Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

We bedanken Beate Nitschke voor haar hulp bij de eiwitbereiding en Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) en Maximilan Ulbrich (Freiburg) voor inzichtelijke discussies. Dit werk werd ondersteund door het Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) en een subsidie van de Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 to SN).

Wij verklaren geen belangenconflicten.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een inleiding tot het gebruik van DIB-membranen om het samenspel tussen laterale ionkanaalbeweging en kanaalfunctie te bestuderen met behulp van TIRF-microscopie met één molecuul. Om de best mogelijke gegevens te verkrijgen, is de bereiding van stabiele DIB-membranen met zoveel mogelijk goed gescheiden kanalen cruciaal voor het verkrijgen van tijdreeksen van individuele deeltjes, die naar tevredenheid kunnen worden geanalyseerd.
Kritische parameters die moeten worden geoptimaliseerd, zijn onder meer de keuze van lipide, de lipidenconcentratie in de oliefase en de eiwit- en reinigingsmiddelconcentraties in de waterige druppels. De gebruikte lipiden zijn ongebruikelijk, omdat ze bij lage temperaturen geen duidelijke faseovergang vertonen. DPhPC is een veelgebruikte lipide om stabiele membraansystemente produceren 40. In principe kan elke lipide die zijn vloeibare omgeving bij lage temperaturen behoudt, geschikt zijn voor deze toepassing. Bovendien mag het lipide niet gevoelig zijn voor oxidatie. De wasmiddelconcentratie in de druppels moet zo laag mogelijk zijn om membraanbreuk te voorkomen. Stabiele membranen en goede eiwitopnamesnelheden worden over het algemeen bereikt met detergentconcentraties onder de kritische micelconcentratie (cmc), aangezien het membraaneiwit niet neerslaat.
Als de DIB-membranen specifieke detergentia21,41 niet verdragen, of als de eiwitten niet uit een oplossing met een laag wasmiddelgehalte in de DIB-membranen integreren, kunnen de eiwitkanalen eerst worden gereconstitueerd tot kleine unilamellaire lipideblaasjes (SUV's), die vervolgens vanaf de druppelzijde met de DIB-membranen worden gefuseerd, zoals met succes is aangetoond voor E. coli MscL 42 . Soms vormen DIB-membranen zich niet omdat de lipideconcentratie in de oliefase te laag is. Om te voorkomen dat DIB-membranen barsten, moet men zich er ook van bewust zijn dat de osmotische druk tussen de hydrogel en de druppel nauwkeurig moet worden gebalanceerd zonder de Ca2 +-flux van cis naar trans overmatig te beïnvloeden. Geoptimaliseerde agarosedikte en maaswijdte lijken cruciaal te zijn om de diffusie van membraaneiwitten waar te nemen. Elke uitdroging van de agaroselaag moet worden vermeden. De dikte kan worden bepaald met behulp van atoomkrachtmicroscopie17. Door de agaroseconcentratie, het volume en de rotatiesnelheid tijdens het centrifugeren te variëren, kunnen de maaswijdte en dikte van de hydrogel worden geoptimaliseerd. Merk echter op dat de dikte van de hydrogellaag het beeldcontrast beïnvloedt. Om membraaneiwitten in DIBs te vangen, kan de agarose-hydrogel worden vervangen door op maat gesynthetiseerde, niet-gecrosslinkte, Ni-NTA-gemodificeerde, laagsmeltende agarose om ze te vangen via een His-tag17. Een te hoge fluorescentieachtergrond wordt vaak veroorzaakt door scheuring van de DIB-membranen. Dit is met name een probleem met multi-well kamers, omdat de Ca2+ -gevoelige kleurstof diffundeert in de hydrogel. In dit geval moeten aangrenzende putten worden vermeden. Fluorescentiebleking van de Ca2+-gevoelige kleurstof boven het membraan mag geen significante beperkende factor zijn, omdat deze wordt uitgewisseld door niet-opgewonden kleurstoffen in het grootste deel van de druppel (figuur 3A) buiten het TIRF-evanescente veld. De lokalisatieprecisie voor het eiwit wordt gegeven door de nauwkeurigheid van het passen van de vlekken en de pixelgrootte.
