Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

نشكر Beate Nitschke على مساعدتها في تحضير البروتين وروبن غوش ومايكل شفايكرت (شتوتغارت) وماكسيميلان أولبريتش (فرايبورغ) على المناقشات الثاقبة. تم دعم هذا العمل من قبل مركز أبحاث شتوتغارت لبيولوجيا الأنظمة (SRCSB) ومنحة من مؤسسة بادن فورتمبيرغ (BiofMO-6 إلى SN).

نعلن عدم وجود تضارب في المصالح.

يوفر البروتوكول المقدم هنا مقدمة لاستخدام أغشية DIB لدراسة التفاعل بين حركة القناة الأيونية الجانبية ووظيفة القناة باستخدام مجهر TIRF أحادي الجزيء. للحصول على أفضل البيانات الممكنة ، يعد تحضير أغشية DIB المستقرة بأكبر عدد ممكن من القنوات المنفصلة جيدا أمرا بالغ الأهمية للحصول على سلسلة زمنية من الجسيمات الفردية ، والتي يمكن تحليلها بشكل مرض.
تشمل المعلمات الحرجة التي يجب تحسينها اختيار الدهون ، وتركيز الدهون في مرحلة الزيت ، وتركيزات البروتين والمنظفات في القطرات المائية. الليبيدات المستخدمة غير عادية ، لأنها لا تظهر انتقالا واضحا للطور في درجات حرارة منخفضة. DPhPC هو دهون شائعة الاستخدام لإنتاج أنظمة غشاء مستقرة40. من حيث المبدأ ، قد يكون أي دهون تحافظ على بيئتها السائلة في درجات حرارة منخفضة مناسبة لهذا التطبيق. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا تكون الدهون حساسة للأكسدة. يجب أن يكون تركيز المنظف في القطرات منخفضا قدر الإمكان لتجنب تمزق الغشاء. يتم تحقيق الأغشية المستقرة ومعدلات دمج البروتين الجيدة بشكل عام بتركيزات المنظفات التي تقل عن تركيز المذيلة الحرج (cmc) ، نظرا لأن بروتين الغشاء لا يترسب.
إذا كانت أغشية DIB لا تتحمل منظفات معينة21,41 ، أو إذا لم تندمج البروتينات من محلول منظف منخفض في أغشية DIB ، فيمكن أولا إعادة تشكيل قنوات البروتين في حويصلات دهنية صغيرة أحادية الصفيحة (SUVs) ، والتي يتم دمجها بعد ذلك في أغشية DIB من جانب القطرة ، كما هو موضح بنجاح مع E. coli MscL 42 . في بعض الأحيان ، لا تتشكل أغشية DIB لأن تركيز الدهون في مرحلة الزيت منخفض جدا. لمنع أغشية DIB من الانفجار ، يجب على المرء أيضا أن يدرك أن الضغط التناضحي بين الهيدروجيل والقطرة يجب أن يكون متوازنا بدقة دون التأثير على تدفق الكالسيوم2 + من رابطة الدول المستقلة إلى المتحولين بشكل مفرط. يبدو أن سمك الأغاروز الأمثل وحجم الشبكة أمران حاسمان لمراقبة انتشار بروتينات الغشاء. يجب تجنب أي تجفيف لطبقة الأغاروز. يمكن تحديد السماكة باستخدام مجهر القوة الذرية17. من خلال تغيير تركيز الأغاروز وحجمه وسرعة دورانه أثناء طلاء الدوران ، يمكن تحسين حجم الشبكة وسمك الهيدروجيل. لاحظ ، مع ذلك ، أن سمك طبقة الهيدروجيل يؤثر على تباين الصورة. لالتقاط البروتينات الغشائية في DIBs ، يمكن استبدال هيدروجيل الأغاروز بأغاروز مركب خصيصا ، وغير متشابك ، ومعدل Ni-NTA ، ومنخفض الذوبان لاحتجازها عبر His-tag17. غالبا ما تحدث خلفية مضان عالية بشكل مفرط بسبب تمزق أغشية DIB. هذه مشكلة خاصة مع الغرف متعددة الآبار ، حيث تنتشر الصبغة الحساسة للكنسيوم2+ في الهيدروجيل. في هذه الحالة ، يجب تجنب الآبار المجاورة. لا ينبغي أن يكون التبييض الفلوري للصبغة الحساسة للكالسيوم2+ فوق الغشاء عاملا مقيدا كبيرا ، حيث يتم استبداله بأصباغ غير متحمسة في الجزء الأكبر من القطرة (الشكل 3 أ) خارج حقل TIRF المتلاشي. يتم إعطاء دقة توطين البروتين من خلال دقة تركيب البقع وحجم البكسل.
