Name: standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children
Uploaded: 2023-02-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children at JoVE.com

A RW foi apoiada pela Beijing Natural Science Foundation, China (No. 7222059), National Natural Science Foundation of China (No. 82002130), a XZ foi apoiada pelo CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (No. 2019-I2M-5-026).

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). O consentimento informado de seres humanos foi dispensado, pois apenas amostras residuais após testes clínicos foram utilizadas neste estudo. Dois laboratórios estão envolvidos neste estudo. O laboratório de transferência é onde o método padronizado foi desenvolvido usando um citômetro de fluxo. O citômetro neste laboratório é doravante referido como <st...

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	<li>Cabanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+transfer:+Recommendations+for+best+practice.">Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice.</a> Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).</li><li>Le Lann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+procedure+for+flow+cytometry+data+harmonization+in+prospective+multicenter+studies.">Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).</li><li>Linskens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+standardization+of+flow+cytometry+diagnostic+screening+of+primary+immunodeficiency+by+software-based+automated+gating.">Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating.</a> Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+8-color+flow+cytometry+across+different+flow+cytometer+instruments:+A+feasibility+study+in+clinical+laboratories+in+Switzerland.">Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+peripheral+blood+lymphocyte+subsets+of+healthy+children+in+China.">Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polyfunctional+T+cells+in+children+vaccinated+with+Japanese+encephalitis+vaccine+via+the+flow+cytometry+technique.">Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+CD25+(+)+CD127+(low/-)+T+cells:+a+more+specific+Treg+population+in+human+peripheral+blood.">CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).</li><li>Kalina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+flow+cytometry+through+standardization:+opportunities+and+challenges.">Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).</li><li>Sommer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+highly+sophisticated+flow+cytometry+assays+in+multicenter+clinical+studies:+considerations+and+guidance.">Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance.</a> Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+EuroFlow+standard+operating+procedures+for+instrument+setup+and+compensation+for+BD+FACS+Canto+II,+Navios+and+BD+FACS+Lyric+instruments.">Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).</li></ol>

A imunofenotipagem de subconjuntos de linfócitos do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação em crianças. Em aplicações clínicas, ocorrem situações inesperadas, como a falha em detectar amostras em tempo hábil ou a substituição de um citômetro de fluxo; portanto, são necessários métodos padronizados rápidos que facilitem as transferências entre citômetros de fluxo em diferentes laboratórios9,10,11.<sup...

