Name: standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children
Uploaded: 2023-02-10T13:30:00
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RW fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing, China (No. 7222059), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82002130), XZ fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (No. 2019-I2M-5-026).

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Capital Medical University (Número de aprobación: 2020-k-85). Se renunció al consentimiento informado de sujetos humanos, ya que solo se utilizaron muestras residuales después de las pruebas clínicas en este estudio. Dos laboratorios están involucrados en este estudio. El laboratorio de transferencia es donde se desarrolló el método estandarizado utilizando un citómetro de flujo. El citómetro en este laboratorio...

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	<li>Cabanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+transfer:+Recommendations+for+best+practice.">Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice.</a> Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).</li><li>Le Lann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+procedure+for+flow+cytometry+data+harmonization+in+prospective+multicenter+studies.">Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).</li><li>Linskens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+standardization+of+flow+cytometry+diagnostic+screening+of+primary+immunodeficiency+by+software-based+automated+gating.">Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating.</a> Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+8-color+flow+cytometry+across+different+flow+cytometer+instruments:+A+feasibility+study+in+clinical+laboratories+in+Switzerland.">Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+peripheral+blood+lymphocyte+subsets+of+healthy+children+in+China.">Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polyfunctional+T+cells+in+children+vaccinated+with+Japanese+encephalitis+vaccine+via+the+flow+cytometry+technique.">Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+CD25+(+)+CD127+(low/-)+T+cells:+a+more+specific+Treg+population+in+human+peripheral+blood.">CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).</li><li>Kalina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+flow+cytometry+through+standardization:+opportunities+and+challenges.">Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).</li><li>Sommer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+highly+sophisticated+flow+cytometry+assays+in+multicenter+clinical+studies:+considerations+and+guidance.">Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance.</a> Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).</li><li>Glier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+EuroFlow+standard+operating+procedures+for+instrument+setup+and+compensation+for+BD+FACS+Canto+II,+Navios+and+BD+FACS+Lyric+instruments.">Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments.</a> Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).</li></ol>

El inmunofenotipado de los subgrupos de linfocitos de sangre periférica puede ayudar a comprender los cambios en la inmunidad adaptativa mediada por células después de la vacunación en niños. En aplicaciones clínicas, ocurren situaciones inesperadas, como la falta de detección de muestras de manera oportuna o el reemplazo de un citómetro de flujo; Por lo tanto, se necesitan métodos estandarizados rápidos que faciliten las transferencias entre citómetros de flujo en diferentes laboratorios 9,10,11.<sup class="x...

La estandarización de la citometría de flujo es útil para la comparabilidad de los resultados obtenidos de diferentes citómetros en diferentes laboratorios y centros de estudio, y conduce al reconocimiento mutuo de los resultados para mejorar la eficiencia del trabajo. Un número cada vez mayor de escenarios requiere estandarización. Durante el proceso de desarrollo del fármaco, la estandarización de la citometría de flujo es importante, ya que un ensayo desarrollado y validado apoyará todo el proceso de desarrollo del fármaco desde el análisis preclínico hasta el clínico. Los métodos de citometría de flujo se transfieren con frecuencia entre la industria farmacéutica y los laboratorios colaboradores1. Además, es esencial obtener datos comparables de estudios clínicos multicéntricos. Por ejemplo, se desarrolló un flujo de trabajo de estandarización en el Proyecto de Investigación Clínica Multicéntrica de Enfermedades Autoinmunes Sistémicas para obtener datos comparables de la citometría de flujo multicéntrica2.
La estandarización de los métodos de citometría de flujo es un desafío. Los desafíos experimentados en los laboratorios se atribuyen a la falta de materiales estandarizados, problemas de compatibilidad de software, inconsistencias en la configuración del instrumento y el uso de diferentes configuraciones entre diferentes citómetros de flujo y estrategias de compuerta divergentes entre los centros 3,4. Por lo tanto, es importante realizar un análisis de brecha entre laboratorios. El acceso a la muestra, los sistemas de calidad, las calificaciones del personal y la configuración del instrumento deben revisarse para garantizar que se cumplan los requisitos.
En la actualidad, los niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa (JE) tienen una incidencia significativamente reducida de JE5. El monitoreo de las células inmunitarias de la sangre periférica puede ayudar a comprender los cambios en la inmunidad adaptativa mediada por células después de la vacunación y la correlación entre los cambios en los subconjuntos de linfocitos de sangre periférica y los efectos de la vacunación. Debido a la estabilidad limitada de las muestras de sangre total, las evaluaciones de la eficacia de la vacuna a menudo se realizan en múltiples centros. Para este análisis, definimos las células T CD8+ o CD4+ naïve como CD27+ CD45RA+, las células T de memoria central (TCM) como CD27+ CD45RA-, las células T con memoria efectora (TEM) como CD27- CD45RA-, y las células T de memoria efectora diferenciadas terminalmente (TEMRA) como CD27- CD45RA+. Las células B CD19+ se pueden separar en poblaciones que expresan CD27 versus IgD 6,7, las células B naïve expresan células B de memoria CD27n (mBCs) pueden identificarse en base a la expresión de IgD6, y las células T reguladoras (Tregs) pueden identificarse como CD4+CD25++CD127bajo 8. Para establecer un experimento estandarizado de citometría de flujo para lograr la consistencia y comparabilidad de los resultados experimentales en múltiples centros, se estableció un método de estandarización rápido y factible para facilitar la transferencia de protocolos a través de diferentes citómetros de flujo para la detección de linfocitos en la sangre total de niños vacunados con JE. Seis niños sanos (2 años de edad) fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Después de recibir una vacuna de refuerzo y cebador con una vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada menos de 6 meses antes, se recolectaron muestras de sangre periférica de los voluntarios. Se obtuvieron datos altamente comparables de diferentes instrumentos siguiendo procedimientos estandarizados, lo cual es útil para evaluaciones multicéntricas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD CompBeads Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>compensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto</td>
			<td>flow Cytometry A in the transferring lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>655051</td>
			<td>define flow cytometer baseline and track cytometer performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127</td>
			<td>BD</td>
			<td>562436</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>562656</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>560777</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>flow Cytometry B in the test method lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>745907</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8</td>
			<td>BD</td>
			<td>751953</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>550855</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>560176</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>566320</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25</td>
			<td>BD</td>
			<td>555432</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD</td>
			<td>BD</td>
			<td>561314</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer Plus</td>
			<td>BD</td>
			<td>566385</td>
			<td>Staining Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS&#38;T IVD Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>662414</td>
			<td>standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x Concentrate</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>lysing red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of transfer across labs between flow cytometers for detection of lymphocytes in japanese encephalitis vaccinated children

