Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

我们感谢Beate Nitschke在蛋白质制备方面的帮助，感谢Robin Ghosh，Michael Schweikert（斯图加特）和Maximilan Ulbrich（弗莱堡）的深刻讨论。这项工作得到了斯图加特研究中心系统生物学（SRCSB）和巴登符腾堡基金会（BiofMO-6至SN）的资助。

我们声明没有利益冲突。

这里介绍的方案介绍了使用DIB膜使用单分子TIRF显微镜研究横向离子通道运动和通道功能之间的相互作用。为了获得最佳数据，制备具有尽可能多的分离良好通道的稳定DIB膜对于获得可以令人满意地分析的单个颗粒的时间序列至关重要。
需要优化的关键参数包括脂质的选择、油相中的脂质浓度以及水滴中的蛋白质和洗涤剂浓度。所使用的脂质是不寻常的，因为它们在低温下没有明显的相变。DPhPC是一种常用的脂质，用于产生稳定的膜系统40。原则上，任何在低温下保持其流体环境的脂质都可能适用于此应用。此外，脂质不应对氧化敏感。液滴中的洗涤剂浓度应尽可能低，以避免膜破裂。鉴于膜蛋白不会沉淀，当洗涤剂浓度低于临界胶束浓度（CMC）时，通常可以获得稳定的膜和良好的蛋白质掺入率。
如果DIB膜不能耐受特定的去垢剂21，41，或者如果蛋白质不能从低去垢剂溶液整合到DIB膜中，则蛋白质通道可以首先重组为小的单层脂质囊泡（SUV），然后将其从液滴侧融合到DIB膜上，如大肠杆菌MscL 42的成功所示.有时，DIB膜不会形成，因为油相中的脂质浓度太低。为了防止DIB膜破裂，还应注意水凝胶和液滴之间的渗透压必须精确平衡，而不会影响从顺式到反式的Ca2+通量。优化的琼脂糖厚度和网孔尺寸似乎是观察膜蛋白扩散的关键。应避免琼脂糖层的任何干燥。厚度可以使用原子力显微镜17确定。通过在旋涂过程中改变琼脂糖浓度、体积和旋转速度，可以优化水凝胶的网孔尺寸和厚度。但请注意，水凝胶层厚度会影响图像对比度。为了捕获DIB中的膜蛋白，琼脂糖水凝胶可以用定制合成的，非交联的，Ni-NTA修饰的低熔点琼脂糖代替，以通过His-tag17捕获它们。过高的荧光背景通常是由DIB膜破裂引起的。这对于多孔室来说尤其是一个问题，因为Ca2+敏感的染料会扩散到水凝胶中。在这种情况下，应避免相邻的井。膜上方的Ca2+敏感染料的荧光漂白不应成为显着的限制因素，因为它被TIRF倏逝场外的大部分液滴中的未激发染料交换（图3A）。蛋白质的定位精度由拟合斑点的精度和像素大小给出。
微弱的荧光信号可能是由通过通道的低Ca2+通量引起的。可能的原因包括：（i）TIRF设置不准确（例如，激光强度），（ii）穿过膜的渗透压Ca 2+，或（iii）通道的固有Ca2+渗透性太低。为了应对第一个问题，需要优化激光强度、TIRF 角度和相机增益。后两个问题可以通过在膜2，43上施加电势来克服。然而，施加外部电压可能会扭曲结果，因为电效应会影响实际上不受电压控制的配体门控或机械敏感离子通道的通道打开。这种通道的例子是线粒体蛋白转位酶TOM-CC 27，及其通道形成亚基Tom4026，44，45，46。最后，应该注意的是，将膜蛋白以特定方向插入DIB膜以实现所需的功能是棘手的，定量研究很少47，48。在某些情况下，整合蛋白的方向是随机的。对于研究膜蛋白来说，这是一个严重的问题，因为某些膜蛋白仅在膜的一侧被激活。
TIRF显微镜是解决平面支撑膜中单分子事件的强大方法49。示例包括通道蛋白（如α-溶血素50、全鞘溶素 O51 和 OmpG52）的组装和折叠途径阐明。这些研究包括FRET作为附加技术。此外，机械敏感离子通道MscL的激活先前已通过使用电流测量对支持的DIB双层42 进行机械刺激进行了研究。基于这项工作，未来的研究可以将这里描述的平台与单分子FRET实验相结合，以光学方式解决单分子水平的机械敏感通道17。将缓冲液注入液滴中，拉伸内部DIB单层，或将单个通道靶向结合到下面的水凝胶，不仅可以用于进一步研究机械激活通道的物理机制，其响应膜张力和/或曲率，如MscL和MscS所示，双孔结构域K+通道，TREK-1， TREK-2和TRAAK和PIEZO（用于审查，参见53），但也与细胞骨架局部结合，如触摸敏感离子通道NOMPC54，55所示。

