Name: standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children
Uploaded: 2023-02-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children at JoVE.com

RWは中国の北京自然科学財団(第7222059位)、中国国家自然科学財団(第82002130位)、XZはCAMS医学イノベーション基金(第2019-I2M-5-026号)の支援を受けました。

この研究は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって承認されました(承認番号:2020-k-85)。この研究では臨床試験後の残留サンプルのみが使用されたため、ヒト被験者のインフォームドコンセントは放棄されました。この研究には2つの研究室が関わっています。 トランスファーラボ では、1つのフローサイトメーターを使用して標準化されたメソッドが開発されました。?...

<ol>
	<li>Cabanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+transfer:+Recommendations+for+best+practice.">Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice.</a> Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).</li><li>Le Lann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+procedure+for+flow+cytometry+data+harmonization+in+prospective+multicenter+studies.">Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).</li><li>Linskens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+standardization+of+flow+cytometry+diagnostic+screening+of+primary+immunodeficiency+by+software-based+automated+gating.">Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating.</a> Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+8-color+flow+cytometry+across+different+flow+cytometer+instruments:+A+feasibility+study+in+clinical+laboratories+in+Switzerland.">Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+peripheral+blood+lymphocyte+subsets+of+healthy+children+in+China.">Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polyfunctional+T+cells+in+children+vaccinated+with+Japanese+encephalitis+vaccine+via+the+flow+cytometry+technique.">Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+CD25+(+)+CD127+(low/-)+T+cells:+a+more+specific+Treg+population+in+human+peripheral+blood.">CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).</li><li>Kalina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+flow+cytometry+through+standardization:+opportunities+and+challenges.">Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).</li><li>Sommer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+highly+sophisticated+flow+cytometry+assays+in+multicenter+clinical+studies:+considerations+and+guidance.">Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance.</a> Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+EuroFlow+standard+operating+procedures+for+instrument+setup+and+compensation+for+BD+FACS+Canto+II,+Navios+and+BD+FACS+Lyric+instruments.">Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).</li></ol>

末梢血リンパ球サブセットのイムノフェノタイピングは、小児のワクチン接種後の細胞媒介性適応免疫の変化を理解するのに役立ちます。臨床アプリケーションでは、サンプルをタイムリーに検出できなかったり、フローサイトメーターを交換したりするなど、予期しない状況が発生します。したがって、異なるラボのフローサイトメーター間の移動を容易にする迅速な標準化された方法が?...

フローサイトメトリーの標準化は、異なるラボや研究センターの異なるサイトメーターから得られた結果の比較可能性に役立ち、結果の相互認識に役立ち、作業効率を向上させます。標準化を必要とするシナリオが増えています。医薬品開発プロセスでは、開発および検証済みのアッセイが前臨床から臨床分析までの医薬品開発プロセス全体をサポートするため、フローサイトメトリーの標準化が重要です。フローサイトメトリー法は、製薬業界と協力ラボの間で頻繁に転送されます1。さらに、多施設臨床試験から比較可能なデータを取得することが不可欠です。例えば、全身性自己免疫疾患多施設臨床研究プロジェクトでは、多中心フローサイトメトリー2から比較可能なデータを取得するための標準化ワークフローが開発されました。
フローサイトメトリー法の標準化は困難です。ラボ全体で発生する課題は、標準化された材料の欠如、ソフトウェアの互換性の問題、機器のセットアップの不一致、および異なるフローサイトメーター間での異なる構成の使用、およびセンター間の異なるゲーティング戦略に起因しています3,4。したがって、ラボ間のギャップ分析を行うことが重要です。サンプルアクセス、品質システム、人員資格、および機器構成をレビューして、要件が満たされていることを確認する必要があります。
現在、日本脳炎(JE)ワクチンを接種した小児は、JE5の発生率が大幅に低下しています。末梢血免疫細胞のモニタリングは、ワクチン接種後の細胞媒介性適応免疫の変化、および末梢血リンパ球サブセットの変化とワクチン接種の効果との相関関係を理解するのに役立ちます。全血サンプルの安定性が限られているため、ワクチンの有効性の評価は複数の施設で行われることがよくあります。この解析では、ナイーブCD8+またはCD4+ T細胞をCD27+ CD45RA+、セントラルメモリーT細胞(TCM)をCD27+ CD45RA-、エフェクターメモリーT細胞(T EM)をCD27-CD45RA-、終末分化型エフェクターメモリーT細胞(TEMRA)をCD27-CD45RA+と定義しました。CD19+ B細胞はCD27対IgD 6,7を発現する集団に分離でき、ナイーブB細胞はIgD6の発現に基づいてCD27nメモリーB細胞(mBC)を発現し、制御性T細胞(Treg)はCD4 + CD25 ++ CD127低8として同定できます。標準化されたフローサイトメトリー実験を確立して、複数の施設での実験結果の一貫性と比較可能性を達成するために、JEワクチン接種を受けた子供の全血中リンパ球を検出するための異なるフローサイトメーター間でのプロトコルの転送を容易にするための迅速かつ実行可能な標準化方法が確立されました。首都医科大学北京小児病院から6人の健康な子供(2歳)が採用されました。弱毒生JE SA14-14-2ワクチンによるプライムおよびブーストワクチン接種を6か月以内に受けた後、末梢血サンプルをボランティアから収集しました。標準化された手順に従って、さまざまな機器から比較性の高いデータが得られ、多施設評価に役立ちます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD CompBeads Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td>flow Cytometry A in the transferring lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>655051</td>
			<td>define flow cytometer baseline and track cytometer performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127</td>
			<td>BD</td>
			<td>562436</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>562656</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>560777</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>flow Cytometry B in the test method lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>745907</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD</td>
			<td>751953</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>550855</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>560176</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>566320</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25</td>
			<td>BD</td>
			<td>555432</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD</td>
			<td>BD</td>
			<td>561314</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer Plus</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Staining Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T IVD Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>662414</td>
			<td>standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x Concentrate</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>lysing red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children

