Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

이 작업은 국립 보건원 (NIH) (R01-NS115947이 F. Hoerndli에게 수여됨)의 지원을 받았습니다. 또한 pAS1 플라스미드에 대해 Attila Stetak 박사에게도 감사드립니다.

1. 형질전환 균주 생성
<ol><li>선택8,9의 클로닝 방법을 사용하여, 발현 벡터를 복제하여 Pflp-18 또는 Prig-3 프로모터(복부 신경줄의 AVA 특이적 신호에 대해), 선택의Ca2+ 지표, 그 다음 3' UTR(자세한 내용은 논의 참조)10. 플라스미드 및 그 공급원의 목록은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다.</li>
	...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

설명된 방법을 구현할 때 첫 번째 고려 사항은 주어진 연구 질문에 대해 이상적인 특성을 가진Ca2+ 지표를 선택하는 것입니다. 세포질 Ca2+ 지표는 전형적으로 Ca2+에 대해 높은 친화도를 가지며,Ca2+에 대한 이들 지표의 민감도는 동역학(on/off rate)16,17과 반비례한다. 이는 Ca2+ 감도 또는 동역학이 관심 현상에 따라 우...

칼슘 이온(Ca2+)은 많은 세포 유형에서 매우 다재다능한 정보 전달체입니다. 뉴런에서,Ca2+는 신경전달물질의 활성-의존적 방출, 세포골격 운동성의 조절, 대사 과정의 미세 조정, 그리고 적절한 뉴런 유지와 기능에 필요한 다른 많은 기전을 담당한다 1,2. 효과적인 세포내 신호전달을 보장하기 위해, 뉴런은 세포질에서 낮은 기저 Ca2+ 수준을 유지해야 한다3. 이것은 소포체(ER) 및 미토콘드리아와 같은 세포 기관으로의 Ca2+ 흡수를 포함하는 협력적 Ca2+ 처리 메커니즘에 의해 달성됩니다. 이러한 과정은, 원형질막에서 Ca2+-투과성 이온 채널의 배열에 더하여, 뉴런 전체에 걸쳐 이질적인 수준의 세포질Ca2+를 초래한다.
휴지기 및 뉴런 활성화 동안 Ca2+ 이질성은Ca2+-의존적 메카니즘의 다양한, 위치-특이적조절을 허용한다1. Ca2+의 농도-특이적 효과의 한 예는 이노시톨 1,4,5-삼인산(InsP3) 수용체를 통해 ER로부터Ca2+의 방출이다. InsP3와 조합된 낮은 Ca2+ 수준은 수용체의 칼슘 투과성 기공을 여는 데 필요합니다. 대안적으로, 높은Ca2+ 수준은 수용체4를 직접 및 간접적으로 억제한다. 적절한 뉴런 기능을 위한 Ca2+ 항상성의 중요성은 세포내Ca2+ 처리 및 신호전달의 중단이 신경퇴행성 장애 및 자연노화의 발병기전의 초기 단계임을 시사하는 증거에 의해 뒷받침된다 5,6. 특히, ER 및 미토콘드리아에 의한 비정상적인 Ca2+ 흡수 및 방출은 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병에서 뉴런 기능 장애의 발병과 관련이 있다 6,7.
자연 노화 또는 신경변성 동안 Ca2+ 항상성 이상에 대한 연구는 천연 세포 구조(즉, 시냅스의 배열 및 이온 채널의 분포)가 유지되는 살아 있는 온전한 유기체에서 세포하 분해능을 갖는Ca2+ 수준의 종단적 관찰을 필요로 한다. 이를 위해, 이 프로토콜은 높은 공간 및 시간 분해능으로 생체 내에서 Ca2+ 역학을 기록하기 위해 쉽게 이용가능한, 유전적으로 인코딩된 2개의 Ca2+ 센서의 사용에 대한 지침을 제공한다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 기술된 방법을 사용하여 얻은 대표적인 결과는 단일 뉴런의 세포질 또는 미토콘드리아 기질에서Ca2+ 지표의 발현이 단일 척추 유사 구조 및 개별 미토콘드리아 내에서 Ca2+ 수준을 식별하는 추가 능력과 함께 Ca2+ 역학을 설명하는 형광 이미지(최대 50Hz)의 신속한 획득을 허용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
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subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

