Name: standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children
Uploaded: 2023-02-10T13:30:00
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RW a été soutenu par Beijing Natural Science Foundation, Chine (n ° 7222059), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82002130), XZ a été soutenu par le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (n ° 2019-I2M-5-026).

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital pour enfants de Beijing, Capital Medical University (numéro d’approbation: 2020-k-85). Le consentement éclairé des sujets humains a été levé car seuls les échantillons résiduels après l’utilisation d’essais cliniques dans cette étude. Deux laboratoires sont impliqués dans cette étude. Le laboratoire de transfert est l’endroit où la méthode normalisée a été développée à l’aide d’un cytomètre en flux....

<ol>
	<li>Cabanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+transfer:+Recommendations+for+best+practice.">Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice.</a> Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).</li><li>Le Lann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+procedure+for+flow+cytometry+data+harmonization+in+prospective+multicenter+studies.">Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).</li><li>Linskens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+standardization+of+flow+cytometry+diagnostic+screening+of+primary+immunodeficiency+by+software-based+automated+gating.">Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating.</a> Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+8-color+flow+cytometry+across+different+flow+cytometer+instruments:+A+feasibility+study+in+clinical+laboratories+in+Switzerland.">Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+peripheral+blood+lymphocyte+subsets+of+healthy+children+in+China.">Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polyfunctional+T+cells+in+children+vaccinated+with+Japanese+encephalitis+vaccine+via+the+flow+cytometry+technique.">Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+CD25+(+)+CD127+(low/-)+T+cells:+a+more+specific+Treg+population+in+human+peripheral+blood.">CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).</li><li>Kalina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+flow+cytometry+through+standardization:+opportunities+and+challenges.">Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).</li><li>Sommer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+highly+sophisticated+flow+cytometry+assays+in+multicenter+clinical+studies:+considerations+and+guidance.">Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance.</a> Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+EuroFlow+standard+operating+procedures+for+instrument+setup+and+compensation+for+BD+FACS+Canto+II,+Navios+and+BD+FACS+Lyric+instruments.">Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).</li></ol>

L’immunophénotypage de sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique peut aider à comprendre les changements dans l’immunité adaptative à médiation cellulaire après la vaccination chez les enfants. Dans les applications cliniques, des situations inattendues se produisent, telles que l’incapacité de détecter les échantillons en temps opportun ou le remplacement d’un cytomètre en flux; Par conséquent, des méthodes normalisées rapides qui facilitent les transferts entre cytomètres en flux dans<s...

La standardisation de la cytométrie en flux est utile pour la comparabilité des résultats obtenus à partir de différents cytomètres dans différents laboratoires et centres d’étude, et propice à la reconnaissance mutuelle des résultats pour améliorer l’efficacité du travail. Un nombre croissant de scénarios nécessitent une normalisation. Au cours du processus de développement du médicament, la normalisation de la cytométrie en flux est importante, car un test développé et validé soutiendra l’ensemble du processus de développement du médicament, de l’analyse préclinique à l’analyse clinique. Les méthodes de cytométrie en flux sont fréquemment transférées entre l’industrie pharmaceutique et les laboratoires collaborateurs1. De plus, il est essentiel d’obtenir des données comparables à partir d’études cliniques multicentriques. Par exemple, un flux de travail de normalisation a été développé dans le cadre du projet de recherche clinique multicentrique sur les maladies auto-immunes systémiques afin d’obtenir des données comparables à partir de la cytométrie en flux multicentrique2.
La normalisation des méthodes de cytométrie en flux est difficile. Les défis rencontrés dans les laboratoires sont attribués au manque de matériaux normalisés, aux problèmes de compatibilité logicielle, aux incohérences dans la configuration des instruments et à l’utilisation de configurations différentes entre différents cytomètres de flux et à des stratégies de contrôle divergentes entre les centres 3,4. Par conséquent, il est important d’effectuer une analyse des écarts entre les laboratoires. L’accès aux échantillons, les systèmes qualité, les qualifications du personnel et la configuration des instruments doivent être examinés pour s’assurer que les exigences sont respectées.
À l’heure actuelle, les enfants vaccinés avec le vaccin contre l’encéphalite japonaise (EJ) ont une incidence significativement réduite de JE5. La surveillance des cellules immunitaires du sang périphérique peut aider à comprendre les changements dans l’immunité adaptative à médiation cellulaire après la vaccination, et la corrélation entre les changements dans les sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique et les effets de la vaccination. En raison de la stabilité limitée des échantillons de sang total, les évaluations de l’efficacité du vaccin sont souvent effectuées dans plusieurs centres. Pour cette analyse, nous avons défini les lymphocytes T CD8+ ou CD4+ naïfs comme CD27+ CD45RA+, les lymphocytes T à mémoire centrale (T CM) comme CD27+ CD45RA-, les lymphocytes T à mémoire effectrice (T EM) comme CD27- CD45RA-, et les lymphocytes T à mémoire effectrice différenciée terminale (TEMRA) comme CD27- CD45RA+. Les lymphocytes B CD19+ peuvent être séparés en populations qui expriment CD27 par rapport aux IgD 6,7, les lymphocytes B naïfs expriment CD27n mémoire Les lymphocytes B (mBC) peuvent être identifiés en fonction de l’expression des IgD6, et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) peuvent être identifiés comme CD4+CD25++CD127faible 8. Pour établir une expérience standardisée de cytométrie en flux afin d’assurer la cohérence et la comparabilité des résultats expérimentaux dans plusieurs centres, une méthode de normalisation rapide et réalisable a été établie pour faciliter le transfert de protocoles entre différents cytomètres en flux pour la détection des lymphocytes dans le sang total des enfants vaccinés contre l’EJ. Six enfants en bonne santé (2 ans) ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Beijing de l’Université médicale de la capitale. Après avoir reçu une vaccination prime et boost avec un vaccin vivant atténué contre l’encéphalite japonaise SA14-14-2 moins de 6 mois auparavant, des échantillons de sang périphérique ont été prélevés chez les volontaires. Des données très comparables ont été obtenues à partir de différents instruments suivant des procédures normalisées, ce qui est utile pour les évaluations multicentriques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD CompBeads Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td>flow Cytometry A in the transferring lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>655051</td>
			<td>define flow cytometer baseline and track cytometer performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127</td>
			<td>BD</td>
			<td>562436</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>562656</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>560777</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>flow Cytometry B in the test method lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>745907</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD</td>
			<td>751953</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>550855</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>560176</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>566320</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25</td>
			<td>BD</td>
			<td>555432</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD</td>
			<td>BD</td>
			<td>561314</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer Plus</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Staining Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T IVD Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>662414</td>
			<td>standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x Concentrate</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>lysing red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children

