Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 concedido a F. Hoerndli). Agradecemos também ao Dr. Attila Stetak pelo plasmídeo pAS1.

1. Criação de cepas transgênicas
<ol><li>Usando um método de clonagem de escolha8,9, clone vetores de expressão para conter o promotor Pflp-18 ou Prig-3 (para sinal AVA-específico no cordão nervoso ventral), seguido pelo indicador de escolha Ca2+ e, em seguida, um UTR 3' (veja a discussão para obter mais informações)10. Uma lista de plasmídeos e suas fontes pode ser encontrada na <...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. 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E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

A primeira consideração ao implementar o método descrito envolve a seleção de um indicador Ca2+ com características ideais para a pergunta de pesquisa dada. Os indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ tipicamente têm alta afinidade por Ca 2+, e a sensibilidade desses indicadores ao Ca2+ está inversamente relacionada à cinética (taxa liga/desliga)16,17. Isso significa que a sensibilidade ou a cinética do Ca2...

Os íons cálcio (Ca2+) são carreadores de informação altamente versáteis em muitos tipos celulares. Nos neurônios, o Ca2+ é responsável pela liberação de neurotransmissores atividade-dependente, pela regulação da motilidade citoesquelética, pelo ajuste fino dos processos metabólicos, bem como por muitos outros mecanismos necessários para a adequada manutenção e função neuronal 1,2. Para garantir uma sinalização intracelular eficaz, os neurônios devem manter baixos níveis basais de Ca2+ em seu citoplasma3. Isso é realizado por mecanismos cooperativos de manipulação de Ca 2+, incluindo a captação de Ca2+ em organelas como o retículo endoplasmático (RE) e mitocôndrias. Esses processos, além do arranjo de canais iônicos permeáveis ao Ca 2+ na membrana plasmática, resultam em níveis heterogêneos de Ca2+ citoplasmático em todo o neurônio.
A heterogeneidade do Ca 2+ durante o repouso e a ativação neuronal permitem a regulação diversa e local-específica dos mecanismos dependentes do Ca 2+ 1. Um exemplo dos efeitos concentração-específicos do Ca 2+ é a liberação de Ca 2+ do RE através dos receptores inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP 3). Baixos níveis de Ca2+ em combinação com InsP3 são necessários para a abertura do poro permeável ao cálcio do receptor. Alternativamente, altos níveis de Ca2+ inibem direta e indiretamente o receptor4. A importância da homeostase do Ca 2+ para a função neuronal adequada é apoiada por evidências que sugerem que a interrupção da manipulação e sinalização intracelular do Ca2+ é um passo precoce na patogênese de doenças neurodegenerativas e envelhecimento natural 5,6. Especificamente, a captação e liberação anormais de Ca2+ pelo PS e mitocôndrias estão ligadas ao aparecimento de disfunção neuronal na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington 6,7.
O estudo da dishomeostase de Ca 2+ durante o envelhecimento natural ou neurodegeneração requer a observação longitudinal dos níveis de Ca2+ com resolução subcelular em um organismo vivo e intacto, no qual a arquitetura celular nativa (isto é, o arranjo de sinapses e distribuição de canais iônicos) é mantida. Para este fim, este protocolo fornece orientação sobre o uso de dois sensores Ca2+ codificados geneticamente prontamente disponíveis para registro da dinâmica de Ca2+ in vivo com alta resolução espacial e temporal. Os resultados representativos obtidos usando o método descrito em C. elegans demonstram como a expressão de indicadores de Ca 2+ no citoplasma ou na matriz mitocondrial de neurônios individuais pode permitir a aquisição rápida de imagens fluorescentes (até 50 Hz) que ilustram a dinâmica do Ca 2+ com a capacidade adicional de discernir os níveis de Ca 2+ dentro de estruturas semelhantes à coluna vertebral e mitocôndrias individuais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

