Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01- NS115947 otorgado a F. Hoerndli). También nos gustaría agradecer al Dr. Attila Stetak por el plásmido pAS1.

1. Creación de cepas transgénicas
<ol><li>Utilizando un método de clonación de la elección8,9, clonar vectores de expresión para contener el promotor Pflp-18 o Prig-3 (para señal específica de AVA en el cordón nervioso ventral), seguido del indicador de elección Ca2+, y luego un UTR 3' (ver la discusión para más información)10. Una lista de plásmidos y sus fuentes se puede encon...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. 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E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. 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H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

La primera consideración al implementar el método descrito implica la selección de un indicador Ca2+ con características ideales para la pregunta de investigación dada. Los indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ suelen tener una alta afinidad por el Ca 2+, y la sensibilidad de estos indicadores al Ca2+ está inversamente relacionada con la cinética (tasa de encendido/apagado)16,17. Esto significa que la sensibilida...

Los iones de calcio (Ca2+) son portadores altamente versátiles de información en muchos tipos de células. En las neuronas, el Ca2+ es responsable de la liberación dependiente de la actividad de los neurotransmisores, la regulación de la motilidad del citoesqueleto, el ajuste fino de los procesos metabólicos, así como muchos otros mecanismos necesarios para el mantenimiento y la función neuronal adecuados 1,2. Para garantizar una señalización intracelular efectiva, las neuronas deben mantener bajos los niveles basales de Ca2+ en su citoplasma3. Esto se logra mediante mecanismos cooperativos de manejo de Ca 2+, incluida la absorción de Ca2+ en orgánulos como el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias. Estos procesos, además de la disposición de los canales iónicos permeables al Ca 2+ en la membrana plasmática, dan como resultado niveles heterogéneos de Ca2+ citoplasmático en toda la neurona.
La heterogeneidad de Ca 2+ durante el reposo y la activación neuronal permite la regulación diversa y específica de la ubicación de los mecanismos dependientes de Ca 2+ 1. Un ejemplo de los efectos específicos de la concentración de Ca 2+ es la liberación de Ca2+ del RE a través de los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP 3). Se requieren niveles bajos de Ca2+ en combinación con InsP3 para la apertura del poro permeable al calcio del receptor. Alternativamente, los niveles altos de Ca2+ inhiben directa e indirectamente el receptor4. La importancia de la homeostasis del Ca 2+ para la función neuronal adecuada está respaldada por la evidencia que sugiere que la manipulación y señalización intracelular del Ca2+ interrumpido es un paso temprano en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos y el envejecimiento natural 5,6. Específicamente, la absorción y liberación anormal de Ca2+ por el RE y las mitocondrias están relacionadas con la aparición de disfunción neuronal en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 6,7.
El estudio de la dishomeostasis de Ca 2+ durante el envejecimiento natural o la neurodegeneración requiere la observación longitudinal de los niveles de Ca2+ con resolución subcelular en un organismo vivo e intacto en el que se mantiene la arquitectura celular nativa (es decir, la disposición de las sinapsis y la distribución de los canales iónicos). Con este fin, este protocolo proporciona orientación sobre el uso de dos sensores de Ca 2+ codificados genéticamente fácilmente disponibles para registrar la dinámica de Ca2+ in vivo con alta resolución espacial y temporal. Los resultados representativos adquiridos utilizando el método descrito en C. elegans demuestran cómo la expresión de indicadores de Ca 2+ en el citoplasma o matriz mitocondrial de neuronas individuales puede permitir la adquisición rápida de imágenes fluorescentes (hasta 50 Hz) que ilustran la dinámica de Ca 2+ con la capacidad adicional de discernir los niveles de Ca 2+ dentro de estructuras individuales similares a espinas y mitocondrias individuales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Las imágenes de calcio (Ca 2+) se han utilizado en gran medida para examinar la actividad neuronal, pero cada vez está más claro que el manejo subcelular de Ca2+ es un componente crucial de la señalización intracelular. La visualización de la dinámica subcelular de Ca2+ in vivo, donde las neuronas pueden estudiarse en sus circuitos nativos e intactos, ha demostrado ser técnicamente desafiante en sistemas nerviosos complejos. La transparencia y el sistema nervioso relativamente simple del nematodo Caenorhabditis elegans permiten la expresión específica de la célula y la visualización in vivo de etiquetas e indicadores fluorescentes. Entre estos se encuentran indicadores fluorescentes que han sido modificados para su uso en el citoplasma, así como varios compartimentos subcelulares, como las mitocondrias. Este protocolo permite obtener imágenes no ratiométricas de Ca 2+ in vivo con una resolución subcelular que permite el análisis de la dinámica de Ca2+ hasta el nivel de las espinas dendríticas individuales y las mitocondrias. Aquí, se utilizan dos indicadores codificados genéticamente disponibles con diferentes afinidades de Ca 2+ para demostrar el uso de este protocolo para medir los niveles relativos de Ca2+ dentro del citoplasma o la matriz mitocondrial en un solo par de interneuronas excitatorias (AVA). Junto con las manipulaciones genéticas y las observaciones longitudinales posibles en C. elegans, este protocolo de imagen puede ser útil para responder preguntas sobre cómo el manejo de Ca2+ regula la función neuronal y la plasticidad.

