Name: standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children
Uploaded: 2023-02-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children at JoVE.com

RW è stato supportato dalla Beijing Natural Science Foundation, Cina (n. 7222059), National Natural Science Foundation of China (n. 82002130), XZ è stato supportato dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (n. 2019-I2M-5-026).

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). Il consenso informato dei soggetti umani è stato rinunciato poiché in questo studio sono stati utilizzati solo campioni residui dopo test clinici. Due laboratori sono coinvolti in questo studio. Il laboratorio di trasferimento è dove il metodo standardizzato è stato sviluppato utilizzando un citometro a flusso. Il citometro in questo laboratorio è di se...

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	<li>Cabanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+transfer:+Recommendations+for+best+practice.">Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice.</a> Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).</li><li>Le Lann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+procedure+for+flow+cytometry+data+harmonization+in+prospective+multicenter+studies.">Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).</li><li>Linskens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+standardization+of+flow+cytometry+diagnostic+screening+of+primary+immunodeficiency+by+software-based+automated+gating.">Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating.</a> Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+8-color+flow+cytometry+across+different+flow+cytometer+instruments:+A+feasibility+study+in+clinical+laboratories+in+Switzerland.">Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+peripheral+blood+lymphocyte+subsets+of+healthy+children+in+China.">Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polyfunctional+T+cells+in+children+vaccinated+with+Japanese+encephalitis+vaccine+via+the+flow+cytometry+technique.">Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+CD25+(+)+CD127+(low/-)+T+cells:+a+more+specific+Treg+population+in+human+peripheral+blood.">CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).</li><li>Kalina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+flow+cytometry+through+standardization:+opportunities+and+challenges.">Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).</li><li>Sommer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+highly+sophisticated+flow+cytometry+assays+in+multicenter+clinical+studies:+considerations+and+guidance.">Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance.</a> Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+EuroFlow+standard+operating+procedures+for+instrument+setup+and+compensation+for+BD+FACS+Canto+II,+Navios+and+BD+FACS+Lyric+instruments.">Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).</li></ol>

L'immunofenotipizzazione dei sottogruppi di linfociti del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell'immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione nei bambini. Nelle applicazioni cliniche si verificano situazioni impreviste, come la mancata rilevazione tempestiva dei campioni o la sostituzione di un citometro a flusso; Pertanto, sono necessari metodi standardizzati rapidi che facilitino i trasferimenti tra citometri a flusso in diversi laboratori 9,10,11.</sup...

La standardizzazione della citometria a flusso è utile per la comparabilità dei risultati ottenuti da diversi citometri tra diversi laboratori e centri di studio e favorisce il riconoscimento reciproco dei risultati per migliorare l'efficienza del lavoro. Un numero crescente di scenari richiede una standardizzazione. Durante il processo di sviluppo del farmaco, la standardizzazione della citometria a flusso è importante, poiché un test sviluppato e convalidato supporterà l'intero processo di sviluppo del farmaco dall'analisi preclinica a quella clinica. I metodi citometrici a flusso sono spesso trasferiti tra l'industria farmaceutica e i laboratori che collaborano1. Inoltre, è essenziale ottenere dati comparabili da studi clinici multicentrici. Ad esempio, è stato sviluppato un flusso di lavoro di standardizzazione nel progetto di ricerca clinica multicentrica sulle malattie autoimmuni sistemiche per ottenere dati comparabili dalla citometria a flusso multicentrica2.
La standardizzazione dei metodi di citometria a flusso è impegnativa. Le sfide incontrate nei laboratori sono attribuite alla mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l'uso di diverse configurazioni tra diversi citometri a flusso e strategie di gating divergenti tra i centri 3,4. Pertanto, è importante condurre un'analisi del divario tra i laboratori. L'accesso ai campioni, i sistemi di qualità, le qualifiche del personale e la configurazione degli strumenti devono essere rivisti per garantire che i requisiti siano soddisfatti.
Attualmente, i bambini vaccinati con il vaccino contro l'encefalite giapponese (JE) hanno un'incidenza significativamente ridotta di JE5. Il monitoraggio delle cellule immunitarie del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell'immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione e la correlazione tra i cambiamenti nei sottogruppi di linfociti del sangue periferico e gli effetti della vaccinazione. A causa della limitata stabilità dei campioni di sangue intero, le valutazioni dell'efficacia del vaccino vengono spesso eseguite in più centri. Per questa analisi, abbiamo definito le cellule T CD8+ o CD4+ naïve come CD27+ CD45RA+, le cellule T della memoria centrale (TCM) come CD27+ CD45RA, le cellule T della memoria effettrice (TEM) come CD27-CD45RA- e le cellule T della memoria effettrice terminalmente differenziata (TEMRA) come CD27-CD45RA+. Le cellule B CD19+ possono essere separate in popolazioni che esprimono CD27 rispetto a IgD 6,7, le cellule B naïve esprimono le cellule B di memoria CD27n (mBC) possono essere identificate in base all'espressione di IgD6 e le cellule T regolatorie (Treg) possono essere identificate come CD4+CD25++CD127basso 8. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali in più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per facilitare il trasferimento di protocolli attraverso diversi citometri a flusso per la rilevazione di linfociti nel sangue intero di bambini vaccinati con JE. Sei bambini sani (2 anni) sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. Dopo aver ricevuto una vaccinazione primaria e boost con un vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato meno di 6 mesi prima, sono stati raccolti campioni di sangue periferico dai volontari. Dati altamente comparabili sono stati ottenuti da diversi strumenti seguendo procedure standardizzate, il che è utile per le valutazioni multicentriche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD CompBeads Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td>flow Cytometry A in the transferring lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>655051</td>
			<td>define flow cytometer baseline and track cytometer performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127</td>
			<td>BD</td>
			<td>562436</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>562656</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>560777</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>flow Cytometry B in the test method lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>745907</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD</td>
			<td>751953</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>550855</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>560176</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>566320</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25</td>
			<td>BD</td>
			<td>555432</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD</td>
			<td>BD</td>
			<td>561314</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer Plus</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Staining Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T IVD Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>662414</td>
			<td>standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x Concentrate</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>lysing red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children