Zwakke fluorescentiesignalen kunnen worden veroorzaakt door een lage Ca2+-flux door het kanaal. Mogelijke redenen zijn: (i) onnauwkeurige TIRF-instellingen (bijv. Laserintensiteit), (ii) de osmotische Ca 2+ druk over het membraan, of (iii) de intrinsieke Ca2+-permeabiliteit van de kanalen is te laag. Om het eerste probleem het hoofd te bieden, moeten de laserintensiteit, TIRF-hoek en cameraversterking worden geoptimaliseerd. De laatste twee problemen kunnen worden ondervangen door de toepassing van een elektrische potentiaal over het membraan 2,43. De toepassing van externe spanningen kan het resultaat echter vervormen, omdat elektrische effecten de kanaalopening van ligand-gated of mechanosensitieve ionkanalen kunnen beïnvloeden die eigenlijk niet spanningsgestuurd zijn. Voorbeelden van dergelijke kanalen zijn het mitochondriale eiwit translocase TOM-CC27 en de kanaalvormende subeenheid Tom40 26,44,45,46. Ten slotte moet worden opgemerkt dat het inbrengen van membraaneiwitten in DIB-membranen in een specifieke oriëntatie om een gewenste functionaliteit te bereiken lastig is, en kwantitatieve studies zijn zeldzaam47,48. In sommige gevallen is de oriëntatie van de geïntegreerde eiwitten willekeurig. Dit is een ernstig probleem voor het bestuderen van membraaneiwitten, omdat bepaalde membraaneiwitten slechts aan één kant van het membraan worden geactiveerd.
TIRF-microscopie is een krachtige methode voor het aanpakken van gebeurtenissen met één molecuul in planaire ondersteunde membranen49. Voorbeelden hiervan zijn assemblage en vouwroute-opheldering van kanaaleiwitten zoals α-hemolysine50, perfringolysine O 51 en OmpG52. Deze studies omvatten FRET als een aanvullende techniek. Bovendien is de activering van het mechanosensitieve ionkanaal MscL eerder bestudeerd door mechanische stimulatie van ondersteunde DIB-bilayers42 met behulp van stroommetingen. Op basis van dit werk zouden toekomstige studies het hier beschreven platform kunnen combineren met FRET-experimenten met één molecuul om mechanosensitieve kanalen op het niveau van één molecuul op een optische manier aan te pakken17. Injectie van buffer in de druppel, het uitrekken van de binnenste DIB-monolaag of gerichte binding van individuele kanalen aan de onderliggende hydrogel kan worden gebruikt om niet alleen het fysieke mechanisme van mechanisch geactiveerde kanalen verder te bestuderen, die reageren op membraanspanning en / of kromming zoals getoond voor MscL en MscS, het twee-poriën domein K + -kanalen, TREK-1, TREK-2, en TRAAK, en PIEZO (voor beoordeling, zie53), maar ook lokale binding aan het cellulaire cytoskelet, zoals getoond voor het aanraakgevoelige ionkanaal NOMPC54,55.

Dit protocol heeft tot doel te beschrijven hoe de correlatie tussen membraanmobiliteit en ionkanaalpermeabiliteit van membraaneiwitten in polymeerondersteunde druppel-interface dubbellaagse (DIB) membranen 1,2,3 kan worden bestudeerd.
De huidige techniek is een aanvulling op een indrukwekkende reeks geavanceerde optische en oppervlakteanalytische hulpmiddelen, zoals single particle tracking4,5, fluorescentiecorrelatiespectroscopie 6,7 en high-speed atomic force microscopie 8,9,10. Deze geven waardevolle inzichten in de dynamische samenstelling en structuur van membranen die membraanreacties beïnvloeden11,12,13. Terwijl de beweging en laterale diffusie van eiwitten afhankelijk is van de lokale dichtheid van eiwitten in het membraan, kunnen individuele eiwitmoleculen ook worden gevangen in lipidenvlotten14 en door eiwit-eiwitinteracties15,16. Afhankelijk van de eiwitdomeinen die uit het membraan in de extracellulaire omgeving of cytosol steken, kan eiwitmobiliteit variëren van zeer mobiel tot volledig onbeweeglijk. Vanwege de complexiteit van het membraan en zijn perifere structuren is het echter vaak moeilijk om het samenspel tussen de aard van laterale mobiliteit en eiwitfunctie te ontcijferen17.
