Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) (R01-NS115947 присуждена Ф. Хорндли). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Аттилу Стетака за плазмиду pAS1.

1. Создание трансгенных штаммов
<ol><li>Используя метод клонированияпо выбору 8,9, клонируйте векторы экспрессии, чтобы они содержали промотор Pflp-18 или Prig-3 (для AVA-специфического сигнала в вентральном нервном мозге), затем индикатор выбора Ca2+</...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

Первое соображение при реализации описанного метода связано с выбором показателя Ca2+ с идеальными характеристиками для данного вопроса исследования. Цитоплазматические показатели Ca2+ обычно имеют высокое сродство к Ca2+, а чувствительность этих показателей кCa2+ обратн?...

Ионы кальция (Ca2+) являются универсальными носителями информации во многих типах клеток. В нейронах Ca2+ отвечает за зависящее от активности высвобождение нейротрансмиттеров, регуляцию подвижности цитоскелета, тонкую настройку метаболических процессов, а также за многие другие механизмы, необходимые для правильного поддержания и функционирования нейронов 1,2. Чтобы обеспечить эффективную внутриклеточную передачу сигналов, нейроны должны поддерживать низкий базальный уровень Ca2+ в своей цитоплазме3. Это достигается совместными механизмами обработки Ca2+, включая поглощение Ca2+ органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии. Эти процессы, в дополнение к расположению Ca 2+-проницаемых ионных каналов в плазматической мембране, приводят к гетерогенным уровням цитоплазматического Ca2+ по всему нейрону.
ГетерогенностьCa2+ во время покоя и активации нейронов обеспечивает разнообразную, специфическую для местоположения регуляцию Ca2+-зависимых механизмов1. Одним из примеров специфических для концентрации эффектов Ca 2+ является высвобождение Ca 2+ из ER через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP 3). Низкие уровни Ca2+ в сочетании с InsP3 необходимы для открытия кальций-проницаемой поры рецептора. В качестве альтернативы, высокие уровни Ca2+ как прямо, так и косвенно ингибируют рецептор4. Важность гомеостаза Ca 2+ для правильной функции нейронов подтверждается данными, свидетельствующими о том, что нарушение внутриклеточной обработки и передачи сигналов Ca2+ является ранним шагом в патогенезе нейродегенеративных расстройств и естественного старения 5,6. В частности, аномальное поглощение и высвобождение Ca2+ скорой помощью и митохондриями связано с началом дисфункции нейронов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона 6,7.
Изучение дисгомеостаза Са 2+ при естественном старении или нейродегенерации требует продольного наблюдения уровней Са2+ с субклеточным разрешением в живом, интактном организме, в котором поддерживается нативная клеточная архитектура (т. е. расположение синапсов и распределение ионных каналов). С этой целью этот протокол содержит рекомендации по использованию двух легкодоступных, генетически закодированных датчиков Ca 2+ для записи динамики Ca2+ in vivo с высоким пространственным и временным разрешением. Репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода у C. elegans, демонстрируют, как экспрессия показателей Ca 2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе отдельных нейронов может позволить быстро получать флуоресцентные изображения (до 50 Гц), которые иллюстрируют динамику Ca 2+ с дополнительной способностью различать уровни Ca 2+ в отдельных позвоночных структурах и отдельных митохондриях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Визуализация кальция (Ca2+) в основном используется для изучения активности нейронов, но становится все более очевидным, что субклеточная обработка Ca2+ является важнейшим компонентом внутриклеточной передачи сигналов. Визуализация субклеточной динамики Ca2+ in vivo, где нейроны могут быть изучены в их нативной, интактной схеме, оказалась технически сложной в сложных нервных системах. Прозрачность и относительно простая нервная система нематоды Caenorhabditis elegans обеспечивают клеточно-специфическую экспрессию и визуализацию in vivo флуоресцентных меток и индикаторов. Среди них флуоресцентные индикаторы, которые были модифицированы для использования в цитоплазме, а также в различных субклеточных компартментах, таких как митохондрии. Этот протокол позволяет проводить нератиометрическую визуализациюCa2 + in vivo с субклеточным разрешением, что позволяет анализировать динамику Ca2+ вплоть до уровня отдельных дендритных шипов и митохондрий. Здесь используются два доступных генетически кодируемых индикатора с разным сродством кCa2 +, чтобы продемонстрировать использование этого протокола для измерения относительных уровней Ca2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе в одной паре возбуждающих интернейронов (AVA). Вместе с генетическими манипуляциями и продольными наблюдениями, возможными у C. elegans, этот протокол визуализации может быть полезен для ответа на вопросы о том, как обработка Ca2+ регулирует функцию и пластичность нейронов.

