Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Vi takker Beate Nitschke for hendes hjælp med proteinpræparation og Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) og Maximilan Ulbrich (Freiburg) for indsigtsfulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) og et tilskud fra Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 til SN).

Vi erklærer ingen interessekonflikter.

Protokollen, der præsenteres her, giver en introduktion til brugen af DIB-membraner til at studere samspillet mellem lateral ionkanalbevægelse og kanalfunktion ved hjælp af enkeltmolekyle TIRF-mikroskopi. For at opnå de bedst mulige data er fremstilling af stabile DIB-membraner med så mange godt adskilte kanaler som muligt afgørende for at opnå tidsserier af individuelle partikler, som kan analyseres tilfredsstillende.
Kritiske parametre, der skal optimeres, omfatter valg af lipid, lipidkoncentrationen i oliefasen og protein- og vaskemiddelkoncentrationerne i de vandige dråber. De anvendte lipider er usædvanlige, idet de ikke viser nogen klar faseovergang ved lave temperaturer. DPhPC er et almindeligt anvendt lipid til at producere stabile membransystemer40. I princippet kan ethvert lipid, der opretholder sit væskemiljø ved lave temperaturer, være egnet til denne anvendelse. Desuden bør lipidet ikke være følsomt over for oxidation. Koncentrationen af vaskemiddel i dråberne skal være så lav som muligt for at undgå membranbrud. Stabile membraner og gode proteininkorporeringshastigheder opnås generelt med koncentrationer af vaskemiddel under den kritiske micellekoncentration (cmc), da membranproteinet ikke udfældes.
Hvis DIB-membranerne ikke tåler specifikke rengøringsmidler21,41, eller hvis proteinerne ikke integreres fra lav vaskemiddelopløsning i DIB-membranerne, kan proteinkanalerne først rekonstitueres til små unilamellære lipidvesikler (SUV'er), som derefter smeltes sammen med DIB-membranerne fra dråbesiden, som det med succes er vist for E. coli MscL 42 . Nogle gange dannes DIB-membraner ikke, fordi lipidkoncentrationen i oliefasen er for lav. For at forhindre DIB-membraner i at sprænge, skal man også være opmærksom på, at det osmotiske tryk mellem hydrogelen og dråben skal være præcist afbalanceret uden at påvirke Ca2+-fluxen fra cis til trans for meget. Optimeret agarosetykkelse og maskestørrelse synes at være afgørende for at observere diffusionen af membranproteiner. Enhver tørring af agaroselaget bør undgås. Tykkelsen kan bestemmes ved hjælp af atomkraftmikroskopi17. Ved at variere agarosekoncentrationen, volumenet og rotationshastigheden under spinbelægning kan hydrogelens maskestørrelse og tykkelse optimeres. Bemærk dog, at hydrogellagtykkelse påvirker billedkontrasten. For at fange membranproteiner i DIB'er kan agarosehydrogelen erstattes af specialsyntetiseret, ikke-tværbundet, Ni-NTA-modificeret, lavsmeltende agarose for at fange dem via et His-tag17. En for høj fluorescensbaggrund skyldes ofte brud på DIB-membranerne. Dette er især et problem med kamre med flere brønde, da det Ca2+-følsomme farvestof diffunderer ind i hydrogelen. I dette tilfælde bør tilstødende brønde undgås. Fluorescensblegning af det Ca2+-følsomme farvestof over membranen bør ikke være en signifikant begrænsende faktor, da det udveksles med ikke-ophidsede farvestoffer i hovedparten af dråben (figur 3A) uden for TIRF-evanescentfeltet. Lokaliseringspræcisionen for proteinet er givet ved nøjagtigheden af montering af pletterne og pixelstørrelsen.