DIB-membranen hebben bewezen een efficiënt platform te zijn voor biofysische single-molecule analyses van membraaneiwitten 18,19,20,21,22. Ze worden gevormd door zelfassemblage van lipiden door het contact van waterige druppels met hydrogel-ondersteunde substraten in een lipide / oliefase. Vergelijkbaar met de veelgebruikte ondersteunde lipide bilayers (SLBs)1,23,24,25, maken DIBs lokale afstemming van de laterale mobiliteit mogelijk door tijdelijke of permanente binding van eiwitten aan de polymeermatrix wanneer gefunctionaliseerd met geschikte liganden17. Dit laatste kan dienen als modelsysteem voor biochemische processen in celmembranen met een heterogene eiwitverdeling10.
De experimentele benadering die hier wordt beschreven, is gebaseerd op de fluorescentie van Ca 2+-gevoelige kleurstoffen om de Ca 2+ ionenflux te meten door individuele kanalen in de nabijheid van het membraan 2,22 met behulp van TIRF-microscopie. Deze optische benadering beperkt de verlichting van het monster tot een afstand dicht bij het membraan, wat, vanwege de fysieke eigenschappen van het evanescente excitatielicht, leidt tot een significante vermindering van de fluorescentieachtergrond. Dit laatste is een voorwaarde als een hoge ruimtelijke en temporele resolutie vereist is voor de detectie van afzonderlijke moleculen. In tegenstelling tot klassieke elektrofysiologische methoden26,27 zijn er geen membraanspanningen nodig om de ionenflux door individuele kanalen te bestuderen. Bovendien vereist de methode geen etikettering met fluorescerende kleurstoffen of moleculen die de laterale beweging van de kanalen in het membraan kunnen verstoren.
De methode is vooral nuttig voor het bestuderen van eiwitkanalen ingebed in het membraan op het niveau van één molecuul zonder gebruik te maken van klassieke elektrofysiologie. Met behulp van mitochondriaal eiwitgeleidend kanaal TOM-CC van Neurospora crassa28,29,30 en OmpF, dat de diffusie van kleine hydrofiele moleculen over het buitenmembraan van Escherichia coli17,31 ondersteunt, illustreren we hoe de membraanmobiliteit en kanaalactiviteiten van de twee eiwitten kunnen worden bestudeerd en gecorreleerd. We stellen voor dat deze aanpak, hoewel geoptimaliseerd voor TOM-CC en OmpF, gemakkelijk kan worden toegepast op andere eiwitkanalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Hoge resolutie beeldvormingstechnieken hebben aangetoond dat veel ionkanalen niet statisch zijn, maar onderhevig aan zeer dynamische processen, waaronder de voorbijgaande associatie van porievorming en hulpsubeenheden, laterale diffusie en clustering met andere eiwitten. De relatie tussen laterale diffusie en functie is echter slecht begrepen. Om dit probleem te benaderen, beschrijven we hoe laterale mobiliteit en activiteit van individuele kanalen in ondersteunde lipidemembranen kunnen worden gecontroleerd en gecorreleerd met behulp van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Membranen worden vervaardigd op een ultradun hydrogelsubstraat met behulp van de druppelinterface bilayer (DIB) -techniek. In vergelijking met andere soorten modelmembranen hebben deze membranen het voordeel dat ze mechanisch robuust zijn en geschikt voor zeer gevoelige analysetechnieken. Dit protocol meet Ca 2+ ionenflux door enkele kanalen door de fluorescentie-emissie van een Ca2+-gevoelige kleurstof in de nabijheid van het membraan te observeren. In tegenstelling tot klassieke single-molecule trackingbenaderingen, zijn er geen fluorescerende fusie-eiwitten of labels nodig, die de laterale beweging en functie in het membraan kunnen verstoren. Mogelijke veranderingen in ionenflux geassocieerd met conformatieveranderingen van het eiwit zijn alleen te wijten aan de laterale beweging van het eiwit in het membraan. Representatieve resultaten worden getoond met behulp van het mitochondriale eiwittranslocatiekanaal TOM-CC en het bacteriële kanaal OmpF. In tegenstelling tot OmpF is de gating van TOM-CC zeer gevoelig voor moleculaire opsluiting en de aard van laterale diffusie. Daarom zijn ondersteunde droplet-interface bilayers een krachtig hulpmiddel om het verband tussen laterale diffusie en de functie van ionkanalen te karakteriseren.

