Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Nous remercions Beate Nitschke pour son aide dans la préparation des protéines et Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) et Maximilan Ulbrich (Fribourg) pour leurs discussions perspicaces. Ce travail a été soutenu par le Centre de recherche de Stuttgart Systems Biology (SRCSB) et une subvention de la Fondation du Bade-Wurtemberg (BiofMO-6 to SN).

Nous ne déclarons aucun conflit d’intérêts.

Le protocole présenté ici fournit une introduction à l’utilisation des membranes DIB pour étudier l’interaction entre le mouvement du canal ionique latéral et la fonction du canal à l’aide de la microscopie TIRF à molécule unique. Pour obtenir les meilleures données possibles, la préparation de membranes DIB stables avec autant de canaux bien séparés que possible est cruciale pour obtenir des séries temporelles de particules individuelles, qui peuvent être analysées de manière satisfaisante.
Les paramètres critiques à optimiser comprennent le choix des lipides, la concentration en lipides dans la phase huileuse et les concentrations en protéines et en détergents dans les gouttelettes aqueuses. Les lipides employés sont inhabituels, en ce sens qu’ils ne montrent pas de transition de phase claire à basse température. Le DPhPC est un lipide couramment utilisé pour produire des systèmes membranaires stables40. En principe, tout lipide qui maintient son environnement fluide à basse température peut convenir à cette application. De plus, le lipide ne doit pas être sensible à l’oxydation. La concentration de détergent dans les gouttelettes doit être aussi faible que possible pour éviter la rupture de la membrane. Des membranes stables et de bons taux d’incorporation des protéines sont généralement obtenus avec des concentrations de détergent inférieures à la concentration micellaire critique (cmc), étant donné que la protéine membranaire ne précipite pas.
Si les membranes DIB ne tolèrent pas les détergents spécifiques21,41, ou si les protéines ne s’intègrent pas à partir d’une solution de faible détergent dans les membranes DIB, les canaux protéiques peuvent d’abord être reconstitués en petites vésicules lipidiques unilamellaires (SUV), qui sont ensuite fusionnées aux membranes DIB du côté gouttelettes, comme cela a été démontré avec succès pour E. coli MscL 42 . Parfois, les membranes DIB ne se forment pas parce que la concentration de lipides dans la phase huileuse est trop faible. Pour éviter l’éclatement des membranes DIB, il faut également savoir que la pression osmotique entre l’hydrogel et la gouttelette doit être équilibrée avec précision sans affecter excessivement le flux Ca2+ de cis à trans. L’optimisation de l’épaisseur de l’agarose et de la taille des mailles semble cruciale pour observer la diffusion des protéines membranaires. Tout séchage de la couche d’agarose doit être évité. L’épaisseur peut être déterminée par microscopie à force atomique17. En faisant varier la concentration, le volume et la vitesse de rotation de l’agarose pendant le revêtement par essorage, la taille et l’épaisseur du maillage de l’hydrogel peuvent être optimisées. Notez cependant que l’épaisseur de la couche d’hydrogel affecte le contraste de l’image. Pour capturer les protéines membranaires dans les DIB, l’hydrogel d’agarose peut être remplacé par de l’agarose synthétisée sur mesure, non réticulée, modifiée par Ni-NTA et à bas point de fusion pour les piéger via un His-tag17. Un fond de fluorescence excessivement élevé est souvent causé par la rupture des membranes DIB. C’est particulièrement un problème avec les chambres multi-puits, car le colorant sensible au Ca2+ diffuse dans l’hydrogel. Dans ce cas, les puits adjacents doivent être évités. Le blanchiment par fluorescence du colorant sensible au Ca2+ au-dessus de la membrane ne devrait pas être un facteur limitant important, car il est échangé par des colorants non excités dans la majeure partie de la gouttelette (figure 3A) à l’extérieur du champ évanescent TIRF. La précision de localisation de la protéine est donnée par la précision de l’ajustement des taches et de la taille des pixels.
Les signaux de fluorescence faibles peuvent être causés par un faible flux de Ca2+ à travers le canal. Les raisons possibles incluent: (i) des réglages TIRF inexacts (par exemple, intensité laser), (ii) la pression osmotique Ca 2+ à travers la membrane, ou (iii) la perméabilité intrinsèque Ca2+ des canaux est trop faible. Pour faire face au premier problème, l’intensité laser, l’angle TIRF et le gain de la caméra doivent être optimisés. Ces deux derniers problèmes peuvent être surmontés par l’application d’un potentiel électrique à travers la membrane 2,43. Cependant, l’application de tensions externes peut fausser le résultat, car les effets électriques peuvent influencer l’ouverture du canal des canaux ioniques dépendants du ligand ou mécanosensibles qui ne sont en réalité pas contrôlés par la tension. Des exemples de tels canaux sont la protéine mitochondriale translocase TOM-CC27, et sa sous-unité formant des canaux Tom40 26,44,45,46. Enfin, il convient de noter que l’insertion de protéines membranaires dans les membranes DIB dans une orientation spécifique pour atteindre une fonctionnalité souhaitée est délicate, et les études quantitatives sont rares47,48. Dans certains cas, l’orientation des protéines intégrées est aléatoire. C’est un problème sérieux pour l’étude des protéines membranaires, car certaines protéines membranaires ne sont activées que d’un seul côté de la membrane.