Un numero crescente di laboratori ha bisogno di raccogliere dati da più citometri a flusso, in particolare per i progetti di ricerca eseguiti in più centri. Le sfide legate all'utilizzo di due citometri a flusso in laboratori diversi includono la mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l'uso di configurazioni diverse per diversi citometri a flusso. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali tra più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per trasferire i parametri tra diversi citometri a flusso. 
I metodi sviluppati in questo studio hanno permesso il trasferimento di impostazioni sperimentali e modelli di analisi tra due citometri a flusso in diversi laboratori per la rilevazione di linfociti in bambini vaccinati con encefalite giapponese (JE). Un'intensità di fluorescenza costante è stata ottenuta tra i due citometri utilizzando sfere standard di fluorescenza per stabilire le impostazioni del citometro. Risultati comparabili sono stati ottenuti in due laboratori con diversi tipi di strumenti. Utilizzando questo metodo, possiamo standardizzare l'analisi per valutare la funzione immunitaria dei bambini vaccinati con JE in diversi laboratori con strumenti diversi, diminuire le differenze nei dati e nei risultati tra i citometri a flusso in più centri e fornire un approccio fattibile per l'accreditamento reciproco dei risultati di laboratorio. Il metodo di standardizzazione degli esperimenti di citometro a flusso garantirà l'efficace esecuzione dei progetti di ricerca in più centri.

Nella Figura 1 viene illustrato un foglio di lavoro globale del modello di valore di destinazione per le perline luminose CST. Utilizzando un plottaggio FSC/SSC, viene disegnato un cancello poligonale per selezionare le perline luminose CST. Sono stati ottenuti grafici istografici di 10 canali di fluorescenza per le sfere luminose CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Il valore di destinazione per ciascun parametro viene visualizzato mostrando la mediana all'i...

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Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

In questo studio, è stato sviluppato un metodo per facilitare il trasferimento di impostazioni sperimentali e modelli di analisi tra due citometri a flusso in due laboratori per la rilevazione di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese. Il metodo di standardizzazione per gli esperimenti di citometro a flusso consentirà di condurre efficacemente i progetti di ricerca in più centri.

Standardizzazione del trasferimento tra laboratori tra citometri a flusso per il rilevamento di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...