Real-time elektrodevrije optische eenkanaalsopname onthult het samenspel tussen laterale eiwitbeweging en de functie van individuele ionkanalen in DIB-membranen. Reconstitutie van het mitochondriale TOM-kerncomplex (figuur 1A) in een DIB-membraan (figuur 4D) illustreert een sterke temporele correlatie tussen laterale mobiliteit en ionenpermeabiliteit (figuur 5A). De TOM-CC gating lijkt gevoelig te zijn voor de modus van zijdelingse beweging17. Bewegende kanalen vertonen Ca2+ flux door hun poriën en hoge fluorescentiepuntintensiteiten. Ingesloten, niet-bewegende moleculen vertonen lage en gemiddelde fluorescentie-intensiteiten. Voor de algemene eiwitimportporie van mitochondriën TOM-CC onthulde deze benadering met één molecuul een sterke temporele correlatie tussen laterale mobiliteit en ionenpermeabiliteit, wat suggereert dat het TOM-CC-kanaal mechanosensitieve eigenschappen heeft17. Een laterale stop van vrij bewegende TOM-CC-moleculen gaat gepaard met een gedeeltelijke of volledige sluiting van het TOM-CC-kanaal. Het afbeelden van DIB-membranen met OmpF (figuur 1E en figuur 4F), dat bijna volledig in het membraan is ingebed, toont geen stop-and-go-effecten (figuur 5B). Willekeurige stops van OmpF zijn niet geassocieerd met een verandering in intensiteit en dus met het sluiten van de poriën. Op basis van de fluorescentiesignalen38 kan de positionele nauwkeurigheid van de afzonderlijke kanalen worden geschat in het bereik tussen 5 en 10 nm. Er moet echter worden opgemerkt dat deze nauwkeurigheid niet kan worden bereikt als de kanalen enigszins wiebelen als gevolg van mobiele verankering met de agarose-hydrogel, zoals bijvoorbeeld wordt getoond voor de TOM-CC-moleculen in een tussentoestand met een wortelgemiddelde verplaatsing van 120 nm (figuur 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figuur 1: Isolatie van TOM-CC. (A) Cryo EM-structuur van N. crassa TOM-CC30,39. Mitochondriën van een N. crassa-stam met een Tom22 met een 6xHis-tag werden opgelost in DDM en onderworpen aan Ni-NTA-affiniteitschromatografie (B) en anionenwisselingschromatografie (C). (D) SDS-PAGE van geïsoleerde TOM-CC. (E) Kristalstructuur (VOB, 1OPF) en (F) SDS-PAGE van gezuiverde E. coli OmpF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figuur 2: Stroomschema van pmma-kamerassemblage. Stap 1: Een glazen coverslip wordt gecoat met een agarose hydrogel. Stap 2: De spin-coated coverslip wordt gemonteerd in een op maat gemaakte PMMA microscopiekamer. Stap 3: Extra laagsmeltende agarose wordt toegevoegd aan de inlaatpoort van de PMMA-kamer op een hete plaat van 35 °C. Stap 4: Lipide monolagen worden gevormd rond waterige druppels op een buffer/olie interface (links) en op de agarose hydrogel/olie interface (rechts). Stap 5: Individuele waterige druppels worden in de putjes van de PMMA-kamer gepipetteerd om een lipide dubbellaag te vormen bij contact van de twee lipide monolagen. Stap 6: De vorming van de DIB-membranen wordt gevalideerd door Hofmann modulatiecontrastmicroscopie. Stap 7: Beelden van geselecteerde gebieden van de DIB-membranen met ingebrachte ionkanalen worden verkregen door TIRF-microscopie. Groen: 0,75% agarose; geel: 2,5% agarose met Ca2+ ionen; magenta: lipide/olie fase; donkerblauw: waterige druppelbuffer met Ca2+-gevoelige kleurstof en eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figuur 3: Experimentele opstelling. (A) Schematische weergave van een DIB-membraan in een PMMA-put. De dubbellaag rust op een ultradunne 0,75% agarosefilm om TIRF-beeldvorming van Ca 2+-flux door een ionkanaal in de loop van de tijd mogelijk te maken met behulp van een Ca2+-gevoelige fluorescentiekleurstof (Fluo-8) in trans. (B) De Ca2+-flux wordt uitsluitend geregeld door de osmotische druk van cis naar trans. Dit maakt zowel de bepaling van de positie in het membraan als de open-gesloten toestand van het kanaal mogelijk. Het hier