Name: subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir (R01- NS115947, F. Hoerndli'ye verilmiştir). Ayrıca pAS1 plazmidi için Dr. Attila Stetak'a teşekkür ederiz.

1. Transgenik suşların oluşturulması
<ol><li>Tercih edilen 8,9 klonlama yöntemini kullanarak, Pflp-18 veya Prig-3 promotörünü (ventral sinir kordonundaki AVA'ya özgü sinyal için), ardından tercih edilen Ca2+ göstergesini ve ardından 3' UTR'yi (daha fazla bilgi için tartışmaya bakın) içerecek şekilde ekspresyon vektörlerini klonlayın10. Plazmidlerin ve kaynaklarının bir...

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+Function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Brini, M., Cal&#236;, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling.">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inositol+trisphosphate/calcium+signaling+pathway+in+health+and+disease.">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li><li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease.">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).</li><li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li><li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).</li><li>Zeiser, E., Fr&#248;kj&#230;r-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline.">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-FusionTM+assembly:+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans:+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates.">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy.">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li><li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans.">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Kerruth, S., Coates, C., D&#252;rst, C. D., Oertner, T. G., T&#246;r&#246;k, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators.">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li><li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2++content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals.">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li><li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia.">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li><li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies,+axons,+and+dendrites:+a+review.">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo.">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li><li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction.">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo.">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+cortical+dendrites+modulate+perception.">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li><li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons:+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD.">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li><li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2++release.">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li><li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li><li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans.">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2++indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging.">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262 (2014).</li><li>Cho, J. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators.">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults.">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging.">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).</li><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+homeostasis+in+aging+neurons.">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).</li><li>Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+aging:+Learning+from+C.+elegans.">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans.">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li></ol>

Açıklanan yöntemi uygularken göz önünde bulundurulması gereken ilk husus, verilen araştırma sorusu için ideal özelliklere sahip bir Ca2+ göstergesinin seçilmesini içerir. Sitoplazmik Ca 2+ göstergeleri tipik olarak Ca2+ için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu göstergelerin Ca2 + 'ya duyarlılığı kinetik (açma / kapama oranı) ile ters orantılıdır 16,17. Bu, Ca2+ duyarlılığının v...