Un nombre croissant de laboratoires doivent collecter des données à partir de plusieurs cytomètres en flux, en particulier pour les projets de recherche réalisés dans plusieurs centres. Les défis liés à l’utilisation de deux cytomètres en flux dans différents laboratoires comprennent le manque de matériaux normalisés, les problèmes de compatibilité logicielle, les incohérences dans la configuration des instruments et l’utilisation de configurations différentes pour différents cytomètres en flux. Pour établir une expérience standardisée de cytométrie en flux afin d’assurer la cohérence et la comparabilité des résultats expérimentaux entre plusieurs centres, une méthode de normalisation rapide et réalisable a été établie pour transférer les paramètres entre différents cytomètres en flux. 
Les méthodes développées dans cette étude ont permis le transfert de paramètres expérimentaux et de modèles d’analyse entre deux cytomètres en flux dans différents laboratoires pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise (EJ). Une intensité de fluorescence constante a été obtenue entre les deux cytomètres en utilisant des billes standard de fluorescence pour établir les réglages du cytomètre. Des résultats comparables ont été obtenus dans deux laboratoires avec différents types d’instruments. En utilisant cette méthode, nous pouvons normaliser l’analyse pour évaluer la fonction immunitaire des enfants vaccinés par l’EJ dans différents laboratoires avec différents instruments, diminuer les différences de données et de résultats entre les cytomètres de flux dans plusieurs centres et fournir une approche réalisable pour l’accréditation mutuelle des résultats de laboratoire. La méthode de normalisation des expériences de cytomètre en flux assurera la performance efficace des projets de recherche dans plusieurs centres.

La figure 1 montre une feuille de calcul globale du modèle de valeur cible pour les perles brillantes CST. À l’aide d’un tracé FSC/SSC, une porte polygonale est dessinée pour sélectionner les perles brillantes CST. Des diagrammes d’histogramme de 10 canaux de fluorescence ont été obtenus pour les billes brillantes CST : FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 et BV605. La valeur cible pour chaque paramètre est affichée en montrant la médiane dans les portes de...

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Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

Dans cette étude, une méthode a été développée pour faciliter le transfert de contextes expérimentaux et de modèles d’analyse entre deux cytomètres en flux dans deux laboratoires pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise. La méthode de normalisation des expériences de cytomètre en flux permettra de mener efficacement des projets de recherche dans plusieurs centres.

Normalisation du transfert entre laboratoires entre cytomètres en flux pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...

