Name: measuring retinal vessel diameter from mouse fluorescent angiography images
Uploaded: 2023-05-19T13:20:00
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Fundo de Pesquisa da Islândia (217796-052) (AGL) e do Fundo Memorial Helga Jónsdóttir e Sigurlidi Kristjánsson (AGL e TE). Os autores agradecem ao Prof. Eiríkur Steingrímsson por fornecer os ratos.

Todos os experimentos foram aprovados pela Autoridade Alimentar e Veterinária da Islândia (licença MAST nº 2108002). Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas e Mitfmi-vga9/+ foram utilizados neste estudo. Camundongos C57BL/6J (n = 7) foram usados como controle. Os tipos selvagens foram obtidos comercialmente (ver...

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	<li>Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retina+to+study+dementia+and+stroke.">Imaging retina to study dementia and stroke.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).</li><li>Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+development+in+health+and+disease.">Retinal vasculature development in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+retinal+vessel+attenuation+in+eyes+with+retinitis+pigmentosa.">Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).</li><li>Eysteinsson, T., Hardarson, S. 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H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microphthalmia-associated+transcription+factor+(Mitf)+gene+and+its+role+in+regulating+eye+function.">The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15386 (2019).</li><li>Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+promoter+use+in+eye+development:+the+complex+role+and+regulation+of+the+transcription+factor+MITF.">Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF.</a> Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).</li><li>Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+induction+by+RANKL+is+critical+for+osteoclastogenesis.">Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).</li><li>Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+development+of+signaling+pathways+inhibitors+of+melanogenesis.">Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis.</a> Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).</li><li>Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+microphthalmia-associated+transcription+factor+(Mitf)+mutations+affect+the+structure+of+the+retinal+vasculature.">Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature.</a> Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).</li><li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+anesthetic+protocols+for+functional+blood+flow+imaging+in+the+rat+eye.">Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005 (2017).</li></ol>

O presente artigo é o primeiro a apresentar um método para analisar o diâmetro dos vasos retinianos e a vasculatura retiniana a partir de imagens de AF de camundongos. Como apenas a imagem do fundo de olho foi utilizada para capturar imagens da vasculatura retiniana, o método apresenta várias desvantagens, uma das quais é que só se pode inferir alterações nas camadas superficiais da vasculatura retiniana nos camundongos examinados neste estudo; Quaisquer diferenças nas camadas mais profundas ainda são desconhe...

Possivelmente, o leito vascular mais pesquisado no corpo é a vasculatura retiniana. Com sofisticação técnica cada vez melhor, a vasculatura retiniana é facilmente fotografada em pacientes vivos e usada em muitos campos de pesquisa1. Além disso, a vasculatura da retina do camundongo durante o desenvolvimento provou ser um sistema modelo muito eficaz para pesquisas sobre a biologia fundamental do crescimento vascular. O objetivo principal da vasculatura retiniana é fornecer suporte metabólico à porção interna da retina por meio de uma malha capilar laminar que permeia o tecido neural2. No entanto, a condição da retina e, conseqüentemente, qualquer disfunção ou atrofia, pode ter efeitos significativos tanto nas bifurcações da vasculatura retiniana quanto no diâmetro das artérias, demonstrando uma interação entre as células da retina e a vasculatura 3,4. Sabe-se que inúmeras doenças oculares, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética (RD), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glaucoma e neovascularização da córnea, podem resultar em angiogênese ocular anormal5. No caso da vasculatura retiniana, os modelos de camundongos com degeneração retiniana geralmente exibem alterações comparáveis às observadas nas doenças vasculares humanas 6,7. A família de supergenes Myc de fatores de transcrição fundamentais hélice-alça-hélice-zíper inclui o gene do fator de transcrição associado à microftalmia (Mitf) expresso no epitélio pigmentar da retina (EPR) 8 , 9 , 10 .
Numerosos órgãos, incluindo olho, ouvido, sistema imunológico, sistema nervoso central, rim, osso e pele, demonstraram ser regulados pelo Mitf 9,11,12,13. Descobrimos que a estrutura e a função do EPR são afetadas em camundongos portadores de várias mutações no gene Mitf, resultando em alguns casos de degeneração da retina e, em última análise, perda de visão10. Recentemente, foi demonstrado que o número de vasos e o diâmetro dos vasos diferem significativamente entre camundongos mutantes Mitf e do tipo selvagem14. Pesquisadores e médicos agora podem quantificar com precisão a vasculatura da retina in vivo devido aos desenvolvimentos da imagem da retina. Desde 1800, pesquisadores e médicos têm aproveitado o benefício de visualizar a vasculatura retiniana, e a angiografia fluoresceínica (AF) mostrou tanto o fluxo sanguíneo retiniano quanto a degradação da barreira hemato-retiniana15.
Este artigo demonstra como analisar o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de FA de camundongos com um código escrito sob medida no software MATLAB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide (Mydriacyl)</td>
			<td>Alcon Inc Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Mydriatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Methocel</td>
			<td>OmniVision Eye Care</td>
			<td></td>
			<td>Hydroxypropryl methylcellulose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Wild type mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chanazine 2% (xylazine)</td>
			<td>Chanelle Animal Health UK</td>
			<td>BN I21322/I</td>
			<td>Anesthesia IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel for Microsoft 365</td>
			<td>Microsoft Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>28803-100G</td>
			<td>Fluorescent angiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab 8.0</td>
			<td>The MathWorks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV rodent fundus camera</td>
			<td>Phoenix-Micron</td>
			<td>40-2200</td>
			<td>Fundus photography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine 10% w/v</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Mydriatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - 100 tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmaplot 13</td>
			<td>Jandel Scientific Software</td>
			<td></td>
			<td>Software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-Ketamine, 25 mg/mL</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>PAA104470</td>
			<td>Anesthesia IP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring retinal vessel diameter from mouse fluorescent angiography images