getoonde kanaal is het eiwitgeleidende kanaal TOM-CC van N. crassa mitochondriën30. (C) Traject van een enkel TOM-CC kanaal. Groen: bewegend kanaal; geel: niet-bewegend kanaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figuur 4: Imaging TOM-CC en OmpF in DIB membranen . (A) DIB membraan in beeld gebracht door Hoffmann modulatie contrast microscopie van het dubbellaagse contactoppervlak tussen de hydrogel en de druppel. (B) Gebroken DIB-membraan afgebeeld als in (A). Pijl, rand van PMMA-kamer. (C) DIB-membraan in beeld gebracht door TIRF-microscopie zonder eiwitkanalen. (D) DIB-membraan met gereconstitueerde TOM-CC, in beeld gebracht met TIRF-microscopie. De witte vierkanten markeren vlekken van hoge (SH), intermediaire (SI) en lage (SL) intensiteit. (E) Het aanpassen van het fluorescentie-intensiteitsprofiel van de drie onder (A) gemarkeerde vlekken aan tweedimensionale Gaussische functies onthult de positie van individuele TOM-CC's en de Ca2+ flux door het kanaal. F) DIB-membraan met gereconstitueerde OmpF. (G) Gaussische pasvorm van de fluorescerende vlek gemarkeerd in (F). In tegenstelling tot het twee-porie β-barrel eiwitcomplex TOM-CC, onthult de drie-porie β-barrel OmpF slechts één permeabiliteitstoestand. Pixelgrootte, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figuur 5: Kanaalactiviteit correleert met laterale mobiliteit van TOM-CC. (A) Het fluorescerende amplitudespoor (boven) en het overeenkomstige traject (onder) van TOM-CC geven aan dat de open-gesloten kanaalactiviteit van TOM-CC correleert met de laterale membraanmobiliteit van het complex. Het traject vertoont drie permeabiliteitstoestanden. Groen: volledig open staat; geel: tussenliggende permeabiliteitstoestand; rood: gesloten kanaalstatus; rode ster: TOM-CC in de tussenliggende toestand wiebelt rond zijn gemiddelde positie met ongeveer ±60 nm. De positionele nauwkeurigheid37 op basis van de fluorescentiesignalen in de volledig open en tussenliggende toestanden varieert tussen 5 nm en 10 nm. (B) Fluorescerend amplitudespoor (boven) en corresponderend traject (onder) van OmpF. OmpF onthult slechts één intensiteitsniveau, ongeacht of het in beweging is of vastzit. De trajectsegmenten die overeenkomen met de tijdsperioden van gevangen moleculen zijn grijs gemarkeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Reagensconcentraties</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (m/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 10% (v/v) glycerol, 300 mM NaCl en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glycerol, 1 M Imidazool en 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (m/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Ontgassen en voor gebruik door een filter van 0,22 μm gaan.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Bufferoplossingen voor TOM-CC isolatie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer </td>
			<td colspan="3">Reagensconcentraties</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>POND*</td>
			<td colspan="3">1% (w/v) trypton, 1% (w/v) NaCl en 0,5% (w/v) gistextract</td>
			<td>1100 ml</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2, en ~ 750 eenheden DNAse en 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (m/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 2 mM β-mercaptoethanol en 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl en 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (m/v) octylpolyoxyethyleen (octyl-POE), 1 mM EDTA en 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Steriliseren voor gebruik.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Bufferoplossingen voor OmpF-isolatie.