A imagem com cálcio (Ca 2+) tem sido amplamente utilizada para examinar a atividade neuronal, mas está ficando cada vez mais claro que a manipulação subcelular de Ca2+ é um componente crucial da sinalização intracelular. A visualização da dinâmica subcelular de Ca2+ in vivo, onde os neurônios podem ser estudados em seus circuitos nativos e intactos, tem se mostrado tecnicamente desafiadora em sistemas nervosos complexos. A transparência e o sistema nervoso relativamente simples do nematoide Caenorhabditis elegans permitem a expressão célula-específica e a visualização in vivo de marcadores e marcadores fluorescentes. Entre eles estão indicadores fluorescentes que foram modificados para uso no citoplasma, bem como em vários compartimentos subcelulares, como as mitocôndrias. Este protocolo permite a obtenção de imagens não ratiométricas de Ca 2+ in vivo com uma resolução subcelular que permite a análise da dinâmica de Ca2+ até o nível de espinhas dendríticas individuais e mitocôndrias. Aqui, dois indicadores geneticamente codificados disponíveis com diferentes afinidades de Ca 2+ são usados para demonstrar o uso deste protocolo para medir os níveis relativos de Ca2+ dentro do citoplasma ou matriz mitocondrial em um único par de interneurônios excitatórios (AVA). Juntamente com as manipulações genéticas e observações longitudinais possíveis em C. elegans, este protocolo de imagem pode ser útil para responder a perguntas sobre como o manuseio de Ca2+ regula a função neuronal e a plasticidade.