本协议旨在描述如何研究聚合物支持的液滴界面双层（DIB）膜中膜蛋白的膜迁移率和离子通道通透性之间的相关性1，2，3。
目前的技术补充了一系列令人印象深刻的先进光学和表面分析工具，如单粒子跟踪4，5，荧光相关光谱6，7和高速原子力显微镜8，9，10。这些为影响基于膜的反应的膜的动态组成和结构提供了宝贵的见解11，12，13。虽然蛋白质的运动和横向扩散取决于膜中蛋白质的局部密度，但单个蛋白质分子也可以被困在脂筏14和蛋白质-蛋白质相互作用15，16中。根据从膜突出到细胞外环境或细胞质中的蛋白质结构域，蛋白质迁移率可以从高度移动到完全不动不动不等。然而，由于膜及其外围结构的复杂性，通常很难破译横向移动性的性质与蛋白质功能之间的相互作用17。
DIB膜已被证明是膜蛋白18，19，20，21，22的生物物理单分子分析的有效平台。它们通过水滴与脂质/油相中的水凝胶支撑底物接触而通过脂质自组装而形成。与常用的负载脂质双层（SLB）1，23，24，25类似，当用合适的配体17官能化时，DIB允许通过将蛋白质暂时或永久结合到聚合物基质来局部调节横向迁移率。后者可以作为具有异质蛋白质分布的细胞膜中生化过程的模型系统10。
这里描述的实验方法依赖于Ca 2+敏感染料的荧光，使用TIRF显微镜测量通过靠近膜2，22的各个通道的Ca2+离子通量。这种光学方法将样品的照明限制在靠近膜的距离内，由于倏逝激发光的物理性质，这导致荧光背景显着降低。如果检测单个分子需要高空间和时间分辨率，后者是先决条件。与经典的电生理方法26，27相比，不需要膜电压来研究通过单个通道的离子通量。此外，该方法不需要用荧光染料或分子标记，这些染料或分子可能会干扰膜中通道的横向移动。
该方法对于在不使用经典电生理学的情况下在单分子水平上研究嵌入膜中的蛋白质通道特别有用。使用来自神经孢子虫28，29，30 的线粒体蛋白传导通道 TOM-CC 和 OmpF，其支持小亲水分子在大肠杆菌17，31 外膜上的扩散，我们说明了如何研究和关联两种蛋白质的膜迁移率和通道活性。我们建议这种方法虽然针对TOM-CC和OmpF进行了优化，但可以很容易地应用于其他蛋白质通道。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

高分辨率成像技术表明，许多离子通道不是静态的，而是受到高度动态过程的影响，包括孔形成和辅助亚基的瞬时结合、横向扩散以及与其他蛋白质的聚集。然而，对横向扩散与功能之间的关系知之甚少。为了解决这个问题，我们描述了如何使用全内反射荧光（TIRF）显微镜监测和关联支持的脂质膜中单个通道的横向移动性和活性。膜使用液滴界面双层（DIB）技术在超薄水凝胶基板上制造。与其他类型的模型膜相比，这些膜具有机械坚固的优点，适用于高灵敏度的分析技术。该协议通过观察靠近膜的Ca 2 +敏感染料的荧光发射来测量通过单通道的Ca2 +离子通量。与经典的单分子示踪方法相比，不需要荧光融合蛋白或标记物，这些蛋白或标记物会干扰膜中的横向运动和功能。与蛋白质构象变化相关的离子通量的可能变化仅是由于蛋白质在膜中的横向运动。使用线粒体蛋白易位通道TOM-CC和细菌通道OmpF显示代表性结果。与OmpF相反，TOM-CC的门控对分子约束和横向扩散的性质非常敏感。因此，支持的液滴界面双层是表征横向扩散与离子通道功能之间联系的有力工具。