칼슘(Ca2+) 이미징은 뉴런 활동을 조사하는 데 주로 사용되어 왔지만, 세포내Ca2+ 처리가 세포내 신호전달의 중요한 구성 요소라는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 생체 내에서 세포 내 Ca2+ 역학의 시각화는 뉴런이 원래의 온전한 회로에서 연구될 수 있으며, 복잡한 신경계에서 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 투명성과 비교적 단순한 신경계는 형광 태그 및 지표의 세포 특이적 발현 및 생체 내 시각화를 가능하게 합니다. 이들 중에는 세포질뿐만 아니라 미토콘드리아와 같은 다양한 세포 내 구획에서 사용하도록 변형 된 형광 지표가 있습니다. 이 프로토콜은 개별 수지상 가시 및 미토콘드리아 수준까지 Ca 2+ 역학을 분석할 수 있는 세포 내 분해능으로 생체 내에서 비비율계량 Ca2+ 이미징을 가능하게 합니다. 여기서, 상이한 Ca2+ 친화도를 갖는 2개의 이용가능한 유전적으로 암호화된 지표가 단일 쌍의 흥분성 중간 뉴런 (AVA)에서 세포질 또는 미토콘드리아 매트릭스 내의 상대적Ca2+ 수준을 측정하기 위한 이 프로토콜의 사용을 입증하기 위해 사용된다. 예쁜꼬마선충에서 가능한 유전자 조작 및 종단 관찰과 함께 이 이미징 프로토콜은 Ca2+ 처리가 신경 기능과 가소성을 조절하는 방법에 관한 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다.

이 두 가지 프로토콜은 높은 공간 분해능으로 생체 내 개별 신경돌기의 세포 내 영역 및 세포 기관 내에서 차등 Ca2+ 수준을 빠르게 획득할 수 있도록 합니다. 첫 번째 프로토콜은 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 세포질Ca2+의 측정을 허용합니다. 이것은 신경돌기가 복부 신경줄의 전체 길이를 달리는 글루타메이트성 AVA 명령 중간 뉴런15에서 GCaMP6f의 세포...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