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Ionkanalen zijn niet statisch in biologische membranen. Hier presenteren we een optische benadering met één molecuul om het verband tussen laterale membraandiffusie en ionkanaalfunctie te ontrafelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden is dat fluorescerende etikettering van eiwitten die hun laterale beweging en functie kunnen verstoren, niet vereist is.De methode kan worden toegepast op elk membraaneiwitkanaal waar vrije of beperkte diffusie belangrijk is voor organisatie en functie. Breng om te beginnen 380 microliter van de DPhPC-stamoplossing over in een glazen injectieflacon en bedek de lipide-stamoplossing met argon of stikstofgas om lipide-oxidatie te voorkomen. Gebruik een zo laag mogelijke gasstroom om verdamping van het organische oplosmiddel waarin de lipiden zijn opgelost of spatten van de oplosmiddelsprays uit de injectieflacon te voorkomen.Droog het lipidenmonster onder een stikstofstroom en verwijder het resterende organische oplosmiddel onder vacuüm uit het lipidenmonster met behulp van een olievrije vacuümpomp gedurende een nacht. Los de lipidefilm op in een hexadecaan siliconenolie-oplossing door gelijke volumes hexadecaan en siliconenolie toe te voegen met behulp van een pipet van één milliliter tot een uiteindelijke lipideconcentratie van 9,5 milligram per milliliter. Plaats enkele glazen coverslips in een roestvrijstalen coversliphouder en reinig ze in een glazen beker gedurende ongeveer 10 minuten met aceton in een ultrasone reiniger.Spoel de afdekstroken af met dubbel gedeïoniseerd water en droog ze onder een stroom stikstof. Reinig en hydrofyliseer verder een dekplaat in een plasmareiniger met zuurstof gedurende vijf minuten. Monteer een met plasma behandelde coverslip op een spincoater en bekleed de coverslip met een sub-micrometer dikke film van agarose door langzaam 140 microliter verwarmde 0,75% laagsmeltende agarose toe te voegen met een pipet van 200 microliter bij 3.000 RPM gedurende 30 seconden.Bevestig de met spincoating bedekte coverslip met de dunne laag van de agarose hydrogel onmiddellijk aan de onderkant van de PMMA-kamer. Zorg ervoor dat de agarose hydrogel naar boven wijst. Bevestig de randen van de coverslip met transparant plakband aan het PMMA micro-machinaal apparaat en plaats het apparaat op een hete plaat die is verwarmd tot 35 graden Celsius.Giet voorzichtig 200 microliter 2,5% agarose-oplossing in de inlaat van de kamer zonder luchtbellen te creëren. Bedek onmiddellijk de putten van de PMMA-kamer met ongeveer 60 microliter van de lipideolie-oplossing om de vorming van lipidemonolaag op het agarose-olie-grensvlak te initiëren om uitdroging van de met spin gecoate agarose in de putten van de PMMA-kamer te voorkomen. Plaats het apparaat ongeveer twee uur op een hete plaat bij 35 graden Celsius.Plaats ongeveer 20 microliter lipide hexadecane siliconenolie-oplossing in elk van de verschillende micro-gefabriceerde putten in een druppelincubatiekamer. Bereid een microcapillaire glazen naald met een tipopeningsdiameter van ongeveer 20 micrometer met behulp van een verticale of horizontale micropipettrekker. Vul de naald met ongeveer vijf microliter waterige injectieoplossing met 8,8 millimolaire HEPES, zeven micromolaire van een fluorescerende kleurstof, Fluo-8, 400 micromolaire EDTA, 1,32 molaire kaliumchloride en 30 nanomolaire TOM-kerncomplex of als alternatief 20 nanomolaire OMPF.Monteer de naald met de waterige injectieoplossing op een piëzo-aangedreven nano-injector en injecteer 100 tot 200 nanoliter waterige druppels in de putjes in de druppelincubatiekamer gevuld met lipide hexadecane siliconenolie-oplossing met behulp van de nanoinjector. Laat de vorming van een lipide monolaag op het druppelolie-interface gedurende ongeveer twee uur door de PMMA- en druppelincubatiekamers op een hete plaat te houden die wordt verwarmd tot 35 graden Celsius. Breng handmatig individuele waterige druppels over van de putten van de druppelincubatiekamer in de putten van de PMMA-kamer met behulp van een eenkanaals microliterpipet met een polypropyleen wegwerptip