Svage fluorescenssignaler kan skyldes lav Ca2+-flux gennem kanalen. Mulige årsager omfatter: (i) unøjagtige TIRF-indstillinger (f.eks. laserintensitet), (ii) det osmotiske Ca 2+-tryk over membranen eller (iii) kanalernes iboende Ca2+-permeabilitet er for lav. For at klare det første problem skal laserintensitet, TIRF-vinkel og kameraforstærkning optimeres. De to sidstnævnte problemer kan overvindes ved anvendelse af et elektrisk potentiale over membranen 2,43. Imidlertid kan anvendelsen af eksterne spændinger forvrænge resultatet, da elektriske effekter kan påvirke kanalåbningen af ligand-gated eller mekanofølsomme ionkanaler, der faktisk ikke er spændingsstyrede. Eksempler på sådanne kanaler er mitokondrieproteintranslocasen TOM-CC27 og dens kanaldannende underenhed Tom40 26,44,45,46. Endelig skal det bemærkes, at det er vanskeligt at indsætte membranproteiner i DIB-membraner i en bestemt retning for at opnå en ønsket funktionalitet, og kvantitative undersøgelser er sjældne47,48. I nogle tilfælde er orienteringen af de integrerede proteiner tilfældig. Dette er et alvorligt problem for at studere membranproteiner, fordi visse membranproteiner kun aktiveres på den ene side af membranen.
TIRF-mikroskopi er en kraftfuld metode til adressering af enkeltmolekylehændelser i plane understøttede membraner49. Eksempler inkluderer samling og foldning af vejbelysning af kanalproteiner såsom α-hæmolysin50, perfringolysin O 51 og OmpG52. Disse undersøgelser omfattede FRET som en yderligere teknik. Derudover er aktivering af den mekanofølsomme ionkanal MscL tidligere blevet undersøgt ved mekanisk stimulering af understøttede DIB-dobbeltlag42 ved hjælp af aktuelle målinger. Baseret på dette arbejde kunne fremtidige undersøgelser kombinere platformen beskrevet her med enkeltmolekyle FRET-eksperimenter for at adressere mekanofølsomme kanaler på enkeltmolekyleniveau på en optisk måde17. Injektion af buffer i dråben, strækning af det indre DIB-monolag eller målrettet binding af individuelle kanaler til den underliggende hydrogel kan bruges til yderligere undersøgelse ikke kun af den fysiske mekanisme af mekanisk aktiverede kanaler, som reagerer på membranspænding og / eller krumning som vist for MscL og MscS, to-poredomænet K + -kanaler, TREK-1, TREK-2 og TRAAK og PIEZO (for gennemgang, se53), men også lokal binding til det cellulære cytoskelet, som vist for den berøringsfølsomme ionkanal NOMPC54,55.

Denne protokol har til formål at beskrive, hvordan man kan studere sammenhængen mellem membranmobilitet og ionkanalpermeabilitet af membranproteiner i polymerunderstøttede dråbegrænseflade dobbeltlagsmembraner (DIB) 1,2,3.
Den nuværende teknik supplerer et imponerende udvalg af avancerede optiske og overfladeanalytiske værktøjer, såsom enkeltpartikelsporing 4,5, fluorescenskorrelationsspektroskopi6,7 og højhastighedsatomkraftmikroskopi 8,9,10. Disse giver værdifuld indsigt i den dynamiske sammensætning og struktur af membraner, der påvirker membranbaserede reaktioner11,12,13. Mens bevægelse og lateral diffusion af proteiner afhænger af den lokale tæthed af proteiner i membranen, kan individuelle proteinmolekyler også fanges i lipidflåder14 og ved protein-proteininteraktioner15,16. Afhængigt af proteindomænerne, der stikker ud fra membranen ind i det ekstracellulære miljø eller cytosolen, kan proteinmobiliteten variere fra meget mobil til fuldstændig immobil. På grund af membranens kompleksitet og dens perifere strukturer er det imidlertid ofte vanskeligt at dechiffrere samspillet mellem arten af lateral mobilitet og proteinfunktion17.