يمكن أن تحدث إشارات مضان ضعيفة بسبب انخفاض تدفق الكالسيوم2+ عبر القناة. تشمل الأسباب المحتملة: (i) إعدادات TIRF غير الدقيقة (على سبيل المثال ، شدة الليزر) ، (ii) ضغط Ca 2+ التناضحي عبر الغشاء ، أو (iii) نفاذية Ca2+ الجوهرية للقنوات منخفضة للغاية. للتعامل مع المشكلة الأولى ، يجب تحسين شدة الليزر وزاوية TIRF وكسب الكاميرا. يمكن التغلب على المشكلتين الأخيرتين من خلال تطبيق جهد كهربائي عبر الغشاء 2,43. ومع ذلك ، فإن تطبيق الفولتية الخارجية يمكن أن يشوه النتيجة ، حيث يمكن أن تؤثر التأثيرات الكهربائية على فتح القناة للقنوات الأيونية ذات البوابات أو الحساسة ميكانيكيا والتي لا يتم التحكم فيها في الواقع بالجهد. ومن الأمثلة على هذه القنوات بروتين الميتوكوندريا TOM-CC27 ، ووحدته الفرعية المكونة للقناة Tom4026،44،45،46. أخيرا ، تجدر الإشارة إلى أن إدخال بروتينات الغشاء في أغشية DIB في اتجاه معين لتحقيق الوظيفة المطلوبة أمر صعب ، والدراسات الكمية نادرة47,48. في بعض الحالات ، يكون اتجاه البروتينات المتكاملة عشوائيا. هذه مشكلة خطيرة لدراسة بروتينات الغشاء ، لأن بعض بروتينات الغشاء يتم تنشيطها على جانب واحد فقط من الغشاء.
الفحص المجهري TIRF هو طريقة قوية لمعالجة أحداث الجزيء الواحد في الأغشية المدعومة المستوية49. ومن الأمثلة على ذلك التجميع وتوضيح مسار الطي لبروتينات القناة مثل α-hemolysin50 و perfringolysin O 51 و OmpG52. تضمنت هذه الدراسات FRET كتقنية إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة تنشيط القناة الأيونية الحساسة ميكانيكيا MscL سابقا عن طريق التحفيز الميكانيكي لطبقات DIBالمزدوجة 42 المدعومة باستخدام القياسات الحالية. بناء على هذا العمل ، يمكن للدراسات المستقبلية الجمع بين المنصة الموصوفة هنا وتجارب FRET أحادية الجزيء لمعالجة القنوات الحساسة ميكانيكيا على مستوى الجزيء الواحد بطريقة بصرية17. يمكن استخدام حقن المخزن المؤقت في القطرة ، أو تمديد الطبقة الأحادية DIB الداخلية ، أو الربط المستهدف للقنوات الفردية بالهيدروجيل الأساسي لمزيد من الدراسة ليس فقط للآلية الفيزيائية للقنوات المنشطة ميكانيكيا ، والتي تستجيب لتوتر الغشاء و / أو الانحناء كما هو موضح في MscL و MscS ، المجال ثنائي المسام K + - القنوات ، TREK-1 ، TREK-2 و TRAAK و PIEZO (للمراجعة ، انظر53) ، ولكن أيضا الارتباط المحلي بالهيكل الخلوي الخلوي ، كما هو موضح للقناة الأيونية الحساسة للمس NOMPC54,55.

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف كيفية دراسة العلاقة بين حركة الغشاء ونفاذية القناة الأيونية للبروتينات الغشائية في الأغشية ثنائية الطبقة ذات السطح البيني (DIB) المدعومة بالبوليمر1،2،3.