É importante estudar o desenvolvimento da vasculatura retiniana em retinopatias nas quais o crescimento anormal dos vasos pode levar à perda da visão. Mutações no gene do fator de transcrição associado à microftalmia (Mitf) mostram hipopigmentação, microftalmia, degeneração da retina e, em alguns casos, cegueira. A imagem in vivo da retina do camundongo por meios não invasivos é vital para a pesquisa ocular. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho, a imagem do fundo do olho do camundongo é difícil e pode exigir ferramentas especializadas, manutenção e treinamento. Neste estudo, desenvolvemos um software exclusivo que permite a análise do diâmetro dos vasos retinianos em camundongos com um programa automatizado escrito em MATLAB. As fotografias de fundo de olho foram obtidas com um sistema comercial de câmera de fundo de olho após uma injeção intraperitoneal de uma solução de sal de fluoresceína. As imagens foram alteradas para aumentar o contraste, e o programa MATLAB permitiu extrair o diâmetro vascular médio automaticamente a uma distância pré-definida do disco óptico. As alterações vasculares foram examinadas em camundongos do tipo selvagem e camundongos com várias mutações no gene Mtf , analisando o diâmetro do vaso retiniano. O programa MATLAB personalizado desenvolvido aqui é prático, fácil de usar e permite que os pesquisadores analisem o diâmetro médio e o diâmetro total médio, bem como o número de vasos da vasculatura da retina do camundongo, de forma conveniente e confiável.

A Figura 1 mostra o processo utilizado para analisar a vasculatura retiniana, que é aplicado às imagens FFA de camundongos de todos os camundongos testados. Um raio duas vezes maior que o disco óptico é usado para medir a intensidade dos pixels em uma direção circular no sentido horário a partir do centro do disco óptico. Ele marca pixels com um ponto inicial ou final quando se depara com pontos acima e abaixo de um limite especificado pelo usuário, respectivamente. Isso é repetido...

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Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

A vasculatura da retina de camundongos é particularmente interessante na compreensão dos mecanismos de formação do padrão vascular. Este protocolo mede automaticamente o diâmetro dos vasos retinianos de camundongos a partir de imagens de fundo de angiografia fluorescente a uma distância fixa do disco óptico.

Medindo o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de angiografia fluorescente de camundongo

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Este protocolo fornece um método fácil e confiável para medir automaticamente o diâmetro dos vasos da retina em camundongos anestesiados devido a mutações genéticas ou doenças da retina. A principal vantagem dessa técnica é que o programa MATLAB escrito personalizado aqui é prático, fácil de usar, conveniente e confiável. As alterações no diâmetro dos vasos retinianos geralmente ocorrem em doenças degenerativas como FR e outras condições vasculares da retina.Os modelos de camundongos oferecem informações sobre a eficácia do tratamento e seu impacto nos vasos da retina. O método pode ser potencialmente útil como marcadores clínicos quantificáveis após a progressão de distúrbios vasculares no olho e para monitorar possíveis tratamentos. Para começar, prepare uma seringa com solução de trabalho de fluoresceína e administre-a intraperitonealmente ao animal anestesiado e aplique uma gota de gel de metilcelulose a 2% na superfície da córnea.Em seguida, coloque o animal no estágio de posicionamento do sistema de imagem. Posicione a lente da câmera de fundo de olho de imagem da retina para tocar direta e suavemente a córnea do mouse e ajuste levemente o alinhamento para colocar a cabeça do nervo óptico no meio do campo visual. Em seguida, mude para o canal de fluorescência verde na câmera do fundo do olho e concentre-se nos vasos da retina para tirar as imagens.Capture imagens nos pontos de tempo desejados após a injeção de fluoresceína para determinar o ponto de tempo ideal e visualizar a imagem de fundo de fluoresceína. Primeiro, abra o programa MATLAB. Em seguida, baixe e salve o diâmetro do fundo de olho.código m. Em seguida, abra a pasta de análise da imagem do fundo de olho e arraste e solte o diâmetro do fundo de olho. m na pasta de análise.Arraste e solte uma imagem FFA na pasta de análise de imagem. No programa MATLAB, clique duas vezes no arquivo de código para ativá-lo. Selecione a opção Executar.Um menu pop-up para selecionar a imagem aparecerá. Selecione a imagem e um menu pop-up para parâmetros de análise aparecerá na tela. Defina os parâmetros de análise no menu pop-up e pressione OK. Selecione o centro do disco óptico e, em seguida, selecione a borda do disco óptico.A análise será realizada em segundo plano e os resultados da análise aparecerão na tela. A tabela contém os valores de média, desvio padrão e erro padrão para cada vaso. Salve a tabela.Em seguida, salve a figura com a espessura média definida. Abra a pasta de análise com os arquivos salvos e, em seguida, abra a imagem salva. Abra a tabela salva, copie os valores e cole-os em um arquivo do Excel.Após a injeção de fluoresceína, foram obtidas imagens de um camundongo controle e de um camundongo mutante MITFMI-VGA9/mutante, para os quais a menor distância foi medida do centro do disco óptico aos pontos finais dos vasos no sentido horário. O diâmetro médio do vaso foi obtido em função do número de vasos para os camundongos selvagens e mutantes. As coisas mais importantes a serem lembradas são o posicionamento da câmera do fundo do olho e a centralização do disco óptico na imagem do fundo do olho.Além dessa técnica, técnicas moleculares podem ser realizadas para explorar novos medicamentos, diagnosticar diferentes condições vasculares no olho e entender melhor o funcionamento da vasculatura retiniana.

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