Эти два протокола позволяют быстро получать дифференциальные уровни Ca2+ в субклеточных областях и органеллах отдельных нейритов in vivo с высоким пространственным разрешением. Первый протокол позволяет измерять цитоплазматический Ca2+ с высоким временным и пространствен...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Современные методы описывают нератиометрический подход к субкомпартментной визуализации кальция с высоким разрешением in vivo у Caenorhabditis elegans с использованием легкодоступных генетически кодируемых индикаторов кальция.

Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Этот метод может быть использован для углубления нашего понимания обработки кальция в нейронах и того, как компартментализированный кальций может регулировать различные механизмы, важные для функции нейронов in vivo. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получать более высокую разрешающую быструю визуализацию in vivo в физиологических условиях у C.elegans, которые можно комбинировать с другими флуоресцентными инструментами. Этот метод может дать представление о механизме, регулирующем передачу сигналов кальция в нейронах во многих различных контекстах.Например, при старении, повреждении нейронов и нейродегенерации. Эту процедуру продемонстрирует Эннис Дейл, техник-исследователь. Каз Найт, кандидат наук, и Рэйчел Досер, научный сотрудник моей лаборатории.Начните с клонирования векторов экспрессии, которые содержат промотор, за которым следует индикатор кальция и три основных UTR по выбору. Создание трансгенных штаммов C.elegans путем микроинъекции смеси ДНК, содержащей спасательную ДНК Lin-15 plus в трансгене индикатора кальция, в гонаду однодневного взрослого C.elegans. Поддерживайте введенных родительских червей при температуре 20 градусов по Цельсию до тех пор, пока потомство F1 не достигнет совершеннолетия.Выберите трансгенных взрослых путем скрининга на отсутствие фенотипа мультивульвы. Это указывает на экспрессию дополнительного хромосомного массива, содержащего кальциевый индикатор. Клональное прохождение взрослого потомства F1, не имеющего фенотипа мультивульвы.Проведение экспериментов на последующих поколениях трансгенных штаммов с оптимальной экспрессией кальциевого показателя. Используйте микроскоп, способный к длительной покадровой съемке. Найдите червя под объективом с малым увеличением, а затем переключитесь на объектив с большим увеличением, чтобы локализовать нейроны.Получайте изображения с помощью сверхчувствительной камеры, способной быстро получать изображения со скоростью более 50 кадров в секунду. Далее используйте стандартный эмиссионный фильтр для индикатора кальция. Добавьте корректор Z-дрейфа для получения потоков изображений продолжительностью более 10 секунд.В стеклянной пробирке размером 13 на 100 миллиметров приготовьте три миллилитра 10%-ного агара, растворив молекулярный агар в M9, и разогрейте в микроволновой печи в течение нескольких секунд. Чтобы сделать агаровые подушечки, сначала подготовьте два предметных стекла, добавив два слоя лабораторной ленты. Затем поместите предметное стекло микроскопа между двумя предметными стеклами.Отрежьте наконечник наконечника пипетки объемом 1000 микролитров и используйте его, чтобы нанести небольшую каплю агара на центр покровного стекла. Расплющите агар, нажав еще один слайд вниз поверх агара. После остывания разрежьте агар на небольшой диск, используя отверстие 10-миллилитровой пробирки, а затем удалите окружающий агар.Затем приготовьте раствор для червячного проката, растворив порошок мусцимола в M9, чтобы создать 30-миллимолярный запас. Разбавьте бульон в соотношении один к одному шариками полистирола, чтобы получился раствор для прокатки. Чтобы расположить червя для визуализации, сначала поместите 1,6 микролитра раскатывающегося раствора в центр агаровой подушечки.