Kalsiyum iyonları (Ca2+), birçok hücre tipinde çok yönlü bilgi taşıyıcılarıdır. Nöronlarda, Ca2+, nörotransmitterlerin aktiviteye bağlı salınımından, sitoiskelet motilitesinin düzenlenmesinden, metabolik süreçlerin ince ayarından ve ayrıca uygun nöronal bakım ve fonksiyon 1,2 için gerekli diğer birçok mekanizmadan sorumludur. Etkili hücre içi sinyalleşmeyi sağlamak için, nöronlar sitoplazma3'lerinde düşük bazal Ca2 + seviyelerini korumalıdır. Bu, Ca2 + 'nın endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri gibi organellere alımı da dahil olmak üzere işbirlikçi Ca2 + taşıma mekanizmaları ile gerçekleştirilir. Bu işlemler, plazma zarındakiCa2 + geçirgen iyon kanallarının düzenlenmesine ek olarak, nöron boyunca heterojen sitoplazmik Ca2 + seviyelerine neden olur.
Dinlenme ve nöronal aktivasyon sırasında Ca 2 + heterojenliği, Ca2 + bağımlı mekanizmaların çeşitli, yere özgü düzenlenmesine izin verir1. Ca 2 + 'nın konsantrasyona özgü etkilerinin bir örneği, Ca2 + 'nın ER'den inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) reseptörleri yoluyla salınmasıdır. Reseptörün kalsiyum geçirgen gözeneklerinin açılması için InsP3 ile kombinasyon halinde düşük Ca2 + seviyeleri gereklidir. Alternatif olarak, yüksek Ca2 + seviyeleri hem doğrudan hem de dolaylı olarak reseptör4'ü inhibe eder. Ca2+ homeostazının uygun nöronal fonksiyon için önemi, bozulmuş hücre içi Ca2+ kullanımı ve sinyalizasyonunun nörodejeneratif bozuklukların ve doğal yaşlanmanın patogenezinde erken bir adım olduğunu gösteren kanıtlarla desteklenmektedir 5,6. Spesifik olarak, ER ve mitokondri tarafından anormal Ca2 + alımı ve salınımı Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı 6,7'de nöronal disfonksiyonun başlangıcı ile bağlantılıdır.
Doğal yaşlanma veya nörodejenerasyon sırasında Ca 2+ dishomeostazının incelenmesi, doğal hücresel mimarinin (yani, sinapsların düzenlenmesi ve iyon kanallarının dağılımı) korunduğu canlı, sağlam bir organizmada hücre altı çözünürlükle Ca2 + seviyelerinin uzunlamasına gözlemlenmesini gerektirir. Bu amaçla, bu protokol, Ca 2+ dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle in vivo olarak kaydetmek için kolayca bulunabilen, genetik olarak kodlanmış iki Ca2+ sensörünün kullanımı konusunda rehberlik sağlar. C. elegans'ta tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilen temsili sonuçlar, tek nöronların sitoplazmasında veya mitokondriyal matrisindeCa2+ göstergelerinin ekspresyonunun, tek omurga benzeri yapılar ve bireysel mitokondri içindeki Ca2+ seviyelerini ayırt etme yeteneği ile Ca2 + dinamiklerini gösteren floresan görüntülerin (50 Hz'e kadar) hızlı bir şekilde elde edilmesine nasıl izin verebileceğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.40 Oil objective&#160;&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.40 Objective&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>&#160;UPlanSApo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 22 mm Cover glass&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48366-227&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose SFR&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>J234-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam homogenizer</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Borealis upgrade to CSU-X1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanBench laboratory table&#160;</td>
			<td>TMC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With vibration control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable culture tubes</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>&#160;13 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3940</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel or slider</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>For 25 mm diameter filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center&#160;</td>
			<td>FJH 185</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>FJH 597</td>
			<td>Worm strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP bandpass emission filter&#160;</td>
			<td>Chroma&#160;</td>
			<td></td>
			<td>525 &#177; 50 nm&#160;(25 mm diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE laser combiner&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>4 laser lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ILE solid state 488 nm laser</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td>50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.52a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX83 Spinning disk confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>With Yokogawa CSU-X1 spinning disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra EMCCD camera&#160;</td>
			<td>Andor Technologies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low auto-fluorescence immersion oil&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>Z-81226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160;</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.10.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control box</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX3-CBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscimol&#160;</td>
			<td>MP Biomedical&#160;/ Sigma</td>
			<td>02195336-CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAS1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>194970</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSKS</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCT61</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJM23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKK1&#160;</td>
			<td>AddGene&#160;</td>
			<td>194969</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres&#160;</td>
			<td>Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>&#160;0.094 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stability chamber</td>
			<td>Norlake Scientific</td>
			<td>NSRI241WSW/8H</td>
			<td>Set to 15 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td>With filter wheel control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard microscope slide</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9108W-E</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch panel controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>I3-TPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift corrector&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td>IX3-ZDC2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular imaging of neuronal calcium handling in vivo

Kalsiyum (Ca 2 +) görüntüleme, nöronal aktiviteyi incelemek için büyük ölçüde kullanılmıştır, ancak hücre altı Ca2 + kullanımının hücre içi sinyallemenin çok önemli bir bileşeni olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Nöronların yerli, bozulmamış devrelerinde incelenebildiği hücre altıCa2 + dinamiklerinin in vivo olarak görselleştirilmesi, karmaşık sinir sistemlerinde teknik olarak zor olduğunu kanıtlamıştır. Nematodun Caenorhabditis elegans'ın saydamlığı ve nispeten basit sinir sistemi, floresan etiketlerinin ve göstergelerinin hücreye özgü ekspresyonunu ve in vivo görselleştirilmesini sağlar. Bunlar arasında, sitoplazmada ve mitokondri gibi çeşitli hücre altı bölmelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiş floresan göstergeler bulunmaktadır. Bu protokol, Ca 2+ dinamiklerinin bireysel dendritik dikenler ve mitokondri seviyesine kadar analizine izin veren bir hücre altı çözünürlükle in vivo olarak orantısız Ca2 + görüntülemeyi mümkün kılar. Burada, farklı Ca 2 + afinitelerine sahip iki mevcut genetik olarak kodlanmış gösterge, bu protokolün tek bir uyarıcı internöron çiftinde (AVA) sitoplazma veya mitokondriyal matris içindeki göreceli Ca2 + seviyelerini ölçmek için kullanımını göstermek için kullanılır. C. elegans'ta mümkün olan genetik manipülasyonlar ve uzunlamasına gözlemlerle birlikte, bu görüntüleme protokolü, Ca2+ kullanımının nöronal fonksiyonu ve plastisiteyi nasıl düzenlediğine ilişkin soruları cevaplamak için yararlı olabilir.