A padronização da citometria de fluxo é útil para a comparabilidade dos resultados obtidos de diferentes citômetros em diferentes laboratórios e centros de estudo, e conducente ao reconhecimento mútuo dos resultados para melhorar a eficiência do trabalho. Um número crescente de cenários requer padronização. Durante o processo de desenvolvimento do medicamento, a padronização da citometria de fluxo é importante, pois um ensaio desenvolvido e validado apoiará todo o processo de desenvolvimento do medicamento, desde a análise pré-clínica até a clínica. Os métodos citométricos de fluxo são frequentemente transferidos entre a indústria farmacêutica e os laboratórios colaboradores1. Além disso, é essencial obter dados comparáveis de estudos clínicos multicêntricos. Por exemplo, um fluxo de trabalho de padronização foi desenvolvido no Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project para obter dados comparáveis da citometria de fluxo multicêntrica2.
A padronização dos métodos de citometria de fluxo é um desafio. Os desafios vivenciados entre os laboratórios são atribuídos à falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e ao uso de diferentes configurações entre diferentes citômetros de fluxo e estratégias de gating divergentes entre os centros 3,4. Portanto, é importante realizar uma análise de lacunas entre os laboratórios. O acesso a amostras, os sistemas de qualidade, as qualificações de pessoal e a configuração do instrumento devem ser revisados para garantir que os requisitos sejam atendidos.
Atualmente, as crianças vacinadas com a vacina contra encefalite japonesa (JE) têm uma incidência significativamente reduzida de JE5. O monitoramento das células imunes do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação e a correlação entre as mudanças nos subconjuntos de linfócitos do sangue periférico e os efeitos da vacinação. Devido à estabilidade limitada das amostras de sangue total, as avaliações da eficácia da vacina são frequentemente realizadas em vários centros. Para esta análise, definimos células T CD8+ ou CD4+ ingênuas como CD27+ CD45RA+, células T de memória central (TCM) como CD27+ CD45RA-, células T de memória efetora (TEM) como CD27- CD45RA-, e células T de memória efetora terminalmente diferenciadas (TEMRA) como CD27- CD45RA+. As células B CD19+ podem ser separadas em populações que expressam CD27 versus IgD 6,7, as células B ingênuas expressam células B de memória CD27n (mBCs) podem ser identificadas com base na expressão de IgD6 e as células T reguladoras (Tregs) podem ser identificadas como CD4+CD25++CD127baixa 8. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e comparabilidade dos resultados experimentais em múltiplos centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para facilitar a transferência de protocolos entre diferentes citômetros de fluxo para a detecção de linfócitos no sangue total de crianças vacinadas com JE. Seis crianças saudáveis (2 anos de idade) foram recrutadas do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University. Depois de receber uma vacinação prime e boost com uma vacina JE SA14-14-2 atenuada ao vivo menos de 6 meses antes, amostras de sangue periférico foram coletadas dos voluntários. Dados altamente comparáveis foram obtidos de diferentes instrumentos seguindo procedimentos padronizados, o que é útil para avaliações multicêntricas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD CompBeads Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td>flow Cytometry A in the transferring lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>655051</td>
			<td>define flow cytometer baseline and track cytometer performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127</td>
			<td>BD</td>
			<td>562436</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>562656</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>560777</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>flow Cytometry B in the test method lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>745907</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD</td>
			<td>751953</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>550855</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>560176</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>566320</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25</td>
			<td>BD</td>
			<td>555432</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD</td>
			<td>BD</td>
			<td>561314</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer Plus</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Staining Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T IVD Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>662414</td>
			<td>standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x Concentrate</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>lysing red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children

Um número crescente de laboratórios precisa coletar dados de vários citômetros de fluxo, especialmente para projetos de pesquisa realizados em vários centros. Os desafios do uso de dois citômetros de fluxo em laboratórios diferentes incluem a falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e o uso de diferentes configurações para diferentes citômetros de fluxo. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e a comparabilidade dos resultados experimentais em vários centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para transferir parâmetros entre diferentes citômetros de fluxo. 
Os métodos desenvolvidos neste estudo permitiram a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em diferentes laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa (JE). Uma intensidade de fluorescência consistente foi obtida entre os dois citômetros usando esferas padrão de fluorescência para estabelecer as configurações do citômetro. Resultados comparáveis foram obtidos em dois laboratórios com diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos padronizar a análise para avaliar a função imunológica de crianças vacinadas com JE em diferentes laboratórios com diferentes instrumentos, diminuir as diferenças de dados e resultados entre citômetros de fluxo em múltiplos centros e fornecer uma abordagem viável para a acreditação mútua de resultados laboratoriais. O método de padronização de experimentos de citômetros de fluxo garantirá o desempenho efetivo de projetos de pesquisa em vários centros.

A Figura 1 mostra uma planilha global do modelo de valor de destino para as contas brilhantes CST. Usando um gráfico FSC/SSC, uma porta de polígono é desenhada para selecionar as contas brilhantes CST. Gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência foram obtidos para as esferas brilhantes de STC: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. O valor de destino para cada parâmetro é exibido mostrando a mediana dentro das portas do histograma na Tabela 2...

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Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

Neste estudo, foi desenvolvido um método para facilitar a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em dois laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa. O método de padronização para os experimentos de citômetro de fluxo permitirá que os projetos de pesquisa sejam efetivamente conduzidos em vários centros.

Padronização da Transferência entre Laboratórios entre Citômetros de Fluxo para Detecção de Linfócitos em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...