Il metodo di standardizzazione del citometro a flusso fornisce un approccio fattibile per l'accreditamento reciproco dei risultati di laboratorio e garantisce la coerenza dei risultati con i progetti di ricerca in più centri. Il metodo minimizza il consumo di tempo è facile da eseguire, è attrezzato per automatizzare, analizzare il modello e può ridurre drasticamente la necessità di analisi dei dati. Iniziare a creare una nuova configurazione nel software del citometro A, dal laboratorio di trasferimento, facendo clic sul pulsante del citometro e scegliendo le configurazioni di visualizzazione.Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella delle configurazioni di base nell'elenco di configurazione, scegliere la nuova cartella e rinominarla. Quindi, creare una nuova configurazione facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla configurazione di base e copiandola. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla nuova cartella e incollare la configurazione di base prima di rinominare la nuova configurazione, Trasferimento metodo standardizzato"Trascinare il nome del parametro, ad esempio, FETC dall'elenco dei parametri, sul rilevatore appropriato 530/30, modificare anche parametri aggiuntivi per la nuova configurazione.Per standardizzare l'esperimento nel laboratorio di trasferimento, eseguire un controllo delle prestazioni utilizzando questa configurazione del citometro A e tenere traccia delle perline per verificare che il citometro A funzioni correttamente. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle impostazioni del citometro A nella finestra del browser del software e creare un foglio di lavoro selezionando le impostazioni dell'applicazione. Quindi utilizzare un campione non colorato per regolare il tubo moltiplicatore fotografico, o le tensioni PMT, dell'area di diffusione diretta, o FSC, e dell'area di diffusione laterale, o SSC, e tutti i parametri di fluorescenza.Salvare le impostazioni dell'applicazione facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle impostazioni del citometro dell'esperimento e selezionando le impostazioni dell'applicazione. Per aggiungere automaticamente i controlli di compensazione, fai clic sul pulsante dell'esperimento e seleziona il menu di impostazione della retribuzione, prima di selezionare Crea controlli di retribuzione. Registrare i dati per tutte le perle di controllo della retribuzione.Una volta fatto, fai clic sull'esperimento e seleziona l'impostazione della compensazione, calcola automaticamente la compensazione, prima di registrare i dati per i controlli colorati a cella singola. utilizzare CD45 RAA APC per modificare il valore di compensazione di R7-18 al 15%APC, utilizzare CD19 BB700 per modificare il valore di compensazione di APC H7 al 14%BB700 e utilizzare CD8 R7-18 per modificare il valore di compensazione di APC H7 al 60%R7-18. Dopo aver registrato i dati per le perle CST, creare un foglio di lavoro globale del modello di valore target per le perle luminose CST, una volta fatto, eseguire i campioni sull'array di citometri a flusso e raccogliere 25.000 linfociti.Creare un foglio di lavoro globale del modello di analisi per i campioni e salvare il modello sperimentale sul citometro A.Esportare il modello sperimentale utilizzando il CD-ROM. Per trasferire il modello sperimentale al citometro B nel laboratorio di prova, eseguire un controllo delle prestazioni utilizzando perline CST per verificare che il citometro B funzioni bene. Importare il modello sperimentale dal citometro A e creare un esperimento per il citometro B utilizzando il modello.Utilizzando lo stesso lotto di sfere CST regolare le tensioni dei parametri fluorescenti per ciascun canale di fluorescenza in modo che corrispondano allo strumento MFI precedente. Se necessario, regolare la tensione FSC utilizzando il campione non macchiato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle impostazioni del citometro sperimentale e selezionare le impostazioni dell'applicazione per salvare le impostazioni dell'applicazione.Quindi, modificare il valore di compensazione di R7-18 al 15% APC utilizzando CD45 RA APC. Utilizzare CD19 BB700 per modificare il valore di compensazione di APC H7 al 24%BB700. E utilizzare CD8 R7-18 per modificare il valore di compensazione di APC H7 al 60%R7-18.Dopo la modifica del valore di compensazione, eseguire i campioni sul citometro a flusso B e raccogliere 25.000 linfociti. In un foglio di lavoro globale del modello di valore target per l'impostazione e il monitoraggio del citometro, o perline luminose CST, sono stati ottenuti i grafici dell'istogramma di 10 canali di fluorescenza, il valore target per ciascun parametro è stato visualizzato mostrando la mediana all'interno delle porte dell'istogramma. i grafici a punti del campione ottenuto utilizzando il citometro A e B dopo la standardizzazione dello strumento, hanno dimostrato la coerenza dei dati tra diversi strumenti utilizzando un modello di analisi automatico.Nessuna differenza significativa è stata osservata quando i risultati di sei campioni sono stati confrontati tra due diversi modelli di strumenti. I risultati di 15 sottogruppi linfoidi ottenuti da diversi strumenti utilizzando il metodo standardizzato hanno acquisito dati altamente comparabili. Lo stesso nome di configurazione, la creazione del modello e la creazione dei valori ecotech delle perline di sicurezza in diversi strumenti sono passaggi critici in questo protocollo.

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