Bu iki protokol, hücre altı bölgelerde ve bireysel nöritlerin organellerinde diferansiyelCa2 + seviyelerinin in vivo olarak yüksek uzamsal çözünürlükle hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. İlk protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükte sitoplazmik Ca2 + 'nın ölçülmesine izin verir. Bu, burada, nöritleri ventral sinir kordonunun tüm uzunluğunu çalıştıran glutamaterjik AVA komutu internöronlar15'teki GCaMP6f'nin hücreye öz...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo at JoVE.com

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Bu teknik, nöronlarda kalsiyum kullanımı hakkındaki anlayışımızı ve bölümlere ayrılmış kalsiyumun in vivo nöronal fonksiyon için önemli olan farklı mekanizmaları nasıl düzenleyebileceğini anlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, C.elegans'ta fizyolojik koşullar altında diğer floresan aletlerle kombine edilebilen daha yüksek çözünürlüklü hızlı in vivo görüntülemeye izin vermesidir. Bu teknik, birçok farklı bağlamda nöronlarda kalsiyum sinyallemesini düzenleyen mekanizma hakkında fikir verebilir.Örneğin, yaşlanma, nöronal yaralanma ve nörodejenerasyon sırasında. Bu prosedürü gösteren araştırma teknisyeni Ennis Deihl olacaktır. Doktora adayı Kaz Knight ve laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Rachel Doser.Bir promotör içeren ekspresyon vektörlerini klonlayarak başlayın, ardından bir kalsiyum göstergesi ve üç asal UTR tercih edin. Kalsiyum göstergesi transgenindeki kurtarma DNA'sı Lin-15 plus'ı içeren bir DNA karışımının bir günlük yetişkin C.elegans'ın gonadına mikroenjeksiyonu ile transgenik C.elegans suşları oluşturun. Enjekte edilen ebeveyn solucanları, F1 soyu yetişkinliğe ulaşana kadar 20 santigrat derecede tutun.Multi-vulva fenotipinin yokluğunu tarayarak transgenik yetişkinleri seçin. Bu, kalsiyum göstergesini içeren ekstra kromozomal dizinin ekspresyonunu gösterir. Multi-vulva fenotipine sahip olmayan yetişkin F1 soyundan klonal olarak geçer.Kalsiyum göstergesinin optimal bir ifadesi ile transgenik suşların sonraki nesilleri üzerinde deneyler yapın. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme yapabilen bir mikroskop kullanın. Solucanı düşük büyütme hedefi altında bulun ve ardından nöronları lokalize etmek için yüksek büyütme hedefine geçin.50 FPS'den daha yüksek hızlarda hızlı görüntü yakalama yeteneğine sahip ultra hassas bir kamera kullanarak görüntüleri elde edin. Ardından, kalsiyum göstergesi için standart bir emisyon filtresi kullanın. 10 saniyeden uzun görüntü akışlarının elde edilmesi için bir Z-sürüklenme düzelticisi ekleyin.13 x 100 milimetrelik bir cam kültür tüpünde, moleküler sınıf agar'ı M9 ve mikrodalgada birkaç saniye boyunca çözerek üç mililitre% 10 agar hazırlayın. Agar pedlerini yapmak için, önce iki kat laboratuvar bandı ekleyerek iki slayt hazırlayın. Ardından iki slaytın arasına bir mikroskop slaydı yerleştirin.1000 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve kapak slipinin ortasına küçük bir damla agar damlası pipetlemek için kullanın. Agarın üstüne başka bir slayt bastırarak agar'ı düzleştirin. Soğuduktan sonra, 10 mililitrelik bir tüpün açıklığını kullanarak agar'ı küçük bir diske kesin ve ardından çevreleyen agar'ı çıkarın.Daha sonra, 30 milimolar bir stok oluşturmak için mussimol tozunu M9'da çözerek solucan haddeleme çözeltisini hazırlayın. Haddeleme çözeltisini yapmak için stoğu polistiren boncuklarla bire bir oranında seyreltin. Solucanı görüntüleme için konumlandırmak için, önce 1.6 mikrolitre haddeleme çözeltisini agar pedinin ortasına yerleştirin.Daha sonra tercih edilen bir solucan toplama kullanarak, istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma çözeltisine aktarın. Mussimolün solucan hareketini azaltması için yaklaşık beş dakika bekleyin ve ardından agar pedinin üzerine 22 x 22 milimetrelik bir kapak kayması bırakın. Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, kapak kaymasını hafifçe kaydırarak solucanı yuvarlayın.Solucanı mikroskopa monte etmek için, kapak kaymasına bir damla daldırma yağı yerleştirin. Parlak alanda düşük büyütme hedefi kullanarak solucanı bulun. Ardından 100x hedefine geçin ve 488 nanometre görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mito GCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.İn vivo GCaMP görüntüleme için, fesleğen GCaMP floresansı kameranın dinamik aralığının orta aralığında olana kadar görüntüleme lazerini alım ayarlarında ayarlayın ve pozlama süresini 20 milisaniyeye ayarlayın. AVA nöriti GCaMP floresan kullanılarak 100 kat büyütmede konumlandırıldıktan sonra, Z-sürüklenme düzelticisini ayarlayın ve sürekli otomatik netlemeyi başlatın. Görüntülemeden önce odak düzlemini gerektiği gibi manuel olarak düzeltin.100 kat büyütmede bir görüntü akışı elde edin. Bu protokol kullanılarak, sitoplazmik kalsiyum yüksek temporal ve mekansal çözünürlükte ölçüldü. GCaMP6F'nin glutamaterjik AVA komutu internöronlarındaki hücreye özgü ekspresyonu, kalsiyum akışının yönlü bir yayılımını ortaya çıkardı.GCaMP6F floresansının hücre altı nicelleştirilmesi, sadece 10 mikrometre uzaklıkta bulunan nöritin bir kısmında kalsiyum akışının başlangıcının geciktiğini göstermiştir. Ayrıca, AVA nöriti boyunca bulunan dendritik omurga benzeri yapılar, nörit aktivasyonundan bağımsız olarak meydana gelen ve kalsiyum akışının yayılmasına yol açmayan GCaMP6F floresansında parlamalar gösterdi. Ayrıca, nispi kalsiyum seviyeleri, mitokondriyal matris lokalize kalsiyum göstergesi mito GCaMP'nin AVA'ya özgü bir ifadesine sahip bir solucan suşu kullanılarak tek nöritlerdeki bireysel mitokondride ölçülmüştür.Sonuçlar, nispeten büyük miktarda kalsiyumun mitokondrinin bir alt kümesine senkron alımını gösterdi. Spesifik olarak, bazı mitokondrilere kalsiyum alımı senkronize edilirken, komşu mitokondrinin kalsiyum aldığı görülmedi. Benzer şekilde, mitokondri alt kümeleri, az miktarda kalsiyumun hızlı alımını ve salınımını göstermiştir.Bu aynı zamanda eşzamanlı görünüyordu, ancak sadece mitokondrinin bir alt kümesi için. Hız ve ince manipülasyonlar, hayvanları konumlandırmak ve nöronal fonksiyonu korumak için gereklidir. Hayvan sağlığı da her şeyden önemlidir.Biraz açlık bile sorunludur. Öğrenmesi en zor kısım, hayvanların konfokal mikroskopi için zarar görmeden hızlı bir şekilde yönlendirilmesidir. Benim tavsiyem çok fazla pratik ve iyi kontroller.Bu protokol, kalsiyumun nöronlardaki diğer hücre altı konumlarından, diğer nöronlardan veya C.elegans'taki nöronlar dışındaki hücrelerden salındığı deneylere uygulanabilir. C.elegans'taki bu yaklaşım hayvanları sağlam bıraktığından, tam bir sinir sisteminin tek nöronlarında in vivo olarak hücre altı kalsiyum kullanımının düzenlenmesi ile ilgili soruları ele almak mümkündür.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...