تكمل التقنية الحالية مجموعة رائعة من الأدوات التحليلية البصرية والسطحية المتقدمة ، مثل تتبع الجسيمات المفردة4,5 ، والتحليل الطيفي للارتباط الفلوري6,7 ، ومجهر القوة الذرية عالي السرعة 8,9,10. توفر هذه رؤى قيمة حول التركيب الديناميكي وهيكل الأغشية التي تؤثر على التفاعلات القائمة على الغشاء11،12،13. بينما تعتمد الحركة والانتشار الجانبي للبروتينات على الكثافة المحلية للبروتينات في الغشاء ، يمكن أيضا احتجاز جزيئات البروتين الفردية في طوافات الدهون14 وتفاعلات البروتينوالبروتين 15,16. اعتمادا على مجالات البروتين البارزة من الغشاء إلى البيئة خارج الخلية أو العصارة الخلوية ، يمكن أن تختلف حركة البروتين من متحركة للغاية إلى غير متحركة تماما. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد الغشاء وهياكله المحيطية ، غالبا ما يكون من الصعب فك التفاعل بين طبيعة الحركة الجانبية ووظيفة البروتين17.
أثبتت أغشية DIB أنها منصة فعالة لتحليلات الجزيء الأحادي البيوفيزيائي للبروتينات الغشائية18،19،20،21،22. تتشكل عن طريق التجميع الذاتي للدهون من خلال ملامسة القطرات المائية مع ركائز مدعومة بهيدروجيل في مرحلة الدهون / الزيت. على غرار طبقات الدهون الثنائية المدعومة شائعة الاستخدام (SLBs) 1،23،24،25 ، تسمح DIBs بالضبط المحلي للحركة الجانبية عن طريق الارتباط المؤقت أو الدائم للبروتينات بمصفوفة البوليمر عند تشغيلها باستخدام روابط مناسبة17. هذا الأخير يمكن أن يكون بمثابة نظام نموذجي للعمليات الكيميائية الحيوية في أغشية الخلايا مع توزيع البروتين غير المتجانسة10.
يعتمد النهج التجريبي الموصوف هنا على مضان الأصباغ الحساسة للكالسيوم 2+ لقياس تدفق أيون الكالسيوم 2+ من خلال القنوات الفردية على مقربة من الغشاء 2,22 باستخدام مجهر TIRF. يحد هذا النهج البصري من إضاءة العينة إلى مسافة قريبة من الغشاء ، مما يؤدي ، بسبب الخصائص الفيزيائية لضوء الإثارة الزائل ، إلى انخفاض كبير في خلفية التألق. هذا الأخير هو شرط أساسي إذا كانت هناك حاجة إلى دقة مكانية وزمانية عالية للكشف عن جزيئات واحدة. على عكس الطرق الكهربية الكلاسيكية26،27 ، لا يلزم وجود جهد غشائي لدراسة تدفق الأيونات من خلال القنوات الفردية. علاوة على ذلك ، لا تتطلب الطريقة وضع العلامات على أصباغ الفلورسنت أو الجزيئات التي يمكن أن تتداخل مع الحركة الجانبية للقنوات في الغشاء.
هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة قنوات البروتين المضمنة في الغشاء على مستوى الجزيء الواحد دون استخدام الفيزيولوجيا الكهربية الكلاسيكية. باستخدام قناة توصيل بروتين الميتوكوندريا TOM-CC من Neurospora crassa28،29،30 و OmpF ، والتي تدعم انتشار الجزيئات الصغيرة المحبة للماء عبر الغشاء الخارجي للإشريكية القولونية17،31 ، نوضح كيف يمكن دراسة وربط حركات الغشاء وأنشطة القناة للبروتينين. نقترح أن هذا النهج ، على الرغم من تحسينه ل TOM-CC و OmpF ، يمكن تطبيقه بسهولة على قنوات البروتين الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

أظهرت تقنيات التصوير عالية الدقة أن العديد من القنوات الأيونية ليست ثابتة ، ولكنها تخضع لعمليات ديناميكية للغاية ، بما في ذلك الارتباط العابر لتشكيل المسام والوحدات الفرعية المساعدة ، والانتشار الجانبي ، والتجميع مع البروتينات الأخرى. ومع ذلك ، فإن العلاقة بين الانتشار الجانبي والوظيفة غير مفهومة بشكل جيد. للتعامل مع هذه المشكلة ، نصف كيف يمكن مراقبة الحركة الجانبية ونشاط القنوات الفردية في الأغشية الدهنية المدعومة وربطها باستخدام مجهر الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF). يتم تصنيع الأغشية على ركيزة هيدروجيل فائقة النحافة باستخدام تقنية ثنائية الطبقة واجهة القطيرات (DIB). بالمقارنة مع الأنواع الأخرى من الأغشية النموذجية ، تتمتع هذه الأغشية بميزة كونها قوية ميكانيكيا ومناسبة للتقنيات التحليلية شديدة الحساسية. يقيس هذا البروتوكول التدفق الأيوني Ca 2+ من خلال قنوات مفردة من خلال مراقبة انبعاث التألق لصبغة حساسة ل Ca2+ على مقربة من الغشاء. على عكس نهج تتبع الجزيء الواحد الكلاسيكي ، لا يلزم وجود بروتينات أو ملصقات اندماج فلورية ، والتي يمكن أن تتداخل مع الحركة الجانبية والوظيفة في الغشاء. التغييرات المحتملة في تدفق الأيونات المرتبطة بالتغيرات التوافقية للبروتين ناتجة فقط عن الحركة الجانبية للبروتين في الغشاء. يتم عرض النتائج التمثيلية باستخدام قناة نقل بروتين الميتوكوندريا TOM-CC والقناة البكتيرية OmpF. على عكس OmpF ، فإن بوابة TOM-CC حساسة للغاية للحبس الجزيئي وطبيعة الانتشار الجانبي. ومن ثم ، فإن الطبقات الثنائية لواجهة القطيرات المدعومة هي أداة قوية لتوصيف الارتباط بين الانتشار الجانبي ووظيفة القنوات الأيونية.

