Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tildelt F. Hoerndli). Vi vil også takke Dr. Attila Stetak for pAS1-plasmidet.

1. Opprette transgene stammer
<ol><li>Ved hjelp av en valgfri metode 8,9, klon ekspresjonsvektorer for å inneholde Pflp-18 eller Prig-3 promotoren (for AVA-spesifikt signal i ventral nervestreng), etterfulgt av Ca2+ indikator for valg, og deretter en 3' UTR (se diskusjonen for mer informasjon)10. En liste over plasmider og deres kilder finnes i tilleggstabell 1.</li>
	<li>F?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

Den første vurderingen ved implementering av metoden som er beskrevet, innebærer valg av en Ca2+ indikator med ideelle egenskaper for det gitte forskningsspørsmålet. Cytoplasmatiske Ca 2+-indikatorer har vanligvis høy affinitet for Ca 2+, og sensitiviteten til disse indikatorene til Ca 2+ er omvendt relatert til kinetikken (på/av-hastighet)16,17. Dette betyr at enten Ca2+ følsomhet eller kinetikk må p...

Kalsiumioner (Ca2+) er svært allsidige bærere av informasjon i mange celletyper. I nevroner er Ca2+ ansvarlig for aktivitetsavhengig frigjøring av nevrotransmittere, regulering av cytoskeletal motilitet, finjustering av metabolske prosesser, samt mange andre mekanismer som kreves for riktig nevronvedlikehold og funksjon 1,2. For å sikre effektiv intracellulær signalering må nevroner opprettholde lave basale Ca2+ nivåer i deres cytoplasma3. Dette oppnås ved kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, inkludert opptak av Ca2+ i organeller som endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse prosessene, i tillegg til arrangementet av Ca 2+-permeable ionekanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene nivåer av cytoplasmatisk Ca2+ gjennom nevronet.
Ca 2+ heterogenitet under hvile og nevronaktivering muliggjør mangfoldig, stedsspesifikk regulering av Ca2+-avhengige mekanismer1. Et eksempel på de konsentrasjonsspesifikke effektene av Ca 2 + er frigjøring av Ca2 + fra ER gjennom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) reseptorer. Lave Ca2+ nivåer i kombinasjon med InsP3 er nødvendig for åpning av reseptorens kalsiumgjennomtrengelige pore. Alternativt hemmer høye Ca2+ nivåer både direkte og indirekte reseptoren4. Betydningen av Ca 2+ homeostase for riktig nevronfunksjon støttes av bevis som tyder på at forstyrret intracellulær Ca2+ håndtering og signalering er et tidlig skritt i patogenesen av nevrodegenerative lidelser og naturlig aldring 5,6. Spesielt er unormalt Ca2+ opptak og frigjøring av ER og mitokondrier knyttet til utbruddet av nevronal dysfunksjon i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntingtons sykdom 6,7.
Studien av Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller nevrodegenerasjon krever langsgående observasjon av Ca2+ nivåer med subcellulær oppløsning i en levende, intakt organisme der den opprinnelige cellulære arkitekturen (dvs. arrangementet av synapser og distribusjon av ionkanaler) opprettholdes. For dette formål gir denne protokollen veiledning om bruk av to lett tilgjengelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer for registrering av Ca2+ dynamikk in vivo med høy romlig og tidsmessig oppløsning. De representative resultatene som er oppnådd ved hjelp av den beskrevne metoden i C. elegans, demonstrerer hvordan ekspresjonen av Ca2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriell matrise av enkeltneuroner kan tillate rask oppkjøp av fluorescerende bilder (opptil 50 Hz) som illustrerer Ca 2 + dynamikken med den ekstra evnen til å skille Ca2 + nivåer innenfor enkelte ryggradslignende strukturer og individuelle mitokondrier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Avbildning av kalsium (Ca 2+) har i stor grad blitt brukt til å undersøke nevronaktivitet, men det blir stadig tydeligere at subcellulær Ca2+-håndtering er en avgjørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen av subcellulær Ca2+ dynamikk in vivo, hvor nevroner kan studeres i deres innfødte, intakte kretser, har vist seg teknisk utfordrende i komplekse nervesystemer. Gjennomsiktigheten og det relativt enkle nervesystemet til nematoden Caenorhabditis elegans muliggjør cellespesifikt uttrykk og in vivo visualisering av fluorescerende koder og indikatorer. Blant disse er fluorescerende indikatorer som er modifisert for bruk i cytoplasma, samt forskjellige subcellulære rom, som mitokondriene. Denne protokollen muliggjør ikke-ratiometrisk Ca 2+-avbildning in vivo med en subcellulær oppløsning som tillater analyse av Ca2+-dynamikk ned til nivået av individuelle dendrittiske pigger og mitokondrier. Her brukes to tilgjengelige genetisk kodede indikatorer med forskjellige Ca 2+ affiniteter for å demonstrere bruken av denne protokollen for å måle relative Ca2+ nivåer i cytoplasma eller mitokondriematrisen i et enkelt par eksitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulasjonene og longitudinelle observasjonene som er mulige i C. elegans, kan denne bildeprotokollen være nyttig for å svare på spørsmål om hvordan Ca2+ -håndtering regulerer nevronfunksjon og plastisitet.

