Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 assegnato a F. Hoerndli). Vorremmo anche ringraziare il Dr. Attila Stetak per il plasmide pAS1.

1. Creazione di ceppi transgenici
<ol><li>Utilizzando un metodo di clonazione a scelta8,9, clonare vettori di espressione per contenere il promotore Pflp-18 o Prig-3 (per il segnale specifico AVA nel cordone nervoso ventrale), seguito dall'indicatore di scelta Ca2+, e quindi un 3' UTR (vedere la discussione per maggiori informazioni)10. Un elenco dei plasmidi e delle loro fonti può essere tr...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

La prima considerazione quando si implementa il metodo descritto comporta la selezione di un indicatore Ca2+ con caratteristiche ideali per la domanda di ricerca data. Gli indicatori citoplasmatici di Ca 2+ hanno tipicamente un'alta affinità per Ca 2+ e la sensibilità di questi indicatori a Ca 2+ è inversamente correlata alla cinetica (on/off rate)16,17. Ciò significa che la sensibilità o la cinetica di Ca2+</...

Gli ioni calcio (Ca2+) sono vettori altamente versatili di informazioni in molti tipi di cellule. Nei neuroni, Ca2+ è responsabile del rilascio dipendente dall'attività dei neurotrasmettitori, della regolazione della motilità citoscheletrica, della messa a punto dei processi metabolici, nonché di molti altri meccanismi necessari per il corretto mantenimento e funzione neuronale 1,2. Per garantire un'efficace segnalazione intracellulare, i neuroni devono mantenere bassi i livelli basali di Ca2+ nel loro citoplasma3. Ciò è ottenuto da meccanismi di manipolazione cooperativa di Ca 2+, incluso l'assorbimento di Ca2+ in organelli come il reticolo endoplasmatico (ER) e i mitocondri. Questi processi, oltre alla disposizione dei canali ionici permeabili al Ca 2+ nella membrana plasmatica, determinano livelli eterogenei di Ca2+ citoplasmatico in tutto il neurone.
L'eterogeneità di Ca 2+ durante il riposo e l'attivazione neuronale consente la regolazione diversificata e specifica della posizione dei meccanismi dipendenti da Ca2+ 1. Un esempio degli effetti specifici della concentrazione di Ca 2+ è il rilascio di Ca2+ dall'ER attraverso i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (InsP3). Bassi livelli di Ca2+ in combinazione con InsP3 sono necessari per l'apertura del poro permeabile al calcio del recettore. In alternativa, alti livelli di Ca2+ inibiscono direttamente e indirettamente il recettore4. L'importanza dell'omeostasi del Ca 2+ per la corretta funzione neuronale è supportata da prove che suggeriscono che la manipolazione e la segnalazione intracellulare di Ca2+ è un passo iniziale nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi e dell'invecchiamento naturale 5,6. In particolare, l'assorbimento e il rilascio anormali di Ca2+ da parte dell'ER e dei mitocondri sono legati all'insorgenza di disfunzioni neuronali nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson e nella malattia di Huntington 6,7.
Lo studio della disomeostasi di Ca 2+ durante l'invecchiamento naturale o la neurodegenerazione richiede l'osservazione longitudinale dei livelli di Ca2+ con risoluzione subcellulare in un organismo vivente e intatto in cui viene mantenuta l'architettura cellulare nativa (cioè la disposizione delle sinapsi e la distribuzione dei canali ionici). A tal fine, questo protocollo fornisce indicazioni sull'uso di due sensori Ca 2+ codificati geneticamente disponibili per la registrazione delle dinamiche Ca2+ in vivo con elevata risoluzione spaziale e temporale. I risultati rappresentativi acquisiti utilizzando il metodo descritto in C. elegans dimostrano come l'espressione di indicatori di Ca 2+ nel citoplasma o nella matrice mitocondriale di singoli neuroni possa consentire la rapida acquisizione di immagini fluorescenti (fino a 50 Hz) che illustrano la dinamica di Ca 2+ con la capacità aggiuntiva di discernere i livelli di Ca 2+ all'interno di singole strutture simili a spine e singoli mitocondri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