van 10 microliter.Laat de druppels op de lipide monolagen op de hydrogel-olie interfaces zakken om een lipide bilayer te vormen tussen de druppels en de agarose hydrogel. Monteer de PMMA-kamer met de druppelinterface dubbellaagse of DIB-membranen op de monsterhouder van een omgekeerd lichtmicroscoop en beoordeel de membraanvorming met behulp van een 10x Hoffman-modulatiecontrastobjectief. Als DIB-membranen zijn gevormd, monteer dan de PMMA-kamer op de monsterhouder van een TIRF-microscoop uitgerust met een conventionele lichtbron voor epifluorescentieverlichting, een 488 nanometer laser en een terugverlichte elektronenvermenigvuldigende CCD-camera om een pixelgrootte van ongeveer 0,16 micrometer te bereiken.Focus de rand van een DIB-membraan met een 10x vergrotingsobjectief onder epifluorescentieverlichting met een lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset. Fijnfocus op dezelfde rand van het DIB-membraan bij hoge vergroting met een 100x NA 1.49 apochromatische olie TIRF-objectief, opnieuw onder epifluorescentieverlichting met een lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset. Wijzig de filterinstelling van GFP naar de quad-band TIRF-filterset, schakel de 488 nanometer laser in en stel de intensiteit van de laser in op de objectieflens.Om afzonderlijke ionkanalen te visualiseren, past u de TIRF-hoek en EM CCD-cameraversterking aan, zodat de open ionkanalen in het DIB-membraan verschijnen als fluorescerende vlekken met hoog contrast op een donkere achtergrond en de signaal-achtergrondverhouding een maximum bereikt. Zorg ervoor dat de vlekken die overeenkomen met de calciumionenflux door enkele ionkanalen scherp blijven en een ronde vorm hebben met een hoge intensiteit in het midden en geleidelijk afnemend naar de periferie. Controleer of de fluorescerende vlekken scherp zijn om ervoor te zorgen dat de ionkanalen zich in de DIB-membranen hebben gereconstitueerd en zijdelings in het membraanvlak bewegen.Neem ten slotte een reeks membraanbeelden op waarmee de positie en bewaking van de open gesloten toestand van de afzonderlijke ionkanalen goed kunnen worden gevolgd. Om het type laterale mobiliteit en de toestand van kanaalactiviteit te bepalen, moet u voldoende lange en goed bemonsterde trajecten verwerven. Cryo EM structuur van Neurospora crassa TOM-CC wordt hier getoond.Mitochondriën van een N.crassa-vlek met een TOM 22 met een 6-His-tag werden opgelost in DDM en onderworpen aan nikkel-NTA-affiniteitschromatografie en anionenuitwisselingschromatografie. SDS-PAGE van geïsoleerde TOM-CC kristalstructuur en SDS-PAGE van gezuiverde E.coli OMPF gebruikt voor vergelijking worden hier getoond. Het fluorescerende amplitudespoor in het overeenkomstige traject van TOM-CC geeft aan dat de open-gesloten kanaalactiviteit van TOM-CC correleert met de laterale membraanmobiliteit van het complex.Het amplitudespoor geeft drie permeabiliteitstoestanden weer: volledig open toestand die overeenkomt met bewegende kanalen, tussenliggende permeabiliteitstoestand en gesloten kanaaltoestand die overeenkomt met niet-bewegende kanalen. TOM-CC in de tussenliggende toestand wiebelt rond zijn gemiddelde positie met ongeveer plus / min 60 nanometer. Het fluorescerende amplitudespoor in het overeenkomstige traject van OMPF wordt hier weergegeven.OMPF onthult slechts één intensiteitsniveau in vergelijking met TOM-CC, ongeacht of het in beweging is of vastzit. De trajectsegmenten die overeenkomen met de tijdsperioden van gevangen moleculen zijn grijs gemarkeerd. Een belangrijk ding om op te merken is dat deze methode enkelvoudige membraaneiwitten analyseert in een intacte membraanomgeving.De dynamiek van membraaneiwitten zal in de nabije toekomst een horizon blijven voor wetenschappelijke studies. We verwachten dat onze methode een belangrijke bijdrage levert aan dit veld.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...