يكشف التسجيل البصري أحادي القناة الخالي من الأقطاب الكهربائية في الوقت الفعلي عن التفاعل بين حركة البروتين الجانبية ووظيفة القنوات الأيونية الفردية في أغشية DIB. توضح إعادة تكوين مركب TOM الأساسي للميتوكوندريا (الشكل 1 أ) في غشاء DIB (الشكل 4 د) وجود علاقة زمنية قوية بين الحركة الجانبية ونفاذية الأيونات (الشكل 5 أ). يبدو أن بوابة TOM-CC حساسة لوضع الحركة الجانبية17. تظهر القنوات المتحركة تدفق Ca2+ من خلال مسامها وشدة نقطة التألق العالية. تظهر الجزيئات المحاصرة غير المتحركة شدة مضان منخفضة ومتوسطة. بالنسبة لمسام استيراد البروتين العامة للميتوكوندريا TOM-CC ، كشف نهج الجزيء الفردي هذا عن وجود علاقة زمنية قوية بين الحركة الجانبية ونفاذية الأيونات ، مما يشير إلى أن قناة TOM-CC لها خصائص حساسة ميكانيكيا17. يرافق التوقف الجانبي لجزيئات TOM-CC المتحركة بحرية إغلاق جزئي أو كامل لقناة TOM-CC. لا يظهر تصوير أغشية DIB باستخدام OmpF (الشكل 1E والشكل 4F) ، والذي يتم تضمينه بالكامل تقريبا في الغشاء ، أي تأثيرات توقف وانطلاق (الشكل 5B). لا ترتبط التوقفات العشوائية ل OmpF بتغيير في شدتها ، وبالتالي بإغلاق مسامها. بناء على إشارات التألق38 ، يمكن تقدير الدقة الموضعية للقنوات الفردية في النطاق بين 5 و 10 نانومتر. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن تحقيق هذه الدقة إذا كانت القنوات تتأرجح قليلا بسبب التثبيت المتحرك مع هيدروجيل الأغاروز ، كما هو موضح ، على سبيل المثال ، لجزيئات TOM-CC في حالة وسيطة مع إزاحة جذر متوسط 120 نانومتر (الشكل 5 أ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> الشكل 1: عزل TOM-CC. (أ) هيكل Cryo EM ل N. crassa TOM-CC30,39. تم إذابة الميتوكوندريا من سلالة N. crassa التي تحتوي على Tom22 مع علامة 6xHis في DDM وخضعت لكروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA (B) وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون (C). (د) SDS-PAGE من TOM-CC المعزولة. (ه) البنية البلورية (PDB ، 1OPF) و (F) SDS-PAGE من الإشريكية القولونية المنقاة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> الشكل 2: مخطط انسيابي لتجميع غرفة PMMA. الخطوة 1: غطاء زجاجي مغطى بالدوران بهيدروجيل أغاروز. الخطوة 2: يتم تركيب غطاء الغطاء المطلي بالدوران في غرفة مجهر PMMA مصنوعة خصيصا. الخطوة 3: يضاف أغاروز إضافي منخفض الذوبان إلى منفذ مدخل غرفة PMMA على لوح تسخين 35 درجة مئوية. الخطوة 4: تتشكل أحاديات الدهون حول قطرات مائية عند واجهة عازلة / زيتية (يسار) وعلى واجهة هيدروجيل / زيت الأغاروز (يمين). الخطوة 5: يتم سحب قطرات مائية فردية في آبار غرفة PMMA لتشكيل طبقة ثنائية دهنية عند ملامسة الطبقتين الأحاديتين من الدهون. الخطوة 6: يتم التحقق من صحة تكوين أغشية DIB بواسطة مجهر تباين تعديل هوفمان. الخطوة 7: يتم الحصول على صور لمناطق مختارة من أغشية DIB مع قنوات أيونية مدرجة بواسطة مجهر TIRF. أخضر: 