Estos dos protocolos permiten la adquisición rápida de niveles diferenciales de Ca2+ dentro de las regiones subcelulares y orgánulos de neuritas individuales in vivo con alta resolución espacial. El primer protocolo permite la medición de Ca2+ citoplasmático con alta resolución temporal y espacial. Esto se demuestra aquí utilizando la expresión celular específica de GCaMP6f en las interneuronas15 del comando AVA glutamatérgico, cuyas neuritas recorren toda...

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Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Esta técnica se puede utilizar para avanzar en nuestra comprensión del manejo del calcio en las neuronas, y cómo el calcio compartimentado puede regular diferentes mecanismos importantes para la función neuronal in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes in vivo rápidas de mayor resolución en condiciones fisiológicas en C.elegans que pueden combinarse con otras herramientas fluorescentes. Esta técnica podría proporcionar información sobre el mecanismo que regula la señalización del calcio en las neuronas en muchos contextos diferentes.Por ejemplo, durante el envejecimiento, lesión neuronal y neurodegeneración. Demostrando este procedimiento estará Ennis Deihl, técnico de investigación. Kaz Knight, candidato a doctorado, y Rachel Doser, investigadora postdoctoral de mi laboratorio.Comience clonando vectores de expresión que contengan un promotor seguido de un indicador de calcio y tres UTR principales de elección. Crear cepas transgénicas de C.elegans mediante microinyección de una mezcla de ADN que contiene el ADN de rescate Lin-15 plus en el transgén indicador de calcio en la gónada de un C.elegans adulto de un día de edad. Mantenga los gusanos padres inyectados a 20 grados centígrados hasta que la progenie F1 alcance la edad adulta.Seleccione adultos transgénicos mediante la detección de la ausencia del fenotipo multivulva. Eso indica la expresión de la matriz cromosómica adicional que contiene el indicador de calcio. Clonalmente pasan progenie F1 adulta que no tiene el fenotipo multivulva.Realizar experimentos sobre generaciones posteriores de las cepas transgénicas con una expresión óptima del indicador de calcio. Utilice un microscopio capaz de obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Localice el gusano bajo un objetivo de bajo aumento y luego cambie a un objetivo de gran aumento para localizar las neuronas.Adquiera las imágenes utilizando una cámara ultrasensible capaz de adquirir imágenes rápidamente a más de 50 FPS. A continuación, utilice un filtro de emisión estándar para el indicador de calcio. Agregue un corrector de deriva Z para la adquisición de flujos de imágenes de más de 10 segundos.En un tubo de cultivo de vidrio de 13 por 100 milímetros, prepare tres mililitros de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M9 y microondas durante varios segundos. Para hacer las almohadillas de agar, primero, prepare dos portaobjetos agregando dos capas de cinta de laboratorio. Luego coloque un portaobjetos de microscopio entre los dos portaobjetos.Corte la punta de una pipeta de 1000 microlitros y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar en el centro del cubreobjetos. Aplana el agar presionando otro deslizamiento hacia abajo encima del agar. Después de enfriar, corte el agar en un disco pequeño con la abertura de un tubo de 10 mililitros y luego retire el agar circundante.A continuación, prepare la solución de laminación de gusanos disolviendo el polvo de muscimol en M9 para crear una culata de 30 milimolares. Diluya el material en una proporción de uno a uno con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación. Para posicionar el gusano para la obtención de imágenes, primero, coloque 1.6 microlitros de la solución rodante en el centro de la almohadilla de agar.Luego, usando un pico de gusano preferido, transfiera un gusano de la edad deseada a la solución de laminación en la almohadilla de agar. Espere unos cinco minutos para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano y luego deje caer un deslizamiento de cubierta de 22 por 22 milímetros sobre la almohadilla de agar. Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, enrolle el gusano deslizando ligeramente el resbalón de la cubierta.Para montar el gusano en el microscopio, coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos. Encuentre el gusano utilizando un objetivo de baja ampliación en campo claro. Luego cambie a un objetivo 100x y localice la neurita AVA utilizando la iluminación del GCaMP o mito GCaMP con el láser de imágenes de 488 nanómetros.Para imágenes GCaMP in vivo, ajuste el láser de imágenes en los ajustes de adquisición hasta que la fluorescencia GCaMP de albahaca esté en el rango medio del rango dinámico de la cámara y ajuste el tiempo de exposición a 20 milisegundos. Después de localizar la neurita AVA utilizando la fluorescencia GCaMP con un aumento de 100 veces, configure el corrector de deriva Z e inicie el enfoque automático continuo. Corrija manualmente el plano focal según sea necesario antes de obtener imágenes.Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100 veces. Usando este protocolo, el calcio citoplasmático se midió con alta resolución temporal y espacial. La expresión celular específica de GCaMP6F en las interneuronas de comando AVA glutamatérgico reveló una propagación direccional de la afluencia de calcio.La cuantificación subcelular de la fluorescencia GCaMP6F mostró que el inicio de la afluencia de calcio se retrasó en una porción de la neurita ubicada a solo 10 micrómetros de distancia. Además, las estructuras dendríticas similares a la columna vertebral encontradas a lo largo de la neurita AVA mostraron destellos en la fluorescencia GCaMP6F que ocurrieron independientemente de la activación de la neurita y no condujeron a una propagación de la afluencia de calcio. Además, los niveles relativos de calcio se midieron en las mitocondrias individuales en neuritas individuales utilizando una cepa de gusano con una expresión específica AVA del indicador de calcio localizado de la matriz mitocondrial mito GCaMP.Los resultados mostraron la absorción sincrónica de una cantidad relativamente grande de calcio en un subconjunto de mitocondrias. Específicamente, la absorción de calcio en algunas mitocondrias estaba sincronizada, mientras que las mitocondrias vecinas no parecían absorber calcio. Del mismo modo, los subconjuntos de mitocondrias mostraron una rápida absorción y liberación de pequeñas cantidades de calcio.Esto también parecía ser sincrónico, pero sólo para un subconjunto de mitocondrias. La velocidad y las manipulaciones finas son esenciales para posicionar a los animales y retener la función neuronal. La salud animal también es primordial.Incluso un poco de hambre es problemático. La parte más difícil de aprender es la rápida orientación de los animales para la microscopía confocal sin daños. Mi consejo es mucha práctica y buenos controles.Este protocolo podría aplicarse a experimentos en los que se libera calcio de otras ubicaciones subcelulares en neuronas, otras neuronas o células distintas de las neuronas en C. elegans. Debido a que este enfoque en C. elegans deja a los animales intactos, es posible abordar preguntas sobre la regulación del manejo del calcio subcelular in vivo en neuronas individuales de un sistema nervioso completo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Investigación

Neurociencias

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

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Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

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Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

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In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...