DIB-membraner har vist sig at være en effektiv platform til biofysiske enkeltmolekyleanalyser af membranproteiner 18,19,20,21,22. De dannes ved lipid selvmontering gennem kontakt mellem vandige dråber og hydrogelunderstøttede substrater i en lipid / oliefase. I lighed med de almindeligt anvendte understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er)1,23,24,25 tillader DIB'er lokal indstilling af lateral mobilitet ved midlertidig eller permanent binding af proteiner til polymermatrixen, når de funktionaliseres med passende ligander17. Sidstnævnte kan tjene som et modelsystem for biokemiske processer i cellemembraner med en heterogen proteinfordeling10.
Den eksperimentelle tilgang, der beskrives her, er afhængig af fluorescensen af Ca 2+-følsomme farvestoffer til måling af Ca 2+ ionfluxen gennem individuelle kanaler tæt på membranen 2,22 ved hjælp af TIRF-mikroskopi. Denne optiske fremgangsmåde begrænser prøvens belysning til en afstand tæt på membranen, hvilket på grund af de fysiske egenskaber af det evanescent excitationslys fører til en signifikant reduktion af fluorescensbaggrunden. Sidstnævnte er en forudsætning, hvis der kræves høj rumlig og tidsmæssig opløsning til påvisning af enkeltmolekyler. I modsætning til klassiske elektrofysiologiske metoder26,27 kræves der ingen membranspændinger for at studere ionflux gennem individuelle kanaler. Desuden kræver metoden ikke mærkning med fluorescerende farvestoffer eller molekyler, der kan forstyrre kanalernes laterale bevægelse i membranen.
Metoden er især nyttig til at studere proteinkanaler indlejret i membranen på enkeltmolekyleniveau uden brug af klassisk elektrofysiologi. Ved hjælp af mitokondrieproteinledende kanal TOM-CC fra Neurospora crassa28,29,30 og OmpF, som understøtter diffusion af små hydrofile molekyler over den ydre membran af Escherichia coli17,31, illustrerer vi, hvordan membranmobiliteten og kanalaktiviteterne af de to proteiner kan studeres og korreleres. Vi foreslår, at denne tilgang, selvom den er optimeret til TOM-CC og OmpF, let kan anvendes på andre proteinkanaler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Højopløsningsbilleddannelsesteknikker har vist, at mange ionkanaler ikke er statiske, men underlagt meget dynamiske processer, herunder forbigående forening af poredannende og hjælpeunderenheder, lateral diffusion og klyngedannelse med andre proteiner. Imidlertid er forholdet mellem lateral diffusion og funktion dårligt forstået. For at nærme os dette problem beskriver vi, hvordan lateral mobilitet og aktivitet af individuelle kanaler i understøttede lipidmembraner kan overvåges og korreleres ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Membraner fremstilles på et ultratyndt hydrogelsubstrat ved hjælp af dråbegrænsefladen dobbeltlag (DIB) teknik. Sammenlignet med andre typer modelmembraner har disse membraner den fordel, at de er mekanisk robuste og egnede til meget følsomme analyseteknikker. Denne protokol måler Ca 2+ ionflux gennem enkeltkanaler ved at observere fluorescensemissionen af et Ca2+-følsomt farvestof tæt på membranen. I modsætning til klassiske enkeltmolekylesporingsmetoder kræves der ingen fluorescerende fusionsproteiner eller etiketter, som kan forstyrre lateral bevægelse og funktion i membranen. Mulige ændringer i ionflux forbundet med konformationelle ændringer af proteinet skyldes kun proteinets laterale bevægelse i membranen. Repræsentative resultater vises ved hjælp af mitokondrieproteintranslokationskanalen TOM-CC og bakteriekanalen OmpF. I modsætning til OmpF er gatingen af TOM-CC meget følsom over for molekylær indeslutning og arten af lateral diffusion. Derfor er understøttede dråbe-interface dobbeltlag et kraftfuldt værktøj til at karakterisere forbindelsen mellem lateral diffusion og funktionen af ionkanaler.