0.75٪ أغاروز ؛ الأصفر: 2.5٪ أغاروز يحتوي على أيونات الكالسيوم2+ ؛ أرجواني: مرحلة الدهون / الزيت. أزرق غامق: محلول قطرات مائي يحتوي على صبغة وبروتين حساس للكنسيوم2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> الشكل 3: الإعداد التجريبي. (أ) التمثيل التخطيطي لغشاء DIB في بئر PMMA. ترتكز الطبقة الثنائية على فيلم أغاروز فائق النحافة بنسبة 0.75٪ للسماح بتصوير TIRF لتدفق الكالسيوم 2+ من خلال قناة أيونية بمرور الوقت باستخدام صبغة مضان حساسة للكنسيوم 2+ (Fluo-8) في trans. (ب) يتم التحكم في تدفق الكالسيوم2+ حصريا عن طريق الضغط الأسموزي من رابطة الدول المستقلة إلى عبر. هذا يسمح لكل من تحديد الموضع في الغشاء والحالة المفتوحة والمغلقة للقناة. القناة الموضحة هنا هي القناة الموصلة للبروتين TOM-CC ل N. crassa mitochondria30. (ج) مسار قناة TOM-CC واحدة. الأخضر: قناة متحركة. الأصفر: قناة غير متحركة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> الشكل 4: تصوير TOM-CC و OmpF في أغشية DIB. (أ) غشاء DIB تم تصويره بواسطة مجهر تباين تعديل هوفمان الذي يوضح منطقة التلامس ثنائية الطبقة بين الهيدروجيل والقطرة. (ب) غشاء DIB مكسور مصور كما في (A). السهم ، حافة غرفة PMMA. (C) غشاء DIB تم تصويره بواسطة مجهر TIRF بدون قنوات بروتينية. (D) غشاء DIB مع TOM-CC المعاد تشكيله ، تم تصويره بواسطة مجهر TIRF. تشير المربعات البيضاء إلى بقع عالية (SH) ومتوسطة (SI) ومنخفضة (SL). (ه) يكشف تركيب ملف تعريف شدة التألق للنقاط الثلاث المحددة في (A) إلى وظائف Gaussian ثنائية الأبعاد عن موضع TOM-CCs الفردية وتدفق Ca2+ عبر القناة. (F) غشاء DIB مع OmpF المعاد تشكيله. (ز) الملاءمة الغاوسية للبقعة الفلورية المشار إليها ب (F). على عكس مركب البروتين المكون من β برميل ثنائي المسام TOM-CC ، يكشف OmpF ثلاثي المسام β برميل عن حالة نفاذية واحدة فقط. حجم بكسل ، 0.16 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> الشكل 5: يرتبط نشاط القناة بالحركة الجانبية ل TOM-CC. (أ) يشير تتبع سعة الفلورسنت (أعلى) والمسار المقابل (أسفل) ل TOM-CC إلى أن نشاط القناة المفتوحة والمغلقة ل TOM-CC يرتبط بحركة الغشاء الجانبي للمجمع. يعرض المسار ثلاث حالات نفاذية. الأخضر: حالة مفتوحة بالكامل ؛ الأصفر: حالة نفاذية وسيطة ؛ الأحمر: حالة القناة المغلقة ؛ النجمة الحمراء: يتذبذب TOM-CC في الحالة المتوسطة حول موقعه المتوسط بحوالي ±60 نانومتر. تتراوح الدقة الموضعية37 بناء على إشارات التألق في الحالات المفتوحة والوسيطة بالكامل بين 5 نانومتر و 10 نانومتر. (B) تتبع سعة الفلورسنت (أعلى) والمسار المقابل (أسفل) ل OmpF. يكشف OmpF عن مستوى شدة واحد فقط ، بغض النظر عما إذا كان في حالة حركة أو محاصر. يتم تمييز أجزاء المسار المقابلة للفترات الزمنية للجزيئات المحاصرة باللون الرمادي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مخزن مؤقت </td>
			<td colspan="3">تركيزات الكاشف</td>