Затем, используя предпочитаемую червячную кирку, перенесите червя нужного возраста в раскатистый раствор на агаровой подушечке. Подождите около пяти минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем бросьте покровное стекло размером 22 на 22 миллиметра поверх агаровой подушечки. Для визуализации невритов в вентральном нервном мозге сверните червя, слегка сдвинув покрывало.Чтобы закрепить червяка на микроскопе, нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением в светлом поле. Затем переключитесь на 100-кратный объектив и найдите нейрит AVA с помощью подсветки GCaMP или mito GCaMP с помощью 488-нанометрового лазера визуализации.Для визуализации in vivo GCaMP отрегулируйте лазер визуализации в настройках сбора данных до тех пор, пока флуоресценция базилика GCaMP не окажется в среднем диапазоне динамического диапазона камеры, и установите время экспозиции на 20 миллисекунд. После того, как нейрит AVA обнаружен с помощью флуоресценции GCaMP при 100-кратном увеличении, установите корректор Z-дрейфа и инициируйте непрерывную автофокусировку. Перед получением изображения вручную скорректируйте фокальную плоскость по мере необходимости.Получение потока изображений со 100-кратным увеличением. Используя этот протокол, цитоплазматический кальций измеряли с высоким временным и пространственным разрешением. Клеточная специфическая экспрессия GCaMP6F в глутаматергических интернейронах команды AVA выявила направленное распространение притока кальция.Субклеточная количественная оценка флуоресценции GCaMP6F показала, что начало притока кальция было задержано в части нейрита, расположенной всего в 10 микрометрах. Кроме того, дендритные шиповидные структуры, обнаруженные вдоль нейрита AVA, показали вспышки флуоресценции GCaMP6F, которые происходили независимо от активации нейритов и не приводили к распространению притока кальция. Кроме того, относительные уровни кальция были измерены в отдельных митохондриях при одиночных нейритах с использованием штамма червя со специфической экспрессией AVA локализованного кальциевого индикатора митохондриального матрикса mito GCaMP.Результаты показали синхронное поглощение относительно большого количества кальция в подмножество митохондрий. В частности, поглощение кальция некоторыми митохондриями было синхронизировано, тогда как соседние митохондрии, по-видимому, не поглощали кальций. Точно так же подмножества митохондрий показали быстрое поглощение и высвобождение небольших количеств кальция.Это также оказалось синхронным, но только для подмножества митохондрий. Скорость и тонкие манипуляции необходимы для позиционирования животных и сохранения функции нейронов. Здоровье животных также имеет первостепенное значение.Даже немного поголодать проблематично. Сложнее всего освоить быструю ориентацию животных для конфокальной микроскопии без повреждений. Мой совет - много практики и хороший контроль.Этот протокол может быть применен к экспериментам, в которых кальций высвобождается из других субклеточных мест в нейронах, других нейронов или клеток, отличных от нейронов в C.elegans. Поскольку этот подход у C.elegans оставляет животных нетронутыми, можно решить вопросы о регуляции субклеточного обращения с кальцием in vivo в отдельных нейронах полной нервной системы.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Супер-Resolution Imaging нейронных Плотные-ядерные пузырьков

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

В естественных изображений из Dauer конкретным нейронов ремоделирования в C. Элеганс

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Длительная инкубация Острый нейронную ткань для электрофизиологии и кальций-изображений

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

В естественных условиях кальция изображений боковой линии клетки волос в личиночной данио рерио

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

В Vivo оптические изображения кальция обучения индуцированной синаптической пластичности в Drosophila меланогастер

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...