Elektrodefri optisk enkeltkanaloptagelse i realtid afslører samspillet mellem lateral proteinbevægelse og funktionen af individuelle ionkanaler i DIB-membraner. Rekonstitution af mitokondrie-TOM-kernekomplekset (figur 1A) i en DIB-membran (figur 4D) illustrerer en stærk tidsmæssig sammenhæng mellem lateral mobilitet og ionpermeabilitet (figur 5A). TOM-CC-gatingen ser ud til at være følsom over for tilstanden for lateral bevægelse17. Bevægelige kanaler viser Ca2+ flux gennem deres porer og høje fluorescenspunktintensiteter. Fangede, ikke-bevægelige molekyler viser lave og mellemstore fluorescensintensiteter. For den generelle proteinimportpore af mitokondrier TOM-CC afslørede denne enkeltmolekyletilgang en stærk tidsmæssig sammenhæng mellem lateral mobilitet og ionpermeabilitet, hvilket tyder på, at TOM-CC-kanalen har mekanofølsomme egenskaber17. Et lateralt stop af frit bevægelige TOM-CC-molekyler ledsages af en delvis eller fuldstændig lukning af TOM-CC-kanalen. Billeddannelse af DIB-membraner med OmpF (figur 1E og figur 4F), som næsten er fuldt indlejret i membranen, viser ingen stop-and-go-effekter (figur 5B). Tilfældige stop af OmpF er ikke forbundet med en ændring i intensitet og dermed med lukningen af porerne. Baseret på fluorescenssignalerne38 kan positionsnøjagtigheden af de enkelte kanaler estimeres i området mellem 5 og 10 nm. Det skal dog bemærkes, at denne nøjagtighed ikke kan opnås, hvis kanalerne vakler lidt på grund af mobil forankring med agarosehydrogelen, som vist for eksempel for TOM-CC-molekylerne i en mellemtilstand med en rodmiddelforskydning på 120 nm (figur 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figur 1: Isolering af TOM-CC. (A) Cryo EM-struktur af N. crassa TOM-CC30,39. Mitokondrier fra en N. crassa-stamme indeholdende en Tom22 med et 6xHis tag blev opløseligt i DDM og udsat for Ni-NTA-affinitetskromatografi (B) og anionbytningskromatografi (C). (D) SDS-PAGE af isoleret TOM-CC. E) Krystalstruktur (PDB, 1OPF) og (F) SDS-PAGE af renset E. coli OmpF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figur 2: Rutediagram over PMMA-kammersamling. Trin 1: En glasdæksel er spin-coated med en agarosehydrogel. Trin 2: Den spin-coatede coverslip monteres i et specialfremstillet PMMA-mikroskopikammer. Trin 3: Yderligere lavsmelteagarose tilsættes i PMMA-kammerets indløbsport på en 35 °C kogeplade. Trin 4: Lipidmonolag dannes omkring vandige dråber ved en buffer / olie-grænseflade (venstre) og på agarosehydrogel / oliegrænsefladen (højre). Trin 5: Individuelle vandige dråber pipetteres ind i brøndene i PMMA-kammeret for at danne et lipiddobbeltlag ved kontakt mellem de to lipidmonolag. Trin 6: Dannelsen af DIB-membranerne valideres ved Hofmann-modulationskontrastmikroskopi. Trin 7: Billeder af udvalgte områder af DIB-membranerne med indsatte ionkanaler erhverves ved TIRF-mikroskopi. Grøn: 0,75% agarose; gul: 2,5% agarose indeholdende Ca2+ ioner; magenta: lipid / oliefase; mørkeblå: vandig dråbebuffer indeholdende Ca2+-følsomt farvestof og protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figur 3: Eksperimentel opsætning. (A) Skematisk gengivelse af en DIB-membran i en PMMA-brønd. Dobbeltlaget hviler på en ultratynd 0,75% agarosefilm for at muliggøre TIRF-billeddannelse af Ca 2+-flux gennem en ionkanal over tid ved hjælp af et Ca 2+-følsomt fluorescensfarvestof (Fluo-8) i trans. (B) Ca2+-fluxen styres udelukkende af det osmotiske tryk fra cis til trans. Dette muliggør både bestemmelse af positionen i membranen og kanalens åbne-lukkede tilstand. Kanalen vist her er den proteinledende kanal TOM-CC af N. crassa