Estes dois protocolos permitem a rápida aquisição de níveis diferenciais de Ca2+ dentro das regiões subcelulares e organelas de neuritos individuais in vivo com alta resolução espacial. O primeiro protocolo permite a dosagem citoplasmática de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial. Isso é demonstrado aqui usando a expressão célula-específica de GCaMP6f nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA15, cujos neuritos percorrem toda a extensão d...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Esta técnica pode ser usada para avançar nossa compreensão da manipulação de cálcio em neurônios, e como o cálcio compartimentalizado pode regular diferentes mecanismos importantes para a função neuronal in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite imagens in vivo rápidas de maior resolução em condições fisiológicas em C.elegans que podem ser combinadas com outras ferramentas fluorescentes. Esta técnica poderia fornecer informações sobre o mecanismo de regulação da sinalização de cálcio em neurônios em muitos contextos diferentes.Por exemplo, durante o envelhecimento, lesão neuronal e neurodegeneração. Quem demonstrará esse procedimento será Ennis Deihl, técnico de pesquisa. Kaz Knight, doutorando, e Rachel Doser, pesquisadora de pós-doutorado do meu laboratório.Comece clonando vetores de expressão que contêm um promotor seguido por um indicador de cálcio e três UTR principais de escolha. Criar cepas transgênicas de C.elegans por microinjeção de uma mistura de DNA contendo o DNA de resgate Lin-15 plus no transgene indicador de cálcio na gônada de um dia de idade adulta C.elegans. Manter os vermes pais injetados a 20 graus Celsius até que a progênie F1 atinja a idade adulta.Selecionar adultos transgênicos por meio da triagem para a ausência do fenótipo multivulva. Isso indica a expressão do arranjo cromossômico extra que contém o indicador de cálcio. Clonalmente passam progênie F1 adulta que não possui o fenótipo multivulva.Realizar experimentos em gerações subsequentes das cepas transgênicas com uma expressão ótima do indicador de cálcio. Use um microscópio capaz de imagens de lapso de tempo de longo prazo. Localize o verme sob uma objetiva de baixa ampliação e, em seguida, mude para uma objetiva de alta ampliação para localizar os neurônios.Adquira as imagens usando uma câmera ultrassensível capaz de aquisição rápida de imagens a mais de 50 FPS. Em seguida, use um filtro de emissão padrão para o indicador de cálcio. Adicione um corretor Z-drift para a aquisição de fluxos de imagem com mais de 10 segundos.Em um tubo de cultura de vidro de 13 por 100 milímetros, prepare três mililitros de ágar 10% dissolvendo ágar de grau molecular em M9 e micro-ondas por vários segundos. Para fazer as almofadas de ágar, primeiro, prepare duas lâminas adicionando duas camadas de fita de laboratório. Em seguida, coloque uma lâmina de microscópio entre as duas lâminas.Corte a ponta de uma pipeta de 1000 microlitros e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar no centro da tampa. Achate o ágar pressionando outro slide para baixo em cima do ágar. Após o resfriamento, corte o ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de 10 mililitros e, em seguida, remova o ágar circundante.Em seguida, prepare a solução de laminação de vermes dissolvendo o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 milimolares. Diluir o estoque em uma proporção de um para um com esferas de poliestireno para fazer a solução de laminação. Para posicionar o verme para obtenção de imagens, primeiro, coloque 1,6 microlitros da solução rolante no centro da almofada de ágar.Em seguida, usando uma picareta de minhoca preferida, transfira um verme da idade desejada para a solução de rolamento na almofada de ágar. Aguarde cerca de cinco minutos para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma tampa de 22 por 22 milímetros em cima da almofada de ágar. Para obter imagens de neuritos no cordão nervoso ventral, enrole o verme deslizando levemente a tampa.Para montar o verme no microscópio, coloque uma gota de óleo de imersão sobre a tampa. Encontre o worm usando uma objetiva de baixa ampliação no campo brilhante. Em seguida, mude para a objetiva de 100x e localize o neurito AVA usando a iluminação do GCaMP ou mito GCaMP com o laser de imagem de 488 nanômetros.Para imagens GCaMP in vivo, ajuste o laser de imagem nas configurações de aquisição até que a fluorescência GCaMP do manjericão esteja na faixa média da faixa dinâmica da câmera e defina o tempo de exposição para 20 milissegundos. Depois que o neurito AVA for localizado usando a fluorescência GCaMP em 100 vezes a ampliação, defina o corretor Z-drift e inicie o foco automático contínuo. Corrija manualmente o plano focal conforme necessário antes da geração de imagens.Adquira um fluxo de imagens com 100 vezes de ampliação. Usando este protocolo, o cálcio citoplasmático foi medido com alta resolução temporal e espacial. A expressão celular específica de GCaMP6F nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA revelou uma propagação direcional do influxo de cálcio.A quantificação subcelular da fluorescência GCaMP6F mostrou que o início do influxo de cálcio foi retardado em uma porção do neurito localizada a apenas 10 micrômetros de distância. Além disso, estruturas dendríticas semelhantes à coluna vertebral encontradas ao longo do neurito AVA mostraram flashes na fluorescência GCaMP6F que ocorreram independentemente da ativação do neurito e não levaram à propagação do influxo de cálcio. Além disso, os níveis relativos de cálcio foram medidos nas mitocôndrias individuais em neuritos únicos usando uma cepa de verme com uma expressão específica de AVA do indicador de cálcio localizado da matriz mitocondrial mito GCaMP.Os resultados mostraram a captação sincrônica de uma quantidade relativamente grande de cálcio em um subgrupo de mitocôndrias. Especificamente, a captação de cálcio em algumas mitocôndrias foi sincronizada, enquanto as mitocôndrias vizinhas não pareceram absorver cálcio. Da mesma forma, subgrupos de mitocôndrias mostraram rápida captação e liberação de pequenas quantidades de cálcio.Isso também parecia ser sincrônico, mas apenas para um subconjunto de mitocôndrias. A velocidade e as manipulações finas são essenciais para posicionar os animais e manter a função neuronal. A saúde animal também é primordial.Mesmo um pouco de fome é problemático. A parte mais difícil de aprender é a rápida orientação dos animais para microscopia confocal sem danos. Meu conselho é muita prática e bons controles.Este protocolo poderia ser aplicado a experimentos onde o cálcio é liberado de outros locais subcelulares em neurônios, outros neurônios ou células que não sejam neurônios em C.elegans. Como esta abordagem em C.elegans deixa os animais intactos, é possível abordar questões sobre a regulação da manipulação subcelular de cálcio in vivo em neurônios únicos de um sistema nervoso completo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociência

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...