特に複数の施設で実施される研究プロジェクトにおいて、複数のフローサイトメーターからデータを収集する必要があるラボが増えています。異なるラボで2つのフローサイトメーターを使用する場合の課題には、標準化された材料の欠如、ソフトウェアの互換性の問題、機器のセットアップの不一致、異なるフローサイトメーターで異なる構成を使用することなどがあります。標準化されたフローサイトメトリー実験を確立して、複数の施設にわたる実験結果の一貫性と比較可能性を達成するために、異なるフローサイトメーター間でパラメータを転送するための迅速かつ実行可能な標準化方法が確立されました。 
この研究で開発された方法は、日本脳炎(JE)ワクチン接種小児のリンパ球を検出するために、異なる実験室の2つのフローサイトメーター間で実験設定と分析テンプレートを転送することを可能にしました。蛍光標準ビーズを使用して2つのサイトメーター間で一貫した蛍光強度を取得し、サイトメーターの設定を確立しました。異なる種類の機器を使用した2つの実験室で同等の結果が得られました。この方法を用いることで、異なる機器を持つ異なる検査室におけるJEワクチン接種児の免疫機能を評価するための解析を標準化し、複数の施設のフローサイトメーター間でデータと結果の差異を減少させ、検査結果の相互認定のための実行可能なアプローチを提供することができます。フローサイトメーター実験の標準化方法は、複数のセンターにわたる研究プロジェクトの効果的なパフォーマンスを保証します。

図1は、CSTブライトビーズの目標値テンプレートのグローバルワークシートを示しています。FSC/SSCプロットを使用して、CST明るいビーズを選択するためにポリゴンゲートが描画されます。CST明るいビーズ(FITC、PE、BB700、PE-Cy7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500、およびBV605)の10個の蛍光チャンネルのヒストグラムプロットが得られました。各パラメータの目標値は、 表2</st...

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Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

本研究では、脳炎ワクチン接種児のリンパ球検出のために、2つの実験室の2つのフローサイトメーター間で実験設定と分析テンプレートの転送を容易にする方法を開発しました。フローサイトメーター実験の標準化手法により、複数のセンターで効果的に研究プロジェクトを実施できるようになります。

日本脳炎ワクチン接種小児におけるリンパ球検出のためのフローサイトメーター間ラボ間移入の標準化

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...