mitokondrier30. (C) Bane for en enkelt TOM-CC-kanal. Grøn: bevægelig kanal; gul: ikke-bevægelig kanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figur 4: Billeddannelse af TOM-CC og OmpF i DIB-membraner . (A) DIB-membran afbildet ved Hoffmann-modulationskontrastmikroskopi, der viser dobbeltlagskontaktområdet mellem hydrogelen og dråben. (B) Brudt DIB-membran afbildet som i (A). Pil, kant af PMMA-kammer. (C) DIB-membran afbildet ved TIRF-mikroskopi uden proteinkanaler. (D) DIB-membran med rekonstitueret TOM-CC, afbildet ved TIRF-mikroskopi. De hvide firkanter markerer pletter med høj (SH), mellemliggende (SI) og lav (SL) intensitet. (E) Tilpasning af fluorescensintensitetsprofilen for de tre pletter markeret i (A) til todimensionale gaussiske funktioner afslører placeringen af individuelle TOM-CC'er og Ca2+ -fluxen gennem kanalen. (F) DIB-membran med rekonstitueret OmpF. G) Gaussisk pasning af den fluorescerende plet markeret med (F). I modsætning til det to-pore β-tønde proteinkompleks TOM-CC afslører OmpF med tre porer β tønde kun en permeabilitetstilstand. Pixelstørrelse, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figur 5: Kanalaktivitet korrelerer med lateral mobilitet af TOM-CC. (A) Det fluorescerende amplitudespor (øverst) og tilsvarende bane (nederst) af TOM-CC indikerer, at TOM-CC's åbne lukkede kanalaktivitet korrelerer med kompleksets laterale membranmobilitet. Banen viser tre permeabilitetstilstande. Grøn: helt åben tilstand; gul: mellemliggende permeabilitetstilstand; rød: lukket kanaltilstand; rød stjerne: TOM-CC i mellemtilstanden vakler omkring sin middelposition med ca. ±60 nm. Positionsnøjagtighederne37 baseret på fluorescenssignalerne i helt åbne og mellemliggende tilstande ligger mellem 5 nm og 10 nm. B) Fluorescerende amplitudespor (øverst) og tilsvarende bane (nederst) for OmpF. OmpF afslører kun ét intensitetsniveau, uanset om det er i bevægelse eller fanget. Banesegmenterne svarende til tidsperioderne for fangede molekyler er markeret med gråt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Reagenskoncentrationer</td>
			<td>Lydstyrke</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (w/v) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 10 % (v/v) glycerol, 300 mM NaCl og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glycerol, 1 M imidazol og 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Afgass og passér gennem et 0,22 μm filter før brug.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Bufferopløsninger til TOM-CC-isolering.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Reagenskoncentrationer</td>
			<td>Lydstyrke</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (w/v) trypton, 1% (w/v) NaCl og 0,5% (w/v) gærekstrakt</td>
			<td>1100 ml</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mMMgCl2 og ~750 enheder DNAse og 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCI, pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 2 mM β-mercaptoethanol og 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (w/v) octylpolyoxyethylen (octyl POE), 1 mM EDTA og 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Steriliser før brug.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Bufferopløsninger til OmpF-isolering.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger TIRF-mikroskopi til at spore individuelle ionkanaler og bestemme deres aktivitet i understøttede lipidmembraner og derved definere samspillet mellem lateral membranbevægelse og kanalfunktion. Den beskriver, hvordan man forbereder membranerne, registrerer dataene og analyserer resultaterne.