La microscopie TIRF est une méthode puissante pour traiter les événements monomoléculaires dans les membranes supportées planaires49. Les exemples incluent l’élucidation par voie d’assemblage et de repliement de protéines de canal telles que la α-hémolysine50, la perfringolysine O 51 et l’OmpG52. Ces études incluaient FRET comme technique supplémentaire. De plus, l’activation du canal ionique mécanosensible MscL a déjà été étudiée par stimulation mécanique des bicouches DIBsupportées 42 à l’aide de mesures de courant. Sur la base de ces travaux, des études futures pourraient combiner la plate-forme décrite ici avec des expériences FRET à molécule unique pour traiter les canaux mécanosensibles au niveau de la molécule unique de manière optique17. L’injection de tampon dans la gouttelette, l’étirement de la monocouche DIB interne ou la liaison ciblée de canaux individuels à l’hydrogel sous-jacent peuvent être utilisés pour étudier plus avant non seulement le mécanisme physique des canaux activés mécaniquement, qui répondent à la tension et/ou à la courbure de la membrane, comme indiqué pour MscL et MscS, les canaux K+ à deux pores, TREK-1, TREK-2, et TRAAK, et PIEZO (pour examen, voir53), mais aussi la liaison locale au cytosquelette cellulaire, comme le montre le canal ionique tactile NOMPC54,55.

Le présent protocole vise à décrire comment étudier la corrélation entre la mobilité membranaire et la perméabilité des canaux ioniques des protéines membranaires dans les membranes bicouches à interface gouttelettes (DIB)supportées par polymère 1,2,3.
La technique actuelle complète une gamme impressionnante d’outils optiques et analytiques de surface avancés, tels que le suivi des particules uniques 4,5, la spectroscopie de corrélation de fluorescence6,7 et la microscopie à force atomique à grande vitesse 8,9,10. Ceux-ci fournissent des informations précieuses sur la composition dynamique et la structure des membranes qui influencent les réactions membranaires11,12,13. Alors que le mouvement et la diffusion latérale des protéines dépendent de la densité locale des protéines dans la membrane, les molécules protéiques individuelles peuvent également être piégées dans des radeaux lipidiques14 et par des interactions protéine-protéine15,16. Selon les domaines protéiques dépassant de la membrane dans l’environnement extracellulaire ou cytosol, la mobilité des protéines peut varier de très mobile à complètement immobile. Cependant, en raison de la complexité de la membrane et de ses structures périphériques, il est souvent difficile de déchiffrer l’interaction entre la nature de la mobilité latérale et la fonction protéique17.
Les membranes DIB se sont révélées être une plate-forme efficace pour les analyses biophysiques à molécule unique des protéines membranaires 18,19,20,21,22. Ils sont formés par auto-assemblage lipidique par contact de gouttelettes aqueuses avec des substrats supportés par hydrogel dans une phase lipidique / huileuse. Semblables aux bicouches lipidiques supportées (SLB)1,23,24,25 couramment utilisées, les DIB permettent un réglage local de la mobilité latérale par liaison temporaire ou permanente des protéines à la matrice polymère lorsqu’elles sont fonctionnalisées avec des ligands appropriés17. Ce dernier peut servir de système modèle pour les processus biochimiques dans les membranes cellulaires avec une distribution protéique hétérogène10.
L’approche expérimentale décrite ici repose sur la fluorescence de colorants sensibles au Ca 2+ pour mesurer le flux d’ions Ca 2+ à travers des canaux individuels à proximité immédiate de la membrane 2,22 à l’aide de la microscopie TIRF. Cette approche optique limite l’éclairage de l’échantillon à une distance proche de la membrane, ce qui, en raison des propriétés physiques de la lumière d’excitation évanescente, conduit à une réduction significative du fond de fluorescence. Ce dernier est une condition préalable si une résolution spatiale et temporelle élevée est requise pour la détection de molécules uniques. Contrairement aux méthodes électrophysiologiques classiques26,27, aucune tension membranaire n’est nécessaire pour étudier le flux d’ions à travers des canaux individuels. De plus, la méthode ne nécessite pas de marquage avec des colorants fluorescents ou des molécules qui pourraient interférer avec le mouvement latéral des canaux dans la membrane.