Un número cada vez mayor de laboratorios necesita recopilar datos de múltiples citómetros de flujo, especialmente para proyectos de investigación realizados en múltiples centros. Los desafíos de usar dos citómetros de flujo en diferentes laboratorios incluyen la falta de materiales estandarizados, problemas de compatibilidad de software, inconsistencias en la configuración del instrumento y el uso de diferentes configuraciones para diferentes citómetros de flujo. Para establecer un experimento estandarizado de citometría de flujo para lograr la consistencia y comparabilidad de los resultados experimentales en múltiples centros, se estableció un método de estandarización rápido y factible para transferir parámetros a través de diferentes citómetros de flujo. 
Los métodos desarrollados en este estudio permitieron la transferencia de configuraciones experimentales y plantillas de análisis entre dos citómetros de flujo en diferentes laboratorios para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa (JE). Se obtuvo una intensidad de fluorescencia consistente entre los dos citómetros utilizando perlas estándar de fluorescencia para establecer la configuración del citómetro. Se obtuvieron resultados comparables en dos laboratorios con diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos estandarizar el análisis para evaluar la función inmune de niños vacunados con JE en diferentes laboratorios con diferentes instrumentos, disminuir las diferencias en datos y resultados entre citómetros de flujo en múltiples centros y proporcionar un enfoque factible para la acreditación mutua de resultados de laboratorio. El método de estandarización de los experimentos con citómetros de flujo garantizará el desempeño efectivo de los proyectos de investigación en múltiples centros.

La figura 1 muestra una hoja de cálculo global de la plantilla de valor objetivo para las cuentas brillantes de CST. Usando una gráfica FSC/SSC, se dibuja una puerta poligonal para seleccionar las cuentas brillantes CST. Se obtuvieron gráficos de histograma de 10 canales de fluorescencia para las perlas brillantes CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 y BV605. El valor objetivo para cada parámetro se muestra mostrando la mediana dentro de las puertas del histograma...

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Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

En este estudio, se desarrolló un método para facilitar la transferencia de entornos experimentales y plantillas de análisis entre dos citómetros de flujo en dos laboratorios para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa. El método de estandarización para los experimentos del citómetro de flujo permitirá que los proyectos de investigación se lleven a cabo de manera efectiva en múltiples centros.

Estandarización de la transferencia a través de laboratorios entre citómetros de flujo para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...