			<td>حجم</td>
		</tr><tr><td>أ1*</td>
			<td colspan="3">20 مللي مول Tris-HCl pH 8.5 ، 0.1٪ (وزن / حجم) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ، 10٪ (v / v) جلسرين ، 300 مللي مول كلوريد الصوديوم ، و 1 مللي مول فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td>أ2*</td>
			<td colspan="3">20 مللي مول Tris-HCl pH 8.5 ، 0.1٪ (وزن / حجم) DDM ، 10٪ (v / v) جلسرين ، 1 M إيميدازول و 1 mM PMSF</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td>ب1*</td>
			<td colspan="3">20 مللي متر HEPES درجة الحموضة 7.2 ، 0.1٪ (وزن / حجم) DDM ، 2٪ (v / v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td>ب2*</td>
			<td colspan="3">20 مللي متر HEPES درجة الحموضة 7.2 ، 0.1٪ (وزن / حجم) DDM ، 1 M KCl ، 2٪ (v / v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)</td>
			<td>100 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* قم بإزالة الغازات وتمر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: حلول المخزن المؤقت لعزل TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مخزن مؤقت </td>
			<td colspan="3">تركيزات الكاشف</td>
			<td>حجم</td>
		</tr><tr><td>رطل*</td>
			<td colspan="3">1٪ (وزن / حجم) التربتون، 1٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم و 0.5٪ (ث / حجم) استخراج الخميرة</td>
			<td>1100 مل</td>
		</tr><tr><td>ج1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2 ، و ~ 750 وحدة DNAse و 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>20 مل</td>
		</tr><tr><td>ج2</td>
			<td colspan="3">50 مللي متر Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5</td>
			<td>50 مل</td>
		</tr><tr><td>ج3</td>
			<td colspan="3">4٪ (وزن / حجم) كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 2 مللي مول β-ميركابتوإيثانول و 50 مللي متر تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5</td>
			<td>50 مل</td>
		</tr><tr><td>ج4</td>
			<td colspan="3">2٪ (وزن / حجم) SDS ، 500 مللي مول كلوريد الصوديوم و 50 مللي متر Tris-HCl درجة الحموضة 7.5</td>
			<td>50 مل</td>
		</tr><tr><td>ج5</td>
			<td colspan="3">0.5٪ (وزن / حجم) أوكتيل بولي أوكسي إيثيلين (أوكتيل POE) ، 1 مللي متر EDTA و 20 مللي متر تريس درجة الحموضة 8.5</td>
			<td>1000 مل</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* تعقيم قبل الاستخدام.</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: حلول المخزن المؤقت لعزل OmpF.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام مجهر TIRF لتتبع القنوات الأيونية الفردية وتحديد نشاطها في الأغشية الدهنية المدعومة ، وبالتالي تحديد التفاعل بين حركة الغشاء الجانبي ووظيفة القناة. يصف كيفية تحضير الأغشية وتسجيل البيانات وتحليل النتائج.