Disse to protokollene muliggjør rask oppkjøp av differensial Ca2+ nivåer innenfor de subcellulære områdene og organeller av individuelle neuritter in vivo med høy romlig oppløsning. Den første protokollen tillater måling av cytoplasmatisk Ca2+ med høy temporal og romlig oppløsning. Dette demonstreres her ved å bruke det cellespesifikke uttrykket av GCaMP6f i de glutamatergiske AVA-kommandointernevronene15, hvis nevritter løper hele lengden av den ventral...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

De nåværende metodene beskriver en ikke-ratiometrisk tilnærming for høyoppløselig, subkompartmental kalsiumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans ved bruk av lett tilgjengelige genetisk kodede kalsiumindikatorer.

Subcellulær avbildning av nevronal kalsiumhåndtering in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Denne teknikken kan brukes til å fremme vår forståelse av kalsiumhåndtering i nevroner, og hvordan oppdelt kalsium kan regulere forskjellige mekanismer som er viktige for nevronfunksjon in vivo. Den største fordelen med denne teknikken er at den muliggjør rask in vivo-avbildning med høyere oppløsning under fysiologiske forhold i C.elegans som kan kombineres med andre fluorescerende verktøy. Denne teknikken kan gi innsikt i mekanismer som regulerer kalsiumsignalering i nevroner i mange forskjellige sammenhenger.For eksempel, under aldring, nevronskade og nevrodegenerasjon. Demonstrere denne prosedyren vil være Ennis Deihl, forskningstekniker. Kaz Knight, doktorgradskandidat, og Rachel Doser, en postdoktoralforsker fra laboratoriet mitt.Begynn med kloning av ekspresjonsvektorer som inneholder en promotor etterfulgt av en kalsiumindikator, og tre primære UTR av valg. Lag transgene C.elegans-stammer ved mikroinjeksjon av en DNA-blanding som inneholder rednings-DNA Lin-15 pluss i kalsiumindikatortransgenet inn i gonaden til en en dag gammel voksen C.elegans. Oppretthold de injiserte foreldremaskene ved 20 grader Celsius til F1-avkommet når voksen alder.Velg transgene voksne ved screening for fravær av multivulva-fenotypen. Det indikerer uttrykk for den ekstra kromosomale matrisen som inneholder kalsiumindikatoren. Klonalt passasje voksen F1 avkom som ikke har multi-vulva fenotype.Utfør eksperimenter på etterfølgende generasjoner av de transgene stammene med et optimalt uttrykk for kalsiumindikatoren. Bruk et mikroskop som er i stand til langsiktig Time-lapse-avbildning. Finn ormen under et mål med lav forstørrelse, og bytt deretter til et mål med høy forstørrelse for å lokalisere nevronene.Skaff bildene ved hjelp av et ultrafølsomt kamera som er i stand til rask bildeinnsamling med mer enn 50 FPS. Deretter bruker du et standard utslippsfilter for kalsiumindikatoren. Legg til en Z-drift corrector for opptak av bildestrømmer lengre enn 10 sekunder.I et 13-til-100-millimeter glasskulturrør forberede tre milliliter 10%agar ved å oppløse molekylær klasse agar i M9 og mikrobølgeovn i flere sekunder. For å lage agarputene, må du først forberede to lysbilder ved å legge til to lag laboratorietape. Legg deretter et mikroskoplysbilde mellom de to lysbildene.Klipp spissen på en 1000 mikroliters pipettespiss og bruk den til å pipette en liten dråpe agar på midten av dekselet. Flat agaren ved å trykke en annen lysbilde ned på toppen av agar. Etter avkjøling, kutt agar i en liten plate ved hjelp av åpningen av et 10 milliliter rør, og fjern deretter den omkringliggende agar.Forbered deretter ormrullingsløsningen ved å oppløse muscimolpulver i M9 for å lage en 30 millimolar lager. Fortynn lageret i et en-til-ett-forhold med polystyrenperler for å lage rulleløsningen. For å plassere ormen for