Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01-NS115947がF. Hoerndliに授与)によってサポートされました。また、pAS1プラスミドを提供してくれたAttila Stetak博士にも感謝します。

1. トランスジェニック株の作製
<ol><li>選択したクローニング法8,9を用いて、Pflp-18またはPrig-3プロモーター(腹側神経索におけるAVA特異的シグナル用)を含む発現ベクターをクローニングし、続いて選択したCa2+指標、次いで3' UTR(詳細についてはディスカッションを参照)10を含む。プラスミドとその...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. 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E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

記載された方法を実施する際の最初の考慮事項は、所与の研究課題に対して理想的な特性を有するCa2+指標の選択を含む。細胞質Ca2+指示薬は典型的にはCa2+に対して高い親和性を有し、Ca2+に対するこれらの指示薬の感受性は動態(オン/オフ率)に反比例する16,17。これは、Ca2+感度または動力学のいずれかを関心...

カルシウムイオン(Ca2+)は、多くの細胞型において非常に汎用性の高い情報担体です。ニューロンにおいて、Ca2+は、神経伝達物質の活動依存的放出、細胞骨格運動性の調節、代謝過程の微調整、ならびに適切なニューロンの維持および機能に必要な他の多くのメカニズムに関与している1,2。効果的な細胞内シグナル伝達を確実にするために、ニューロンは細胞質3において低い基底Ca2+レベルを維持しなければならない。これは、小胞体(ER)やミトコンドリアなどの細胞小器官へのCa2+の取り込みを含む、協調的なCa2+処理メカニズムによって達成されます。これらのプロセスは、原形質膜におけるCa2+透過性イオンチャネルの配置に加えて、ニューロン全体にわたって不均一なレベルの細胞質Ca2+をもたらす。
安静時およびニューロン活性化中のCa2+不均一性は、Ca2+依存性メカニズムの多様で場所特異的な調節を可能にします1。Ca2+の濃度特異的効果の一例は、イノシトール1,4,5-三リン酸(InsP3)受容体を介したERからのCa2+の放出である。InsP3と組み合わせた低Ca2+レベルは、受容体のカルシウム透過性細孔の開口に必要とされる。あるいは、高いCa2+レベルは、受容体4を直接的および間接的に阻害する。適切な神経機能のためのCa2+恒常性の重要性は、細胞内Ca2+の取り扱いおよびシグナル伝達の破壊が神経変性障害および自然老化の病因の初期段階であることを示唆する証拠によって裏付けられている5,6。具体的には、ERおよびミトコンドリアによる異常なCa2+の取り込みおよび放出は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病における神経機能障害の発症に関連している6,7。
自然老化または神経変性中のCa2+異相変の研究には、天然の細胞構造(すなわち、シナプスの配置およびイオンチャネルの分布)が維持されている生きている無傷の生物における細胞内分解能でのCa2+レベルの縦断的観察が必要である。この目的のために、このプロトコルは、高い空間的および時間的分解能でin vivoでCa2+ダイナミクスを記録するために、容易に入手可能で遺伝的にコード化された2つのCa2+センサーの使用に関するガイダンスを提供します。C. elegansに記載の方法を用いて得られた代表的な結果は、単一ニューロンの細胞質またはミトコンドリアマトリックスにおけるCa2+指示薬の発現が、単一のスパイン様構造および個々のミトコンドリア内のCa2+レベルを識別する追加能力を有するCa2+動態を示す蛍光画像(最大50Hz)の迅速な取得をどのように可能にするかを示している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

カルシウム(Ca2+)イメージングは、主に神経活動を調べるために使用されてきましたが、細胞内Ca2+の取り扱いが細胞内シグナル伝達の重要な要素であることがますます明らかになっています。ニューロンを本来の無傷の回路で研究できるin vivoでの細胞内Ca2+ダイナミクスの視覚化は、複雑な神経系では技術的に困難であることが証明されています。線虫Caenorhabditis elegansの透明性と比較的単純な神経系は、蛍光タグとインジケーターの細胞特異的発現とin vivo視覚化を可能にします。これらの中には、細胞質ならびにミトコンドリアなどの様々な細胞内区画で使用するために改変された蛍光指示薬がある。このプロトコルは、個々の樹状突起スパインおよびミトコンドリアのレベルまでのCa2+動態の分析を可能にする細胞内分解能でin vivoでの非レシオメトリックCa2+イメージングを可能にします。ここでは、異なるCa2+親和性を有する2つの利用可能な遺伝的にコードされた指標を使用して、単一の興奮性介在ニューロン(AVA)の細胞質またはミトコンドリアマトリックス内の相対的なCa2+レベルを測定するためのこのプロトコルの使用を実証する。C. elegansで可能な遺伝子操作と縦断的観察とともに、このイメージングプロトコルは、Ca 2+の取り扱いがニューロン機能と可塑性をどのように調節するかに関する質問に答えるのに役立つ可能性があります。

これら2つのプロトコルにより、in vivoで個々の神経突起の細胞内領域および細胞小器官内の異なるCa2+レベルを高い空間分解能で迅速に取得できます。最初のプロトコルは、高い時間的および空間的分解能で細胞質Ca2+の測定を可能にします。これは、神経突起が腹側神経索の全長を走るグルタミン酸作動性AVAコマンド介在ニューロン15におけるGCaMP6fの?...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin vivoで高解像度のサブコンパートメントカルシウムイメージングのための非レシオメトリックアプローチを説明しています。