تصوير أحادي الجزيء للحركة الجانبية ونشاط القناة الأيونية في طبقات الدهون المزدوجة باستخدام المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

القنوات الأيونية ليست ثابتة في الأغشية البيولوجية. نقدم هنا نهجا بصريا لجزيء واحد لكشف العلاقة بين انتشار الغشاء الجانبي ووظيفة القناة الأيونية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى هي أن وضع العلامات الفلورية للبروتينات التي قد تتداخل مع حركتها الجانبية ووظيفتها غير مطلوب.يمكن تطبيق الطريقة على أي قناة بروتين غشائية حيث يكون الانتشار الحر أو المقيد مهما للتنظيم والوظيفة. للبدء ، قم بنقل 380 ميكرولترا من محلول مخزون DPhPC إلى قنينة زجاجية ، وقم بتراكب محلول مخزون الدهون مع الأرجون أو غاز النيتروجين لمنع أكسدة الدهون. استخدم أقل تدفق ممكن للغاز لتجنب تبخر المذيب العضوي الذي تذوب فيه الدهون ، أو رش بخاخات المذيبات من القارورة.جفف عينة الدهون تحت تيار من النيتروجين وقم بإزالة المذيب العضوي المتبقي من عينة الدهون تحت الفراغ باستخدام مضخة تفريغ خالية من الزيت طوال الليل. قم بإذابة طبقة الدهون في محلول زيت سيليكون سداسي الديكان عن طريق إضافة كميات متساوية من سداسي ديكان وزيت السيليكون باستخدام ماصة ملليلتر واحد إلى تركيز دهون نهائي قدره 9.5 ملليجرام لكل ملليلتر. ضع بعض أغطية الزجاج في حامل انزلاق من الفولاذ المقاوم للصدأ وقم بتنظيفها في دورق زجاجي لمدة 10 دقائق باستخدام الأسيتون في منظف بالموجات فوق الصوتية.شطف أغطية بالماء منزوع الأيونات المزدوج وجففها تحت تيار من النيتروجين. علاوة على ذلك ، قم بتنظيف الغطاء وتحويله إلى منظف بلازما بالأكسجين لمدة خمس دقائق. قم بتركيب غطاء معالج بالبلازما على طبقة دوارة وقم بتغطية غطاء الغطاء بطبقة بسمك دون ميكرومتر من الأغاروز عن طريق إضافة 140 ميكرولترا ببطء من الأغاروز منخفض الانصهار بنسبة 0.75٪ مع ماصة 200 ميكرولتر عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.قم بتوصيل الغطاء المطلي بالدوران على الفور بطبقة رقيقة من هيدروجيل الأغاروز إلى الجانب السفلي من غرفة PMMA. تأكد من أن هيدروجيل الأغاروز يشير إلى الأعلى. ثبت حواف غطاء الغطاء على جهاز PMMA الصغير بشريط لاصق شفاف ، وضع الجهاز على صفيحة ساخنة يتم تسخينها إلى 35 درجة مئوية.صب بعناية 200 ميكرولتر من محلول الأغاروز 2.5 ٪ في مدخل الغرفة دون خلق فقاعات الهواء. قم على الفور بتغطية آبار غرفة PMMA بحوالي 60 ميكرولترا من محلول زيت الدهون لبدء تكوين طبقة أحادية الطبقة الدهنية عند واجهة زيت الأغاروز لتجنب جفاف الأغاروز المغلف بالدوران في آبار غرفة PMMA. ضع الجهاز على طبق ساخن عند 35 درجة مئوية لمدة ساعتين تقريبا.ضع حوالي 20 ميكرولترا من محلول زيت السيليكون سداسي ديكان الدهني في كل من الآبار العديدة المصنعة في غرفة حضانة القطيرات. قم بإعداد إبرة زجاجية ذات شعيرات دقيقة بقطر فتحة طرف يبلغ حوالي 20 ميكرومتر باستخدام مجتذب ماصة دقيقة رأسي أو أفقي. املأ الإبرة بحوالي خمسة ميكرولترات من محلول الحقن المائي الذي يحتوي على 8.8 مللي مولار HEPES ، وسبعة ميكرومولار من صبغة الفلورسنت ، و Fluo-8 ، و 400 ميكرومولار EDTA ، و 1.32 كلوريد البوتاسيوم المولي و 30 مركب TOM الأساسي النانوي أو بدلا من ذلك 20 nanomolar OMPF.قم بتركيب الإبرة بمحلول الحقن المائي على حاقن نانوي يحركه بيزو وقم بحقن 100 إلى 200 نانولتر من القطرات المائية في الآبار في غرفة حضانة القطيرات المملوءة بمحلول زيت السيليكون سداسي ديكاني الدهون باستخدام الحاقن النانوي. السماح بتكوين طبقة أحادية دهنية عند واجهة زيت القطيرات لمدة ساعتين تقريبا عن طريق الحفاظ على PMMA وغرف حضانة القطيرات على صفيحة ساخنة يتم تسخينها إلى 35 درجة مئوية. قم بنقل القطرات المائية الفردية يدويا من آبار غرفة حضانة القطيرات إلى آبار غرفة PMMA باستخدام ماصة ميكرولتر أحادية القناة مع طرف بولي بروبيلين يمكن التخلص منه سعة 10 ميكرولتر.