El método de estandarización del citómetro de flujo proporciona un enfoque factible para la acreditación mutua de los resultados de laboratorio y garantiza la coherencia de los resultados con los proyectos de investigación en múltiples centros. El método de minimizar el consumo de tiempo es fácil de ejecutar, está equipado para automatizar, analiza la plantilla y puede reducir drásticamente el requisito de análisis de datos. Comience a crear una nueva configuración en el software del citómetro A, desde el laboratorio de transferencia, haciendo clic en el botón del citómetro y eligiendo ver configuraciones.Haga clic con el botón derecho en la carpeta de configuraciones base en la lista de configuración, elija nueva carpeta y cámbiele el nombre. A continuación, cree una nueva configuración haciendo clic con el botón derecho en la configuración base y copiándola. Haga clic derecho en la nueva carpeta y pegue la configuración base antes de cambiar el nombre de la nueva configuración, Transferencia de método estandarizado"Arrastre el nombre del parámetro, como FETC de la lista de parámetros, al detector 530/30 apropiado, también edite parámetros adicionales a la nueva configuración.Para estandarizar el experimento en el laboratorio de transferencia, ejecute una verificación de rendimiento utilizando esta configuración de citómetro A y realice un seguimiento de las perlas para verificar que el citómetro A esté funcionando bien. Haga clic con el botón derecho en la configuración del citómetro A en la ventana del navegador de software y cree una hoja de trabajo seleccionando la configuración de la aplicación. Luego use una muestra sin teñir para ajustar el tubo fotomultiplicador, o voltajes PMT, del área de dispersión directa, o FSC, y el área de dispersión lateral, o SSC, y todos los parámetros de fluorescencia.Guarde la configuración de la aplicación haciendo clic con el botón derecho en la configuración del citómetro del experimento y seleccionando la configuración de la aplicación. Para agregar controles de compensación automáticamente, haga clic en el botón del experimento y seleccione el menú de configuración de compensación, antes de seleccionar crear controles de compensación. Registre los datos de todas las perlas de control de compensación.Una vez hecho esto, haga clic en el experimento y seleccione la configuración de compensación, calcule la compensación automáticamente, antes de registrar los datos para los controles teñidos de una sola célula. use CD45 RAA APC para modificar el valor de compensación de R7-18 a 15%APC, use CD19 BB700 para modificar el valor de compensación de APC H7 a 14%BB700 y use CD8 R7-18 para modificar el valor de compensación de APC H7 a 60%R7-18. Después de registrar los datos para las perlas CST, cree una hoja de trabajo global de la plantilla de valor objetivo para las perlas brillantes CST, una vez hecho esto, ejecute las muestras en la matriz de citómetros de flujo y recoja 25, 000 linfocitos.Cree una hoja de cálculo global de la plantilla de análisis para las muestras y guarde la plantilla experimental en el citómetro A.Exporte la plantilla experimental utilizando el CD-ROM. Para transferir la plantilla experimental al citómetro B en el laboratorio de pruebas, realice una verificación de rendimiento utilizando perlas CST para verificar que el citómetro B esté funcionando bien. Importe la plantilla experimental del citómetro A y cree un experimento para el citómetro B utilizando la plantilla.Usando el mismo lote de perlas CST, ajuste los voltajes de los parámetros fluorescentes para cada canal de fluorescencia para que coincida con el instrumento MFI anterior. Si es necesario, ajuste el voltaje FSC usando la muestra sin teñir. Haga clic derecho en la configuración del citómetro experimental y seleccione la configuración de la aplicación para guardar la configuración de la aplicación.A continuación, modifique el valor de compensación de R7-18 a 15% APC utilizando CD45 RA APC. Utilice CD19 BB700 para modificar el valor de compensación de APC H7 al 24%BB700. Y use CD8 R7-18 para modificar el valor de compensación de APC H7 al 60%R7-18.Después de la modificación del valor de compensación, ejecute las muestras en el citómetro de flujo B y recoja 25, 000 linfocitos. En una hoja de trabajo global de la plantilla de valor objetivo para la configuración y seguimiento del citómetro, o perlas brillantes CST, se obtuvieron los gráficos de histograma de 10 canales de fluorescencia, el valor objetivo para cada parámetro se mostró mostrando la mediana dentro de las puertas del histograma. los diagramas de puntos de la muestra obtenida utilizando el citómetro A y B después de la estandarización del instrumento, demostraron la consistencia de los datos entre diferentes instrumentos utilizando una plantilla de análisis automático.No se observaron diferencias significativas cuando se compararon los resultados de seis muestras en dos modelos de instrumentos diferentes. Los resultados de 15 subconjuntos linfoides obtenidos de diferentes instrumentos utilizando el método estandarizado adquirieron datos altamente comparables. El mismo nombre de configuración, la creación de la plantilla y la creación de los valores ecotecnológicos de las perlas de seguridad en diferentes instrumentos son pasos críticos en este protocolo.

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