实时无电极光学单通道记录揭示了横向蛋白质运动与DIB膜中单个离子通道功能之间的相互作用。将线粒体TOM核心复合物（图1A）重建为DIB膜（图4D）说明了横向迁移率和离子渗透性之间的强烈时间相关性（图5A）。TOM-CC门控似乎对横向运动模式敏感17。移动通道显示Ca2+通量通过其孔和高荧光点强度。捕获的非移动分子显示出低和中等荧光强度。对于线粒体TOM-CC的一般蛋白质导入孔，这种单分子方法揭示了横向迁移率和离子渗透性之间的强时间相关性，表明TOM-CC通道具有机械敏感特性17。自由移动的TOM-CC分子的横向停止伴随着TOM-CC通道的部分或完全闭合。使用OmpF对DIB膜进行成像（图1E和图4F），几乎完全嵌入膜中，没有停止效应（图5B）。OmpF的随机停止与强度的变化无关，因此与其孔的闭合无关。基于荧光信号38，可以在5至10nm的范围内估计各个通道的位置精度。然而，应该注意的是，如果通道由于琼脂糖水凝胶的移动锚定而轻微摆动，则无法达到此精度，例如，对于处于中间状态的TOM-CC分子，根均位移为120nm（图5A）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> 图 1：TOM-CC 的分离。 （A） N. crassa TOM-CC30，39 的冷冻电镜结构。来自含有具有6xHis标签的Tom22的N. crassa菌株的线粒体在DDM中溶解并接受Ni-NTA亲和色谱（B）和阴离子交换色谱（C）。（D） 孤立的TOM-CC的SDS-PAGE。（E）纯化大肠杆菌OmpF的晶体结构（PDB，1OPF）和（F）SDS-PAGE。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> 图 2：PMMA 腔室组件的流程图。步骤1：用琼脂糖水凝胶旋转涂覆玻璃盖玻片。步骤2：将旋涂盖玻片安装在定制的PMMA显微镜室中。步骤3：将额外的低熔点琼脂糖添加到35°C热板上PMMA室的入口口中。步骤4：在缓冲液/油界面（左）和琼脂糖水凝胶/油界面（右）的水滴周围形成脂质单层。步骤5：将单个水滴移液到PMMA室的孔中，在两个脂质单层接触时形成脂质双层。步骤6：通过霍夫曼调制对比显微镜验证DIB膜的形成。步骤7：通过TIRF显微镜获取具有插入离子通道的DIB膜选定区域的图像。绿色： 0.75% 琼脂糖;黄色：含有Ca 2+离子的2.5%琼脂糖;洋红色：脂质/油相;深蓝色：含有Ca2+敏感染料和蛋白质的水滴缓冲液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> 图3：实验设置。 （A）PMMA孔中DIB膜的示意图。双层位于0.75%琼脂糖薄膜上，允许使用反式Ca 2+敏感荧光染料（Fluo-8）随着时间的推移通过离子通道对Ca2+通量进行TIRF成像。（B）Ca2+通量完全由顺式到反式的渗透压控制。 这既可以确定膜中的位置，也可以确定通道的开闭状态。这里显示的通道是N. crassa mitochondria30的蛋白质传导通道TOM-CC。（C） 单个 TOM-CC 通道的轨迹。绿色：移动通道;黄色：非移动通道。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> 图 4：DIB 膜中的 TOM-CC 和 OmpF 成像。 （A） 通过霍夫曼调制对比显微镜成像的 DIB 膜，显示水凝胶和液滴之间的双层接触面积。（B）破损的DIB膜成像如（A）所示。箭头，PMMA室的边缘。（C）通过TIRF显微镜成像的DIB膜，没有蛋白质通道。（D）具有重构TOM-CC的DIB膜，通过TIRF显微镜成像。白色方块标记高（SH），中（SI）和低（SL）强度的斑点。（E）将（A）中标记的三个点的荧光强度分布拟合到二维高斯函数中，可以揭示单个TOM-CC的位置和通过通道的Ca2+通量。（F）具有重组OmpF的DIB膜。（G）（F）中标记的荧光斑点的高斯拟合。与双孔β桶蛋白复合物TOM-CC相比，三孔β桶OmpF仅显示一种渗透状态。像素尺寸，0.16 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> （A）TOM-CC的荧光幅度迹线（顶部）和相应的轨迹（底部）表明TOM-CC的开闭通道活性与复合物的侧向膜迁移率相关。轨迹显示三种渗透率状态。绿色：完全打开状态;黄色：中等渗透性状态;红色：闭合通道状态;红星：处于中间状态的TOM-CC在其平均位置周围摆动约±60 nm。基于全开和中间状态下的荧光信号的位置精度37范围在5 nm和10 nm之间。（B）OmpF的荧光幅度迹线（顶部）和相应的轨迹（底部）。OmpF仅显示一个强度级别，无论它是在运动中还是被困。对应于捕获分子时间段的轨迹段标记为灰色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>缓冲区 </td>