フローサイトメーターの標準化方法は、検査結果の相互認定のための実行可能なアプローチを提供し、複数のセンターにわたる研究プロジェクトとの結果の一貫性を保証します。時間の消費を最小限に抑える方法は、実行が簡単で、テンプレートを自動化し、分析し、データ分析の要件を大幅に減らすことができます。サイトメーターAのソフトウェアで、転送ラボからサイトメーターボタンをクリックし、構成の表示を選択して、新しい構成の作成を開始します。構成リストで基本構成フォルダーを右クリックし、[新しいフォルダー] を選択して名前を変更します。次に、基本構成を右クリックしてコピーし、新しい構成を作成します。新しいフォルダを右クリックし、新しい構成の名前を変更する前に基本構成を貼り付けます。 標準化されたメソッド転送」パラメータリストからFETCなどのパラメータ名を適切な検出器530/30にドラッグし、追加のパラメータも新しい構成に編集します。トランスファーラボで実験を標準化するには、このサイトメーターAのセットアップを使用してパフォーマンスチェックを実行し、ビーズを追跡して、サイトメーターAが良好に機能していることを確認します。ソフトウェアブラウザウィンドウでサイトメーターA設定を右クリックし、アプリケーション設定を選択してワークシートを作成します。次に、染色されていないサンプルを使用して、前方散乱領域(FSC)、側方散乱領域(SSC)、およびすべての蛍光パラメータの光電子増倍管(PMT)電圧を調整します。実験サイトメーターの設定を右クリックし、アプリケーションの設定を選択して、アプリケーションの設定を保存します。報酬コントロールを自動的に追加するには、実験ボタンをクリックし、報酬設定メニューを選択してから、[報酬コントロールの作成] を選択します。すべての補正制御ビーズのデータを記録します。完了したら、実験をクリックして補正設定を選択し、補正を自動的に計算してから、単一細胞染色コントロールのデータ記録を行います。CD45 RAA APC を使用して R7-18 の補正値を 15%APC に変更し、CD19 BB700 を使用して APC H7 の補正値を 14%BB700 に変更し、CD8 R7-18 を使用して APC H7 の補正値を 60%R7-18 に変更します。CSTビーズのデータを記録した後、CST明るいビーズの目標値テンプレートのグローバルワークシートを作成し、完了したら、フローサイトメーターアレイでサンプルを実行し、25, 000リンパ球を収集します。サンプルの分析テンプレートのグローバルワークシートを作成し、実験テンプレートをサイトメーターに保存します A.CD-ROMを使用して実験テンプレートをエクスポートします。実験テンプレートをテストラボのサイトメーターBに移すには、CSTビーズを使用して性能チェックを行い、サイトメーターBが良好に機能していることを確認します。サイトメーターAから実験テンプレートをインポートし、テンプレートを使用してサイトメーターBの実験を作成します。同じロットのCSTビーズを使用して、各蛍光チャンネルの蛍光パラメータ電圧を以前のMFI装置と一致するように調整します。必要に応じて、染色されていないサンプルを使用してFSC電圧を調整します。実験サイトメーターの設定を右クリックし、アプリケーション設定を選択してアプリケーション設定を保存します。次に、CD45 RA APCを使用してR7-18の補正値を15%APCに変更します。CD19 BB700を使用して、APC H7の補正値を24%BB700に変更します。また、CD8 R7-18を使用して、APC H7の補正値を60%R7-18に変更します。補正値を変更した後、フローサイトメーターBでサンプルを実行し、25, 000個のリンパ球を収集します。サイトメーターのセットアップおよび追跡、またはCST明るいビーズのターゲット値テンプレートのグローバルワークシートにおいて、10個の蛍光チャネルのヒストグラムプロットが得られ、各パラメータのターゲット値がヒストグラムゲート内の中央値を示すことによって表示された。装置標準化後にサイトメーターAおよびBを使用して得られたサンプルのドットプロットは、自動分析テンプレートを使用して異なる機器間のデータの一貫性を実証しました。6つのサンプルの結果を2つの異なる機器モデル間で比較しても、有意差は観察されませんでした。標準化された方法を使用して異なる機器から得られた15のリンパ系サブセットの結果は、非常に比較可能なデータを取得しました。同じ構成名、テンプレートの作成、および異なる機器での安全ビーズのエコテクノロジー値の作成は、このプロトコルの重要なステップです。

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