L'imaging del calcio (Ca 2+) è stato ampiamente utilizzato per esaminare l'attività neuronale, ma sta diventando sempre più chiaro che la manipolazione subcellulare di Ca2+ è una componente cruciale della segnalazione intracellulare. La visualizzazione della dinamica subcellulare di Ca2+ in vivo, dove i neuroni possono essere studiati nei loro circuiti nativi e intatti, si è dimostrata tecnicamente impegnativa nei sistemi nervosi complessi. La trasparenza e il sistema nervoso relativamente semplice del nematode Caenorhabditis elegans consentono l'espressione cellula-specifica e la visualizzazione in vivo di tag e indicatori fluorescenti. Tra questi ci sono indicatori fluorescenti che sono stati modificati per l'uso nel citoplasma e vari compartimenti subcellulari, come i mitocondri. Questo protocollo consente l'imaging non raziometrico di Ca 2+ in vivo con una risoluzione subcellulare che consente l'analisi della dinamica di Ca2+ fino al livello delle singole spine dendritiche e dei mitocondri. Qui, due indicatori geneticamente codificati disponibili con diverse affinità Ca 2+ sono utilizzati per dimostrare l'uso di questo protocollo per misurare i livelli relativi di Ca2+ all'interno del citoplasma o della matrice mitocondriale in una singola coppia di interneuroni eccitatori (AVA). Insieme alle manipolazioni genetiche e alle osservazioni longitudinali possibili in C. elegans, questo protocollo di imaging può essere utile per rispondere a domande su come la manipolazione di Ca2+ regola la funzione neuronale e la plasticità.