			<td colspan="3">试剂浓度</td>
			<td>卷</td>
		</tr><tr><td>答1*</td>
			<td colspan="3">20 mM 三盐酸 pH 8.5、0.1 % （w/v） 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 （DDM）、10% （v/v） 甘油、300 mM 氯化钠和 1 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF）</td>
			<td>100毫升</td>
		</tr><tr><td>答2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5、0.1% （w/v） DDM、10% （v/v） 甘油、1 M 咪唑和 1 mM PMSF</td>
			<td>100毫升</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 毫米HEPES pH 7.2，0.1%（w/v）DDM，2%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）</td>
			<td>100毫升</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2， 0.1% （w/v） DDM， 1 M KCl， 2% （v/v） 二甲基亚砜 （DMSO）</td>
			<td>100毫升</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* 使用前脱气并通过 0.22 μm 过滤器。</td>
		</tr></tbody></table>表 1：用于 TOM-CC 隔离的缓冲溶液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>缓冲区 </td>
			<td colspan="3">试剂浓度</td>
			<td>卷</td>
		</tr><tr><td>磅*</td>
			<td colspan="3">1%（w/v）胰蛋白胨，1%（w/v）NaCl和0.5%（w/v）酵母提取物</td>
			<td>1100毫升</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM 氯化镁2 和 ~750 单位 DNA 酶和 50 mM 三盐酸 pH 7.5</td>
			<td>20毫升</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 毫米三盐酸，pH 7.5</td>
			<td>50毫升</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% （w/v） 十二烷基硫酸钠 （SDS）、2 mM β-巯基乙醇和 50 mM 三盐酸 pH 7.5</td>
			<td>50毫升</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2% （w/v） SDS、500 mM 氯化钠和 50 mM 三盐酸 pH 7.5</td>
			<td>50毫升</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0.5% （w/v） 辛基聚氧乙烯（辛基 POE）、1 mM EDTA 和 20 mM Tris pH 8.5</td>
			<td>1000毫升</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* 使用前请消毒。</td>
		</tr></tbody></table>表 2：用于 OmpF 分离的缓冲溶液。