이 기술은 뉴런의 칼슘 처리에 대한 우리의 이해와 구획화된 칼슘이 생체 내에서 뉴런 기능에 중요한 다양한 메커니즘을 조절할 수 있는 방법을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 형광 도구와 결합할 수 있는 예쁜꼬마선충의 생리학적 조건에서 더 높은 해상도의 빠른 생체 내 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 기술은 다양한 맥락에서 뉴런의 칼슘 신호 전달을 조절하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.예를 들어, 노화, 신경 손상 및 신경 퇴행 중. 이 절차를 시연하는 것은 연구 기술자인 Ennis Deihl이 될 것입니다. Kaz Knight, PhD 후보자, Rachel Doser, 내 연구실의 박사후 연구원.프로모터, 칼슘 지표 및 선택된 3개의 프라임 UTR을 포함하는 발현 벡터를 클로닝하는 것으로 시작합니다. 칼슘 지표 이식유전자에 구조 DNA Lin-15 plus를 포함하는 DNA 혼합물을 생후 1일 된 성인 C.elegans의 생식선에 미세주입하여 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만듭니다. F1 자손이 성체가 될 때까지 주입된 부모 벌레를 섭씨 20도로 유지하십시오.다중 외음부 표현형의 부재를 스크리닝하여 형질전환 성인을 선택합니다. 이는 칼슘 지시약을 포함하는 여분의 염색체 배열의 발현을 나타낸다. 다외음부 표현형을 갖지 않는 클론 계대 성인 F1 자손.칼슘 지표의 최적 발현으로 형질전환 균주의 후속 세대에 대한 실험을 수행합니다. 장기간 타임랩스 이미징이 가능한 현미경을 사용하십시오. 저배율 대물렌즈 아래에서 웜을 찾은 다음 고배율 대물렌즈로 전환하여 뉴런의 위치를 파악합니다.50FPS 이상의 빠른 이미지 획득이 가능한 초고감도 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다. 다음으로 칼슘 표시기에 표준 배출 필터를 사용하십시오. 10초보다 긴 이미지 스트림을 획득하기 위해 Z-드리프트 보정기를 추가합니다.13 x 100mm 유리 배양 튜브에서 분자 등급 한천을 M9에 용해시켜 10% 한천 3밀리리터를 준비하고 전자레인지에 몇 초 동안 돌립니다. 한천 패드를 만들려면 먼저 두 겹의 실험실 테이프를 추가하여 두 개의 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 두 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다.1000마이크로리터 피펫 팁의 끝을 자르고 이를 사용하여 커버 슬립 중앙에 작은 한천 방울을 피펫팅합니다. 한천 위에 다른 슬라이드를 눌러 한천을 평평하게 합니다. 냉각 후, 10 밀리리터 튜브의 개구부를 사용하여 한천을 작은 디스크로 자른 다음 주위의 한천을 제거하십시오.다음으로, muscimol 분말을 M9에 용해시켜 웜 롤링 용액을 준비하여 30 밀리몰 스톡을 만듭니다. 스톡을 폴리스티렌 비드로 일대일 비율로 희석하여 압연 용액을 만듭니다. 이미징을 위해 웜을 배치하려면 먼저 1.6마이크로리터의 롤링 용액을 한천 패드 중앙에 놓습니다.그런 다음 선호하는 웜 픽을 사용하여 원하는 나이의 웜을 한천 패드의 롤링 용액으로 옮깁니다. muscimol이 웜 움직임을 줄일 때까지 약 5분 동안 기다린 다음 한천 패드 위에 22 x 22mm 커버 슬립을 떨어뜨립니다. 복부 신경줄의 신경돌기를 영상화하려면 커버 슬립을 살짝 밀어 벌레를 굴립니다.현미경에 웜을 장착하려면 커버 슬립에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 명시야에서 저배율 대물렌즈를 사용하여 웜을 찾습니다. 그런 다음 100x 대물렌즈로 전환하고 488나노미터 이미징 레이저로 GCaMP 또는 mito GCaMP의 조명을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾습니다.생체 내 GCaMP 이미징의 경우 바질 GCaMP 형광이 카메라 다이내믹 레인지의 중간 범위에 있을 때까지 획득 설정에서 이미징 레이저를 조정하고 노출 시간을 20밀리초로 설정합니다. 100배 배율에서 GCaMP 형광을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾은 후 Z-드리프트 교정기를 설정하고 연속 자동 초점을 시작합니다. 이미징하기 전에 필요에 따라 초점면을 수동으로 수정하십시오.100배 배율로 이미지 스트림을 획득합니다. 이 프로토콜을 사용하여 세포질 칼슘을 높은 시간 및 공간 분해능으로 측정했습니다. 글루타메이트성 AVA 명령 중간 뉴런에서 GCaMP6F의 세포 특이적 발현은 칼슘 유입의 방향성 전파를 밝혀냈습니다.GCaMP6F 형광의 세포 내 정량화는 칼슘 유입의 시작이 불과 10마이크로미터 떨어진 신경돌기의 일부에서 지연된다는 것을 보여주었습니다. 또한, AVA 신경돌기를 따라 발견된 수지상 척추 유사 구조는 신경돌기 활성화와 독립적으로 발생하고 칼슘 유입의 전파로 이어지지 않는 GCaMP6F 형광에서 섬광을 보였습니다. 또한, 상대적 칼슘 수준은 미토콘드리아 기질의 AVA 특이적 발현을 갖는 웜 균주를 사용하여 단일 신경돌기에서 개별 미토콘드리아에서 미토콘드리아 칼슘 지표 GCaMP를 측정하였다.결과는 상대적으로 많은 양의 칼슘이 미토콘드리아의 하위 집합으로 동시에 흡수되는 것을 보여주었습니다. 특히, 일부 미토콘드리아로의 칼슘 흡수는 동기화된 반면, 인접한 미토콘드리아는 칼슘을 흡수하지 않는 것으로 나타났습니다. 유사하게, 미토콘드리아의 하위 집합은 소량의 칼슘의 빠른 흡수와 방출을 보여주었습니다.이것은 또한 동기적인 것으로 보였지만 미토콘드리아의 하위 집합에 대해서만 나타났습니다. 속도와 미세한 조작은 동물의 위치를 지정하고 신경 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 동물의 건강도 가장 중요합니다.조금이라도 굶주림이 문제가됩니다. 가장 배우기 어려운 부분은 손상 없이 컨포칼 현미경 검사를 위한 동물의 빠른 방향입니다. 내 조언은 많은 연습과 좋은 컨트롤입니다.이 프로토콜은 칼슘이 뉴런, 다른 뉴런 또는 예쁜꼬마선충의 뉴런 이외의 다른 세포 내 위치에서 방출되는 실험에 적용될 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 이러한 접근 방식은 동물을 온전하게 남겨두기 때문에 완전한 신경계의 단일 뉴런에서 생체 내 세포내 칼슘 처리 조절에 대한 질문을 해결할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

연구

신경과학

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...