اسمح للقطرات بالغرق على الطبقات الأحادية الدهنية عند واجهات زيت الهيدروجيل لتشكيل طبقة ثنائية دهنية بين القطرات وهيدروجيل الأغاروز. قم بتركيب غرفة PMMA باستخدام أغشية ثنائية الطبقة أو DIB لواجهة القطيرات على حامل العينة لمجهر ضوئي مقلوب ، وقم بتقييم تكوين الغشاء باستخدام هدف تباين تعديل هوفمان 10x. إذا تشكلت أغشية DIB ، فقم بتركيب غرفة PMMA على حامل عينة مجهر TIRF المجهز بمصدر ضوء تقليدي لإضاءة التألق ، وليزر 488 نانومتر ، وكاميرا CCD مضرة بالإلكترون الخلفي لتحقيق حجم بكسل يبلغ حوالي 0.16 ميكرومتر.ركز حافة غشاء DIB بهدف تكبير 10x تحت إضاءة التألق مع مصدر ضوء عالي الكثافة باستخدام مجموعة مرشح GFP. قم بالتركيز الدقيق على نفس حافة غشاء DIB عند التكبير العالي باستخدام هدف TIRF لزيت 100x NA 1.49 ، مرة أخرى تحت إضاءة التألق مع مصدر ضوء عالي الكثافة باستخدام مجموعة مرشح GFP. قم بتغيير إعداد المرشح من GFP إلى مجموعة مرشح TIRF رباعية النطاق ، وقم بتشغيل ليزر 488 نانومتر ، واضبط شدة الليزر على العدسة الموضوعية.لتصور القنوات الأيونية المفردة ، اضبط زاوية TIRF وكسب كاميرا EM CCD بحيث تظهر القنوات الأيونية المفتوحة في غشاء DIB كبقع فلورية عالية التباين على خلفية داكنة ، وتصل نسبة الإشارة إلى الخلفية إلى الحد الأقصى. تأكد من أن البقع المقابلة لتدفق أيونات الكالسيوم من خلال قنوات الأيونات المفردة تظل في بؤرة التركيز ولها شكل دائري بكثافة عالية في المركز وتتناقص تدريجيا نحو المحيط. تأكد من أن البقع الفلورية في بؤرة التركيز للتأكد من أن القنوات الأيونية قد أعيد تشكيلها في أغشية DIB وتتحرك بشكل جانبي في مستوى الغشاء.أخيرا ، سجل سلسلة من الصور الغشائية التي تسمح بالتتبع المناسب للموضع ومراقبة الحالة المفتوحة والمغلقة للقنوات الأيونية الفردية. لتحديد نوع الحركة الجانبية وحالة نشاط القناة ، احصل على مسارات طويلة بما فيه الكفاية وعينات جيدة. يظهر هنا هيكل Cryo EM ل Neurospora crassa TOM-CC.تم إذابة الميتوكوندريا من صبغة N.crassa التي تحتوي على TOM 22 مع علامة 6-His في DDM وخضعت لكروماتوغرافيا تقارب النيكل NTA وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون. يتم عرض SDS-PAGE للهيكل البلوري المعزول TOM-CC و SDS-PAGE من E.coli OMPF المنقى المستخدم للمقارنة هنا. يشير تتبع سعة الفلورسنت في المسار المقابل ل TOM-CC إلى أن نشاط القناة المفتوحة والمغلقة ل TOM-CC يرتبط بحركة الغشاء الجانبي للمجمع.يعرض تتبع السعة ثلاث حالات نفاذية: حالة مفتوحة بالكامل تتوافق مع القنوات المتحركة وحالة النفاذية المتوسطة وحالة القناة المغلقة المقابلة للقنوات غير المتحركة. يتذبذب TOM-CC في الحالة المتوسطة حول موقعه المتوسط بحوالي زائد / ناقص 60 نانومتر. يظهر هنا تتبع سعة الفلورسنت في المسار المقابل ل OMPF.يكشف OMPF عن مستوى شدة واحد فقط مقارنة ب TOM-CC ، بغض النظر عما إذا كان في حالة حركة أو محاصرا. يتم تمييز أجزاء المسار المقابلة للفترات الزمنية للجزيئات المحاصرة باللون الرمادي. أحد الأشياء المهمة التي يجب ملاحظتها هو أن هذه الطريقة تحلل بروتينات الغشاء الواحد في بيئة غشاء سليمة.ستبقى ديناميكيات البروتينات الغشائية أفقا للدراسات العلمية في المستقبل المنظور. نتوقع أن تساهم طريقتنا في هذا المجال بشكل كبير.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

عاليه الانتاجيه الكلي الداخلية انعكاس الفلورية والتوجيه العشوائي البصرية أعاده البناء المجهري باستخدام رقاقه فوتوسونيك

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...