Enkeltmolekylebilleddannelse af lateral mobilitet og ionkanalaktivitet i lipiddobbeltlag ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Ionkanaler er ikke statiske i biologiske membraner. Her præsenterer vi en enkelt molekyle optisk tilgang til at optrævle forbindelsen mellem lateral membrandiffusion og ionkanalfunktion. Den største fordel ved denne teknik i forhold til andre metoder er, at fluorescerende mærkning af proteiner, som kan forstyrre deres laterale bevægelse og funktion, ikke er påkrævet.Metoden kan anvendes på enhver membranproteinkanal, hvor fri eller begrænset diffusion er vigtig for organisation og funktion. Til at begynde med overføres 380 mikroliter DPhPC-stamopløsning til et hætteglas af glas, og lipidstamopløsningen overlejres med argon eller nitrogengas for at forhindre lipidoxidation. Brug den lavest mulige gasstrøm for at undgå fordampning af det organiske opløsningsmiddel, hvori lipiderne er opløst, eller stænk af opløsningsmiddelsprayene fra hætteglasset.Tør lipidprøven under en strøm af nitrogen, og fjern det resterende organiske opløsningsmiddel fra lipidprøven under vakuum ved hjælp af en oliefri vakuumpumpe natten over. Opløs lipidfilmen i en hexadecan silikoneolieopløsning ved at tilsætte lige store mængder hexadecan og silikoneolie ved hjælp af en milliliter pipette til en endelig lipidkoncentration på 9,5 milligram pr. milliliter. Placer nogle glasdæksler i en dækselholder i rustfrit stål, og rengør dem i et glasbæger i ca. 10 minutter med acetone i en ultralydsrenser.Skyl dækslerne med dobbelt deioniseret vand og tør dem under en nitrogenstrøm. Rens og hydrofyliser endvidere et dæksel i en plasmarenser med ilt i fem minutter. Monter et plasmabehandlet dæksel på en spincoater og belæg dækslet med en submikrometer tyk film af agarose ved langsomt at tilsætte 140 mikroliter opvarmet 0, 75% lavsmeltende agarose med en 200 mikroliter pipette ved 3.000 RPM i 30 sekunder.Fastgør straks det spinbelagte dæksel med det tynde lag af agarosehydrogelen til undersiden af PMMA-kammeret. Sørg for, at agarosehydrogelen peger opad. Fastgør kanterne på dæksedlen til PMMA-mikrobearbejdet enhed med gennemsigtig tape, og læg enheden på en varmeplade opvarmet til 35 grader Celsius.Hæld forsigtigt 200 mikroliter 2,5% agaroseopløsning i kammerets indløb uden at skabe luftbobler. Dæk straks brøndene i PMMA-kammeret med ca. 60 mikroliter lipidolieopløsning for at initiere dannelse af lipidmonolag ved agaroseoliegrænsefladen for at undgå dehydrering af den spinbelagte agarose i brøndene i PMMA-kammeret. Placer enheden på en kogeplade ved 35 grader Celsius i cirka to timer.Anbring omkring 20 mikroliter lipidhexadecan, silikoneolieopløsning i hver af de flere mikrofabrikerede brønde i et dråbeinkubationskammer. Forbered en mikrokapillær glasnål med en åbningsdiameter på ca. 20 mikrometer ved hjælp af en lodret eller vandret mikropipetteudtrækker. Fyld nålen med omkring fem mikroliter vandig injektionsopløsning indeholdende 8,8 millimolær HEPES, syv mikromolære af et fluorescerende farvestof, Fluo-8, 400 mikromolær EDTA, 1,32 molært kaliumchlorid og 30 nanomolært TOM-kernekompleks eller alternativt 20 nanomolær OMPF.Monter nålen med den vandige injektionsopløsning på en piezodrevet nanoinjektor og injicer 100 til 200 nanoliter vandige dråber i brøndene i dråbeinkubationskammeret fyldt med lipidhexadecan, silikoneolieopløsning ved hjælp af nanoinjektoren. Tillad dannelsen af et lipidmonolag ved dråbeoliegrænsefladen i ca. to timer ved at opretholde PMMA- og dråbeinkubationskamrene på en varmeplade opvarmet til 35 grader Celsius. Overfør manuelt individuelle vandige dråber fra brøndene i dråbeinkubationskammeret til brøndene i PMMA-kammeret ved hjælp af en enkeltkanals mikroliterpipette med en 10 mikroliter engangspolypropylenspids.Lad