Questi due protocolli consentono la rapida acquisizione di livelli differenziali di Ca2+ all'interno delle regioni subcellulari e degli organelli dei singoli neuriti in vivo con elevata risoluzione spaziale. Il primo protocollo consente la misurazione del Ca 2+ citoplasmatico con elevata risoluzione temporale e spaziale. Ciò è dimostrato qui utilizzando l'espressione cellula-specifica di GCaMP6f negli interneuroni15 del comando glutammatergico AVA, i cui neuriti pe...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Questa tecnica può essere utilizzata per far progredire la nostra comprensione della gestione del calcio nei neuroni e di come il calcio compartimentato può regolare diversi meccanismi importanti per la funzione neuronale in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una maggiore risoluzione rapida in vivo di imaging in condizioni fisiologiche in C.elegans che possono essere combinati con altri strumenti fluorescenti. Questa tecnica potrebbe fornire informazioni sul meccanismo che regola la segnalazione del calcio nei neuroni in molti contesti diversi.Ad esempio, durante l'invecchiamento, lesioni neuronali e neurodegenerazione. A dimostrare questa procedura sarà Ennis Deihl, tecnico di ricerca. Kaz Knight, dottorando, e Rachel Doser, ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio.Inizia clonando vettori di espressione che contengono un promotore seguito da un indicatore di calcio e tre UTR principali di scelta. Creare ceppi transgenici di C.elegans mediante microiniezione di una miscela di DNA contenente il DNA di salvataggio Lin-15 plus nel transgene indicatore di calcio nella gonade di un adulto di un giorno di C.elegans. Mantenere i vermi genitori iniettati a 20 gradi Celsius fino a quando la progenie F1 raggiunge l'età adulta.Selezionare adulti transgenici mediante screening per l'assenza del fenotipo multi-vulva. Ciò indica l'espressione dell'array cromosomico extra contenente l'indicatore di calcio. Progenie F1 adulta di passaggio clonale che non ha il fenotipo multi-vulva.Eseguire esperimenti sulle generazioni successive dei ceppi transgenici con un'espressione ottimale dell'indicatore di calcio. Utilizzare un microscopio in grado di imaging Time-lapse a lungo termine. Individuare il worm sotto un obiettivo a basso ingrandimento e quindi passare a un obiettivo ad alto ingrandimento per localizzare i neuroni.Acquisisci le immagini utilizzando una fotocamera ultrasensibile in grado di acquisire rapidamente le immagini a più di 50 FPS. Quindi, utilizzare un filtro di emissione standard per l'indicatore di calcio. Aggiungi un correttore Z-drift per l'acquisizione di flussi di immagini più lunghi di 10 secondi.In un tubo di coltura di vetro da 13 x 100 millimetri preparare tre millilitri di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M9 e microonde per diversi secondi. Per realizzare i cuscinetti di agar, in primo luogo, preparare due vetrini aggiungendo due strati di nastro da laboratorio. Quindi posizionare un vetrino da microscopio tra i due vetrini.Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1000 microlitri e utilizzarla per pipettare una piccola goccia di agar al centro della slitta del coperchio. Appiattire l'agar premendo un'altra diapositiva verso il basso sopra l'agar. Dopo il raffreddamento, tagliare l'agar in un piccolo disco usando l'apertura di un tubo da 10 millilitri, quindi rimuovere l'agar circostante.Quindi, preparare la soluzione di laminazione della vite senza fine sciogliendo la polvere di muscimolo in M9 per creare uno stock di 30 millimolari. Diluire il brodo in un rapporto uno a uno con perle di polistirolo per ottenere la soluzione di laminazione. Per posizionare il verme per l'imaging, in primo luogo, posizionare 1,6 microlitri della soluzione di laminazione al centro del pad di agar.Quindi, utilizzando un plettro per vite senza fine preferito, trasferire un verme dell'età desiderata nella soluzione di laminazione sul pad di agar. Attendere circa cinque minuti affinché il muscimolo riduca il movimento del verme, quindi rilasciare una scivolata di copertura di 22 x 22 millimetri sulla parte superiore del cuscinetto di agar. Per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso ventrale, arrotolare il verme facendo scorrere leggermente la linguetta di copertura.Per montare il verme sul microscopio, posizionare una goccia di olio ad immersione sul vetrino di copertura. Trova il worm usando un obiettivo a basso ingrandimento in campo chiaro. Quindi passare all'obiettivo 100x e localizzare il neurite AVA utilizzando l'illuminazione del GCaMP o mito GCaMP con il laser di imaging a 488 nanometri.Per l'imaging GCaMP in vivo, regolare il laser di imaging nelle impostazioni di acquisizione fino a quando la fluorescenza GCaMP del basilico è nella gamma media della gamma dinamica della fotocamera e impostare il tempo di esposizione su 20 millisecondi. Dopo aver localizzato il neurite AVA utilizzando la fluorescenza GCaMP a 100 volte l'ingrandimento, impostare il correttore Z-drift e avviare la messa a fuoco automatica continua. Correggere manualmente il piano focale in base alle esigenze prima di eseguire l'imaging.Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100 volte. Utilizzando questo protocollo, il calcio citoplasmatico è stato misurato con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. L'espressione cellulare specifica di GCaMP6F negli interneuroni di comando glutammatergici AVA ha rivelato una propagazione direzionale dell'afflusso di calcio.La quantificazione subcellulare della fluorescenza GCaMP6F ha mostrato che l'insorgenza dell'afflusso di calcio era ritardata in una porzione del neurite situata a soli 10 micrometri di distanza. Inoltre, le strutture dendritiche simili a spine trovate lungo il neurite AVA hanno mostrato lampi nella fluorescenza GCaMP6F che si sono verificati indipendentemente dall'attivazione dei neuriti e non hanno portato a una propagazione dell'afflusso di calcio. Inoltre, i livelli relativi di calcio sono stati misurati nei singoli mitocondri in singoli neuriti utilizzando un ceppo di verme con un'espressione specifica AVA dell'indicatore di calcio localizzato della matrice mitocondriale mito GCaMP.I risultati hanno mostrato l'assorbimento sincrono di una quantità relativamente grande di calcio in un sottogruppo di mitocondri. In particolare, l'assorbimento del calcio in alcuni mitocondri era sincronizzato, mentre i mitocondri vicini non sembravano assorbire calcio. Allo stesso modo, sottogruppi di mitocondri hanno mostrato un rapido assorbimento e rilascio di piccole quantità di calcio.Anche questo sembrava essere sincrono, ma solo per un sottoinsieme di mitocondri. La velocità e le manipolazioni fini sono essenziali per posizionare gli animali e mantenere la funzione neuronale. Anche la salute degli animali è fondamentale.Anche un po 'di fame è problematico. La parte più difficile da imparare è il rapido orientamento degli animali per la microscopia confocale senza danni. Il mio consiglio è molta pratica e buoni controlli.Questo protocollo potrebbe essere applicato a esperimenti in cui il calcio viene rilasciato da altre posizioni subcellulari nei neuroni, altri neuroni o cellule diverse dai neuroni in C.elegans. Poiché questo approccio in C.elegans lascia intatti gli animali, è possibile affrontare domande sulla regolazione della gestione subcellulare del calcio in vivo in singoli neuroni di un sistema nervoso completo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

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Neuroscienze

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