avbildning, plasser først 1,6 mikroliter av rulleløsningen på midten av agarputen.Bruk deretter en foretrukket ormehakke, overfør en orm av ønsket alder til rulleløsningen på agarputen. Vent i omtrent fem minutter for muscimolen for å redusere ormbevegelsen, og slipp deretter en 22 x 22 millimeter dekselslipp på toppen av agarputen. For avbildning nevritter i ventral nerveledning, rull ormen ved å skyve dekselet litt.For å montere ormen på mikroskopet, legg en dråpe nedsenkningsolje på dekselet. Finn ormen ved hjelp av et mål med lav forstørrelse i lysfelt. Bytt deretter til 100x objektiv og finn AVA-nevitten ved hjelp av belysningen av GCaMP eller mito GCaMP med 488-nanometer bildelaser.For in vivo GCaMP-avbildning, juster bildelaseren i innsamlingsinnstillinger til basilikum GCaMP-fluorescensen er i midten av kameraets dynamiske område og sett eksponeringstiden til 20 millisekunder. Etter at AVA-nevritten er lokalisert ved hjelp av GCaMP-fluorescensen ved 100 ganger forstørrelse, still inn Z-drift-korrigereren og start kontinuerlig autofokusering. Korriger fokalplanet manuelt etter behov før avbildning.Skaff deg en strøm av bilder ved 100 ganger forstørrelse. Ved hjelp av denne protokollen ble cytoplasmatisk kalsium målt med høy temporal og romlig oppløsning. Det cellespesifikke uttrykket av GCaMP6F i glutamatergiske AVA-kommandointernevroner avslørte en retningsforplantning av kalsiuminnstrømning.Den subcellulære kvantifiseringen av GCaMP6F-fluorescens viste at utbruddet av kalsiuminnstrømning ble forsinket i en del av nevitten som ligger bare 10 mikrometer unna. Dendritiske ryggradslignende strukturer funnet langs AVA-nevitten viste også blinker i GCaMP6F-fluorescens som oppstod uavhengig av nevrittaktivering og ikke førte til forplantning av kalsiuminnstrømning. Videre ble de relative kalsiumnivåene målt i de enkelte mitokondriene i enkeltnevritter ved bruk av en ormstamme med et AVA-spesifikt uttrykk for mitokondriematriksen lokalisert kalsiumindikator mito GCaMP.Resultatene viste synkront opptak av en relativt stor mengde kalsium i en undergruppe av mitokondrier. Spesielt var kalsiumopptaket i noen mitokondrier synkronisert, mens nærliggende mitokondrier ikke så ut til å ta opp kalsium. Tilsvarende viste undergrupper av mitokondrier raskt opptak og frigjøring av små mengder kalsium.Dette syntes også å være synkront, men bare for en undergruppe av mitokondrier. Hastighet og fine manipulasjoner er avgjørende for å posisjonere dyr og beholde nevronfunksjonen. Dyrehelse er også viktigst.Selv litt sult er problematisk. Den vanskeligste delen å lære er den raske orienteringen av dyrene for konfokal mikroskopi uten skade. Mitt råd er mye øvelse og gode kontroller.Denne protokollen kan brukes på eksperimenter der kalsium frigjøres fra andre subcellulære steder i nevroner, andre nevroner eller andre celler enn nevroner i C.elegans. Fordi denne tilnærmingen i C.elegans etterlater dyr intakte, er det mulig å ta opp spørsmål om regulering av subcellulær kalsiumhåndtering in vivo i enkeltnevroner i et komplett nervesystem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-oppløsning Imaging nevrale Dense-core Blemmer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo avbildning av Dauer-spesifikke nevronale ombygging i C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Langvarig Inkubasjon av akutt nervevev for Elektro og kalsium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalsium bildebehandling av Lateral linje hårcellene i larver sebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Optical kalsium Imaging av Learning-indusert Synaptic plastisitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...