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

この手法は、ニューロンにおけるカルシウムの取り扱い、および区画化されたカルシウムがin vivoのニューロン機能に重要なさまざまなメカニズムをどのように制御できるかについての理解を深めるために使用できます。この技術の主な利点は、他の蛍光ツールと組み合わせることができるC.elegansの生理学的条件下で、より高い解像度の迅速なin vivoイメージングを可能にすることです。この手法は、さまざまな状況でニューロンのカルシウムシグナル伝達を調節するメカニズムに関する洞察を提供する可能性があります。例えば、老化中、神経損傷、および神経変性の間。この手順を実演するのは、研究技術者のエニス・ダイルです。博士課程の候補者であるカズ・ナイトと、私の研究室のポスドク研究員であるレイチェル・ドーザー。まず、プロモーター、カルシウムインジケーター、および選択した3つのプライムUTRを含む発現ベクターをクローニングします。カルシウムインジケーター導入遺伝子にレスキューDNA Lin-15プラスを含むDNAミックスを1日齢の成人C.エレガンスの生殖腺にマイクロインジェクションすることにより、トランスジェニックC.elegans株を作成します。F20の子孫が成体に達するまで、注入された親ワームを摂氏1度に維持します。多外陰部の表現型がないことをスクリーニングすることにより、トランスジェニック成人を選択します。すなわち、カルシウム指示薬を含む外染色体配列の発現を示す。クローン継代成体F1は、多外陰部表現型を持たない。カルシウム指示薬の最適な発現を有するトランスジェニック株のその後の世代について実験を行う。長期間のタイムラプス撮影が可能な顕微鏡を使用してください。低倍率の対物レンズの下にワームを配置し、高倍率の対物レンズに切り替えてニューロンを局在化させます。50FPS以上の高速画像取得が可能な超高感度カメラを使用して画像を取得します。次に、カルシウムインジケーターに標準の発光フィルターを使用します。10秒を超える画像ストリームを取得するためのZドリフト補正器を追加します。13×100mmのガラス培養チューブに、分子グレード寒天をM9に溶解し、数秒間マイクロ波で3ミリリットルの10%寒天を調製します。寒天パッドを作るには、まず、2層の実験用テープを追加して2枚のスライドを準備します。次に、2つのスライドの間に顕微鏡スライドを配置します。1000マイクロリットルのピペットチップの先端を切り取り、それを使用してカバースリップの中央に寒天の小さな滴をピペットで貼り付けます。寒天の上に別のスライドを押し下げて、寒天を平らにします。冷却後、10ミリリットルのチューブの開口部を使用して寒天を小さなディスクに切断し、周囲の寒天を取り除きます。次に、ムシモール粉末をM9に溶解してウォーム圧延液を調製し、30ミリモルのストックを作成した。ストックをポリスチレンビーズで1対1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。ワームをイメージング用に配置するには、まず、1.6マイクロリットルのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。次いで、好ましいワームピックを用いて、所望の年齢のワームを寒天パッド上の転動溶液に移す。ムシモールがワームの動きを減らすまで約5分間待ってから、寒天パッドの上に22 x 22ミリメートルのカバースリップを落とします。腹側神経索の神経突起を画像化するには、カバースリップをわずかにスライドさせてワームを転がします。ワームを顕微鏡に取り付けるには、カバースリップに液浸オイルを一滴置きます。明視野で低倍率の対物レンズを使用してワームを見つけます。次に、100倍の対物レンズに切り替え、GCaMPまたはmito GCaMPの照明と488ナノメートルのイメージングレーザーを使用してAVA神経突起を見つけます。in vivo GCaMPイメージングの場合は、バジルGCaMP蛍光がカメラのダイナミックレンジのミッドレンジに入るまで、取得設定でイメージングレーザーを調整し、露光時間を20ミリ秒に設定します。GCaMP蛍光を100倍の倍率で使用してAVA神経突起を見つけた後、Zドリフト補正器を設定し、連続オートフォーカスを開始します。イメージングする前に、必要に応じて焦点面を手動で修正します。100倍の倍率で画像のストリームを取得します。このプロトコルを使用して、細胞質カルシウムを高い時間的および空間的分解能で測定しました。グルタミン酸作動性AVAコマンド介在ニューロンにおけるGCaMP6Fの細胞特異的発現は、カルシウム流入の方向性伝播を明らかにした。GCaMP6F蛍光の細胞内定量は、わずか10マイクロメートル離れた神経突起の一部でカルシウム流入の開始が遅れることを示しました。また、AVA神経突起に沿って見られる樹状突起スパイン様構造は、神経突起の活性化とは無関係に起こり、カルシウム流入の伝播をもたらさないGCaMP6F蛍光の閃光を示した。また、ミトコンドリアマトリックス局在カルシウム指標mito GCaMPのAVA特異的発現を有する虫株を用いて、個々のミトコンドリアにおける単一神経突起における相対カルシウムレベルを測定した。結果は、ミトコンドリアのサブセットへの比較的大量のカルシウムの同期取り込みを示しました。具体的には、一部のミトコンドリアへのカルシウム取り込みは同期していたが、隣接するミトコンドリアはカルシウムを吸収していないようであった。同様に、ミトコンドリアのサブセットは、少量のカルシウムの急速な取り込みと放出を示しました。これも同期しているように見えましたが、ミトコンドリアのサブセットに対してのみです。スピードと細かい操作は、動物のポジショニングと神経機能の維持に不可欠です。動物の健康も最優先事項です。少しでも飢餓は問題があります。学ぶのが最も難しい部分は、損傷のない共焦点顕微鏡検査のための動物の迅速な配向です。私のアドバイスは、多くの練習と良いコントロールです。このプロトコルは、カルシウムがニューロンの他の細胞内位置、他のニューロン、またはC.elegansのニューロン以外の細胞から放出される実験に適用できます。C.elegansのこのアプローチは動物を無傷のままにするので、完全な神経系の単一ニューロンにおけるin vivoでの細胞内カルシウム取り扱いの調節に関する質問に取り組むことが可能です。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...