La méthode de normalisation du cytomètre en flux fournit une approche réalisable pour l’accréditation mutuelle des résultats de laboratoire et assure la cohérence des résultats avec les projets de recherche de plusieurs centres. La méthode de minimisation de la consommation de temps est facile à exécuter, est équipée pour automatiser, analyse le modèle et peut réduire considérablement les besoins en analyse de données. Commencez à créer une nouvelle configuration dans le logiciel du cytomètre A, à partir du laboratoire de transfert, en cliquant sur le bouton du cytomètre et en choisissant Afficher les configurations.Cliquez avec le bouton droit sur le dossier des configurations de base dans la liste de configuration, choisissez Nouveau dossier et renommez-le. Ensuite, créez une nouvelle configuration en cliquant avec le bouton droit sur la configuration de base et en la copiant. Cliquez avec le bouton droit sur le nouveau dossier et collez la configuration de base avant de renommer la nouvelle configuration, Transfert de méthode standardisée"Faites glisser le nom du paramètre, tel que, FETC de la liste des paramètres, sur le détecteur approprié 530/30, modifiez également des paramètres supplémentaires dans la nouvelle configuration.Pour normaliser l’expérience dans le laboratoire de transfert, exécutez un contrôle des performances à l’aide de cette configuration de cytomètre A et suivez les billes pour vérifier que le cytomètre A fonctionne correctement. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les paramètres du cytomètre A dans la fenêtre du navigateur du logiciel et créez une feuille de calcul en sélectionnant les paramètres de l’application. Utilisez ensuite un échantillon non coloré pour ajuster le tube photomultiplicateur, ou tensions PMT, de la zone de diffusion directe, ou FSC, et de la zone de diffusion latérale, ou SSC, et tous les paramètres de fluorescence.Enregistrez les paramètres de l’application en cliquant avec le bouton droit sur les paramètres du cytomètre expérimental et en sélectionnant Paramètres de l’application. Pour ajouter automatiquement des contrôles de compensation, cliquez sur le bouton Expérimenter et sélectionnez le menu de configuration de la compensation, avant de sélectionner Créer des contrôles de compensation. Consigner les données de toutes les perles de contrôle de la rémunération.Une fois cela fait, cliquez sur l’expérience et sélectionnez la configuration de compensation, calculez la compensation automatiquement, avant d’enregistrer les données pour les contrôles colorés à cellule unique. utiliser CD45 RAA APC pour modifier la valeur de compensation de R7-18 à 15 % APC, utiliser CD19 BB700 pour modifier la valeur de compensation de l’APC H7 à 14 % BB700 et utiliser CD8 R7-18 pour modifier la valeur de compensation de l’APC H7 à 60 % R7-18. Après avoir enregistré les données pour les billes CST, créez une feuille de calcul globale du modèle de valeur cible pour les perles brillantes CST, une fois terminé, exécutez les échantillons sur le réseau de cytomètres en flux et collectez 25 000 lymphocytes.Créez une feuille de calcul globale du modèle d’analyse pour les échantillons et enregistrez le modèle expérimental sur le cytomètre A.Exportez le modèle expérimental à l’aide du CD-ROM. Pour transférer le gabarit expérimental vers le cytomètre B dans le laboratoire d’essai, effectuez un contrôle de performance à l’aide de billes CST pour vérifier que le cytomètre B fonctionne bien. Importez le modèle expérimental à partir du cytomètre A et créez une expérience pour le cytomètre B à l’aide du modèle.En utilisant le même lot de billes CST, ajustez les tensions des paramètres fluorescents pour chaque canal de fluorescence afin qu’elles correspondent à l’instrument MFI précédent. Si nécessaire, ajustez la tension FSC à l’aide de l’échantillon non coloré. Faites un clic droit sur les paramètres du cytomètre expérimental et sélectionnez les paramètres de l’application pour enregistrer les paramètres de l’application.Ensuite, modifiez la valeur de compensation de R7-18 à 15% APC en utilisant CD45 RA APC. Utilisez CD19 BB700 pour modifier la valeur de compensation de l’APC H7 à 24 % BB700. Et utilisez CD8 R7-18 pour modifier la valeur de compensation de l’APC H7 à 60% R7-18.Après modification de la valeur de compensation, exécutez les échantillons sur le cytomètre en flux B et prélevez 25 000 lymphocytes. Dans une feuille de calcul globale du modèle de valeur cible pour la configuration et le suivi du cytomètre, ou perles brillantes CST, les diagrammes d’histogramme de 10 canaux de fluorescence ont été obtenus, la valeur cible pour chaque paramètre a été affichée en montrant la médiane dans les portes de l’histogramme. les diagrammes à points de l’échantillon obtenus à l’aide du cytomètre A et B après normalisation de l’instrument ont démontré la cohérence des données entre les différents instruments à l’aide d’un gabarit d’analyse automatique.Aucune différence significative n’a été observée lorsque les résultats de six échantillons ont été comparés à deux modèles d’instruments différents. Les résultats de 15 sous-ensembles lymphoïdes obtenus à partir de différents instruments utilisant la méthode standardisée ont permis d’obtenir des données hautement comparables. Le même nom de configuration, la création du modèle et la création des valeurs ecotech des cordons de sécurité dans différents instruments sont des étapes critiques de ce protocole.

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