवल माइटोकॉन्ड्रिया के उप-समूह के लिए। जानवरों की स्थिति और न्यूरोनल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए गति और ठीक जोड़तोड़ आवश्यक हैं। पशु स्वास्थ्य भी सर्वोपरि है।यहां तक कि थोड़ी भुखमरी भी समस्याग्रस्त है। सीखने के लिए सबसे कठिन हिस्सा क्षति के बिना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए जानवरों का तेजी से अभिविन्यास है। मेरी सलाह बहुत अभ्यास और अच्छे नियंत्रण है।इस प्रोटोकॉल को उन प्रयोगों पर लागू किया जा सकता है जहां कैल्शियम न्यूरॉन्स, अन्य न्यूरॉन्स या सी एलिगेंस में न्यूरॉन्स के अलावा अन्य उपकोशिकीय स्थानों से जारी किया जाता है। चूंकि सी एलिगेंस में यह दृष्टिकोण जानवरों को बरकरार रखता है, इसलिए एक पूर्ण तंत्रिका तंत्र के एकल न्यूरॉन्स में विवो में उपकोशिकीय कैल्शियम हैंडलिंग के विनियमन के बारे में सवालों को संबोधित करना संभव है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Vivo सी. में neuronal कैल्शियम इमेजिंग में एलिगेंस

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Neuronal घने कोर vesicles के सुपर संकल्प इमेजिंग

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

सी में Dauer-विशिष्ट neuronal remodeling के vivo इमेजिंग में एलिगेंस

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent कैल्शियम सूचक GFP-aequorin के आधार पर विवो कार्यात्मक ब्रेन इमेजिंग दृष्टिकोण में

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र Neuronal ऊतक लंबे समय तक ऊष्मायन

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉनल Dendrites में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Vivo में लार्वा Zebrafish में पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

विवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में लर्निंग-प्रेरित सिंपटिक प्लास्टिकिटी में ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

विवो न्यूरोनल सर्किट कनेक्टिविटी में नकल करने के लिए इन विट्रो वेज स्लाइस तैयारी

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...