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Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

该协议描述了如何使用TIRF显微镜来跟踪单个离子通道并确定它们在支持的脂质膜中的活性，从而定义侧向膜运动和通道功能之间的相互作用。它描述了如何制备膜、记录数据并分析结果。

使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对脂质双层中的横向迁移率和离子通道活性进行单分子成像

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

离子通道在生物膜中不是静态的。在这里，我们提出了一种单分子光学方法来揭示侧向膜扩散与离子通道功能之间的联系。与其他方法相比，该技术的主要优点是不需要对可能干扰其横向运动和功能的蛋白质进行荧光标记。该方法可应用于任何膜蛋白通道，其中自由或限制扩散对组织和功能很重要。首先，将380微升DPhPC储备溶液转移到玻璃小瓶中，并用氩气或氮气覆盖脂质储备溶液以防止脂质氧化。使用尽可能低的气流，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发，或溶剂从小瓶中喷出。在氮气流下干燥脂质样品，并使用无油真空泵在真空下从脂质样品中除去剩余的有机溶剂过夜。使用一毫升移液管加入等体积的十六烷和硅油，使脂质膜溶解在十六烷硅油溶液中，最终脂质浓度为每毫升9.5毫克。将一些玻璃盖玻片放入不锈钢盖玻片支架中，并在玻璃烧杯中用超声波清洁器中的丙酮清洁约 10 分钟。用双去离子水冲洗盖玻片，并在氮气流下干燥。此外，在等离子清洁器中用氧气清洁和水化盖玻片五分钟。将等离子体处理的盖玻片安装在旋涂机上，并通过用200微升移液管以3， 000 RPM缓慢加入140微升加热的0.75%低熔点琼脂糖膜，在盖玻片上涂覆亚微米厚的琼脂糖膜30秒。立即将带有琼脂糖水凝胶薄层的旋涂盖玻片连接到PMMA室的下侧。确保琼脂糖水凝胶指向上方。用透明胶带将盖玻片的边缘固定在PMMA微加工设备上，并将设备放在加热到35摄氏度的热板上。小心地将200微升2.5%琼脂糖溶液倒入腔室入口中，不要产生气泡。立即用约60微升的脂质油溶液覆盖PMMA室的孔，以在琼脂糖油界面处启动脂质单层形成，以避免PMMA室孔中的旋涂琼脂糖脱水。将设备放在 35 摄氏度的热板上约 2 小时。将约20微升脂质十六烷硅油溶液放入液滴孵育室的几个微制孔中。使用垂直或水平微量移液器拉拔器制备尖端开口直径约为20微米的微毛细管玻璃针。用大约5微升含有8.8毫摩尔HEPES，7微摩尔荧光染料，Fluo-8，400微摩尔EDTA，1.32摩尔氯化钾和30纳摩尔TOM核心复合物的水性注射溶液填充针头或替代20纳摩尔OMPF。将带有水性注射溶液的针头安装在压电驱动的纳米注射器上，并使用纳米注射器将100至200纳升水滴注入液滴孵育室中的孔中，液滴充满脂质十六烷硅油溶液。通过将PMMA和液滴孵育室保持在加热至35摄氏度的热板上，允许在液滴油界面形成脂质单层约两个小时。使用带有10微升一次性聚丙烯吸头的单通道微升移液管手动将单个水滴从液滴孵育室的孔转移到PMMA室的孔中。允许液滴在水凝胶 - 油界面处沉入脂质单层，在液滴和琼脂糖水凝胶之间形成脂质双层。将带有液滴界面双层或DIB膜的PMMA室安装在倒置光学显微镜的样品架上，并使用10倍霍夫曼调制造影镜评估膜的形成。如果已形成DIB膜，则将PMMA室安装在TIRF显微镜的样品架上，该显微镜配备用于落射荧光照明的传统光源，488纳米激光器和背照式电子倍增CCD相机，以实现约0.16微米的像素尺寸。使用GFP滤光片组，在落射荧光照明下，使用高强度光源，用10倍放大镜聚焦DIB膜的边缘。使用100x NA 1.49复消色差油TIRF物镜在高倍率下精细聚焦DIB膜的同一边缘，再次使用GFP滤光片组在高强度光源的落射荧光照明下。将滤光片设置从GFP更改为四波段TIRF滤光片组，打开488纳米激光器，并在物镜上设置激光强度。要可视化单个离子通道，请调整TIRF角度和EM CCD相机增益，使DIB膜中的开放离子通道在深色背景上显示为高对比度荧光斑点，并且信噪比达到最大值。确保通过单离子通道的钙离子通量对应的斑点保持聚焦，并具有圆形，中心强度高，并向外围逐渐减小。检查荧光斑点是否聚焦，以确保离子通道已重组到DIB膜中并在膜平面中横向移动。最后，记录一系列膜图像，以便正确跟踪位置并监测各个离子通道的开闭状态。要确定横向移动的类型和通道活动的状态，请获取足够长且采样良好的轨迹。这里显示了神经孢子虫TOM-CC的冷冻电镜结构。将含有TOM 22和6-His标签的N.crassa染色剂的线粒体溶解在DDM中，并进行镍NTA亲和色谱和阴离子交换色谱。此处显示了分离的TOM-CC晶体结构的SDS-PAGE和用于比较的纯化大肠杆菌OMPF的SDS-PAGE。TOM-CC相应轨迹中的荧光幅度轨迹表明，TOM-CC的开闭通道活性与复合物的侧膜迁移率相关。幅值轨迹显示三种渗透率状态：运动通道对应的全开状态、中间渗透率状态和非移动通道对应的闭合通道状态。处于中间状态的TOM-CC在其平均位置周围摆动约正负60纳米。此处显示了OMPF相应轨迹中的荧光幅度轨迹。与TOM-CC相比，OMPF仅显示一个强度级别，无论它是在运动中还是被捕获。与捕获分子的时间段相对应的轨迹段标记为灰色。需要注意的重要一点是，该方法在完整的膜环境中分析单个膜蛋白。在可预见的未来，膜蛋白的动力学仍将是科学研究的地平线。我们希望我们的方法能够为这一领域做出重大贡献。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

无洗涤剂超快重组膜蛋白成脂双层使用融合补充充电 Proteoliposomes。

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

科研

生物化学

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

体外支持性脂质双层自组织蛋白模式的重组

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

用石英谐振器研究磷脂结合蛋白附件 a2 与固体支持的脂质层结合动力学的耗散微重法

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

单分子跟踪显微镜 - 确定细胞分子扩散状态的工具

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

生产用于单分子观察的DNA折纸纳米结构的Dynein和Kinesin电机组合

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

使用光子芯片的高通量总内反射荧光和直接随机光学重建显微镜

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

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用于活细胞超分辨率显微镜和单分子跟踪的传统 BODIPY 结合物

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

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单分子鱼的转录活性等位基因单细胞分析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

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单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...