dråberne synke ned på lipidmonolagene ved hydrogel-olie-grænsefladerne for at danne et lipiddobbeltlag mellem dråberne og agarosehydrogelen. Monter PMMA-kammeret med dråbegrænsefladens dobbeltlag eller DIB-membraner på prøveholderen af et omvendt lysmikroskop, og vurder membrandannelsen ved hjælp af et 10x Hoffman-modulationskontrastmål. Hvis DIB-membraner er dannet, skal du montere PMMA-kammeret på prøveholderen af et TIRF-mikroskop udstyret med en konventionel lyskilde til epifluorescensbelysning, en 488 nanometer laser og et baggrundsbelyst elektronmultiplicerende CCD-kamera for at opnå en pixelstørrelse på omkring 0,16 mikrometer.Fokuser kanten af en DIB-membran med et 10x forstørrelsesmål under epifluorescensbelysning med en højintensiv lyskilde ved hjælp af et GFP-filtersæt. Finfokuser den samme kant af DIB-membranen ved høj forstørrelse med et 100x NA 1,49 apokromatisk olie TIRF-mål, igen under epifluorescensbelysning med en højintensiv lyskilde ved hjælp af et GFP-filtersæt. Skift filterindstillingen fra GFP til quad band TIRF filtersæt, tænd 488 nanometer laseren, og indstil laserens intensitet på objektivlinsen.For at visualisere enkeltionkanaler skal du justere TIRF-vinklen og EM CCD-kameraforstærkningen, så de åbne ionkanaler i DIB-membranen vises som fluorescerende pletter med høj kontrast på en mørk baggrund, og signalet til baggrundsforholdet når et maksimum. Sørg for, at pletterne svarende til calciumionfluxen gennem enkeltionkanaler forbliver i fokus og har en rund form med høj intensitet i midten og gradvist faldende mod periferien. Kontroller, at de fluorescerende pletter er i fokus for at sikre, at ionkanalerne er rekonstitueret i DIB-membranerne og bevæger sig sideværts i membranplanet.Endelig optages en række membranbilleder, der muliggør korrekt sporing af positionen og overvågning af den åbne-lukkede tilstand af de enkelte ionkanaler. For at bestemme typen af lateral mobilitet og tilstanden af kanalaktivitet erhverver du tilstrækkeligt lange og godt samplede baner. Cryo EM struktur af Neurospora crassa TOM-CC er vist her.Mitokondrier fra en N.crassa-plet indeholdende en TOM 22 med et 6-Hans mærke blev opløseligt i DDM og udsat for nikkel NTA-affinitetskromatografi og anionudvekslingskromatografi. SDS-PAGE af isoleret TOM-CC krystalstruktur og SDS-PAGE af renset E. coli OMPF anvendt til sammenligning er vist her. Det fluorescerende amplitudespor i den tilsvarende bane for TOM-CC indikerer, at den åbne lukkede kanalaktivitet af TOM-CC korrelerer med kompleksets laterale membranmobilitet.Amplitudesporingen viser tre permeabilitetstilstande: helt åben tilstand svarende til bevægelige kanaler, mellemliggende permeabilitetstilstand og lukket kanaltilstand svarende til ikke-bevægelige kanaler. TOM-CC i mellemtilstanden vakler omkring sin gennemsnitlige position med ca. plus/minus 60 nanometer. Det fluorescerende amplitudespor i den tilsvarende bane for OMPF er vist her.OMPF afslører kun et intensitetsniveau sammenlignet med TOM-CC, uanset om det er i bevægelse eller fanget. Banesegmenterne svarende til tidsperioderne for fangede molekyler er markeret med gråt. En vigtig ting at bemærke er, at denne metode analyserer enkeltmembranproteiner i et intakt membranmiljø.Membranproteiners dynamik vil fortsat være en horisont for videnskabelige undersøgelser i overskuelig fremtid. Vi forventer, at vores metode vil bidrage væsentligt til dette felt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

Høj gennemløb total intern refleksion fluorescens og direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi ved hjælp af en fotonisk chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

Konventionelle BODIPY konjugatter til Live-Cell Super-Resolution mikroskopi og Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...