O método de padronização do citômetro de fluxo fornece uma abordagem viável para a acreditação mútua de resultados laboratoriais e garante a consistência dos resultados com projetos de pesquisa em vários centros. O método minimizar o consumo de tempo é fácil de executar, está equipado para automatizar, analisa o modelo e pode reduzir drasticamente a necessidade de análise de dados. Comece a criar uma nova configuração no software do citômetro A, a partir do laboratório de transferência, clicando no botão do citômetro e escolhendo as configurações de visualização.Clique com o botão direito do mouse na pasta de configurações básicas na lista de configurações, escolha a nova pasta e renomeie-a. Em seguida, crie uma nova configuração clicando com o botão direito do mouse na configuração base e copiando-a. Clique com o botão direito do mouse na nova pasta e cole a configuração base antes de renomear a nova configuração, Transferência de método padronizado"Arraste o nome do parâmetro, como FETC da lista de parâmetros, para o detector apropriado 530/30, também edite parâmetros adicionais para a nova configuração.Para padronizar o experimento no laboratório de transferência, execute uma verificação de desempenho usando essa configuração do citômetro A e rastreie as contas para verificar se o citômetro A está funcionando bem. Clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro A na janela do navegador do software e crie uma planilha selecionando as configurações do aplicativo. Em seguida, use uma amostra não corada para ajustar o tubo multiplicador da foto, ou tensões PMT, da área de espalhamento para a frente, ou FSC, e da área de espalhamento lateral, ou SSC, e todos os parâmetros de fluorescência.Salve as configurações do aplicativo clicando com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro do experimento e selecionando as configurações do aplicativo. Para adicionar controles de compensação automaticamente, clique no botão experimento e selecione o menu de configuração de compensação antes de selecionar criar controles de compensação. Registre os dados de todas as contas de controle de compensação.Uma vez feito, clique no experimento e selecione a configuração de compensação, calcule a compensação automaticamente, antes de registrar os dados para controles de coloração de célula única. use CD45 RAA APC para modificar o valor de compensação de R7-18 para 15%APC, use CD19 BB700 para modificar o valor de compensação de APC H7 para 14%BB700 e use CD8 R7-18 para modificar o valor de compensação de APC H7 para 60%R7-18. Depois de registrar os dados para as esferas CST, crie uma planilha global do modelo de valor alvo para as contas brilhantes CST, uma vez feitas, execute as amostras na matriz do citômetro de fluxo e colete 25.000 linfócitos.Crie uma planilha global do modelo de análise para as amostras e salve o modelo experimental no citômetro A.Exporte o modelo experimental usando o CD-ROM. Para transferir o modelo experimental para o citômetro B no laboratório de teste, realize uma verificação de desempenho usando esferas CST para verificar se o citômetro B está funcionando bem. Importe o modelo experimental do citômetro A e crie um experimento para o citômetro B usando o modelo.Usando o mesmo lote de grânulos CST ajustar as tensões de parâmetro fluorescente para cada canal de fluorescência para corresponder ao instrumento MFI anterior. Se necessário, ajuste a tensão do FSC usando a amostra não corada. Clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro experimental e selecione as configurações do aplicativo para salvar as configurações do aplicativo.Em seguida, modifique o valor de compensação de R7-18 para 15%APC usando CD45 RA APC. Use CD19 BB700 para modificar o valor de compensação de APC H7 para 24% BB700. E use CD8 R7-18 para modificar o valor de compensação do APC H7 para 60%R7-18.Após a modificação do valor de compensação, execute as amostras no citômetro de fluxo B e colete 25.000 linfócitos. Em uma planilha global do modelo de valor alvo para a configuração e rastreamento do citômetro, ou esferas brilhantes CST, os gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência foram obtidos, o valor alvo para cada parâmetro foi exibido mostrando a mediana dentro das portas do histograma. os gráficos de pontos da amostra, obtidos utilizando o citômetro A e B após a padronização do instrumento, demonstraram a consistência dos dados entre os diferentes instrumentos, utilizando um modelo de análise automática.Nenhuma diferença significativa foi observada quando os resultados de seis amostras foram comparados em dois modelos de instrumentos diferentes. Os resultados de 15 subconjuntos linfoides obtidos de diferentes instrumentos utilizando o método padronizado adquiriram dados altamente comparáveis. O mesmo nome de configuração, a criação do modelo e a criação dos valores ecotech de contas de segurança em diferentes instrumentos são etapas críticas neste protocolo.

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