La méthode est particulièrement utile pour étudier les canaux protéiques intégrés dans la membrane au niveau de la molécule unique sans utiliser l’électrophysiologie classique. En utilisant le canal conducteur de protéines mitochondriales TOM-CC de Neurospora crassa28,29,30 et OmpF, qui soutient la diffusion de petites molécules hydrophiles à travers la membrane externe d’Escherichia coli17,31, nous illustrons comment les mobilités membranaires et les activités des canaux des deux protéines peuvent être étudiées et corrélées. Nous suggérons que cette approche, bien qu’optimisée pour TOM-CC et OmpF, peut être facilement appliquée à d’autres canaux protéiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Les techniques d’imagerie à haute résolution ont montré que de nombreux canaux ioniques ne sont pas statiques, mais soumis à des processus hautement dynamiques, y compris l’association transitoire de sous-unités porogènes et auxiliaires, la diffusion latérale et le regroupement avec d’autres protéines. Cependant, la relation entre la diffusion latérale et la fonction est mal comprise. Pour aborder ce problème, nous décrivons comment la mobilité latérale et l’activité des canaux individuels dans les membranes lipidiques soutenues peuvent être surveillées et corrélées à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). Les membranes sont fabriquées sur un substrat d’hydrogel ultramince à l’aide de la technique DIB (Droplet Interface Bilayer). Par rapport à d’autres types de membranes modèles, ces membranes ont l’avantage d’être mécaniquement robustes et adaptées à des techniques analytiques très sensibles. Ce protocole mesure le flux d’ions Ca 2+ à travers des canaux simples en observant l’émission de fluorescence d’un colorant sensible au Ca2+ à proximité de la membrane. Contrairement aux approches classiques de suivi d’une seule molécule, aucune protéine de fusion fluorescente ou marqueur, qui peut interférer avec le mouvement latéral et la fonction dans la membrane, n’est nécessaire. Les changements possibles dans le flux ionique associés aux changements conformationnels de la protéine ne sont dus qu’au mouvement latéral de la protéine dans la membrane. Des résultats représentatifs sont présentés en utilisant le canal de translocation de protéines mitochondriales TOM-CC et le canal bactérien OmpF. Contrairement à l’OmpF, le gating du TOM-CC est très sensible au confinement moléculaire et à la nature de la diffusion latérale. Par conséquent, les bicouches d’interface gouttelettes prises en charge sont un outil puissant pour caractériser le lien entre la diffusion latérale et la fonction des canaux ioniques.

L’enregistrement optique monocanal sans électrode en temps réel révèle l’interaction entre le mouvement latéral des protéines et la fonction des canaux ioniques individuels dans les membranes DIB. La reconstitution du complexe mitochondrial TOM (Figure 1A) en membrane DIB (Figure 4D) illustre une forte corrélation temporelle entre la mobilité latérale et la perméabilité ionique (Figure 5A). Le point de contrôle TOM-CC semble être sensible au mode de mouvement latéral17. Les canaux mobiles montrent un flux Ca2+ à travers leurs pores et des intensités de point de fluorescence élevées. Les molécules piégées et immobiles présentent des intensités de fluorescence faibles et moyennes. Pour le pore général d’importation de protéines des mitochondries TOM-CC, cette approche à molécule unique a révélé une forte corrélation temporelle entre la mobilité latérale et la perméabilité ionique, suggérant que le canal TOM-CC a des propriétés mécanosensibles17. Un arrêt latéral des molécules TOM-CC en mouvement libre s’accompagne d’une fermeture partielle ou complète du canal TOM-CC. L’imagerie des membranes DIB avec OmpF (Figure 1E et Figure 4F), qui est presque entièrement intégrée dans la membrane, ne montre aucun effet stop-and-go (Figure 5B). Les arrêts aléatoires d’OmpF ne sont pas associés à un changement d’intensité et, par conséquent, à la fermeture de ses pores. Sur la base des signaux de fluorescence38, la précision de position des canaux individuels peut être estimée dans la plage comprise entre 5 et 10 nm. Cependant, il convient de noter que cette précision ne peut être atteinte si les canaux vacillent légèrement en raison de l’ancrage mobile avec l’hydrogel d’agarose, comme le montre, par exemple, les molécules TOM-CC à l’état intermédiaire avec un déplacement moyen racinaire de 120 nm (Figure 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figure 1 : Isolation de TOM-CC. (A) Structure Cryo EM de N. crassa TOM-CC30,39. Les mitochondries d’une souche de N. crassa contenant un Tom22 avec une étiquette 6xHis ont été solubilisées dans DDM et soumises à une chromatographie d’affinité Ni-NTA (B) et à une chromatographie par échange d’anions (C). (D) FDS-PAGE du TOM-CC isolé. (E) Structure cristalline (PDB, 1OPF) et (F) FDS-PAGE d’E. coli OmpF purifié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figure 2 : Organigramme de l’assemblage de la chambre en PMMA. Étape 1: Une lamelle de couverture en verre est recouverte d’un hydrogel d’agarose. Étape 2: Le couvercle enduit d’essorage est monté dans une chambre de microscopie en PMMA sur mesure. Étape 3: De l’agarose supplémentaire à bas point de fusion est ajoutée dans l’orifice d’entrée de la chambre en PMMA sur une plaque chauffante à 35 °C. Étape 4 : Les monocouches lipidiques sont formées autour de gouttelettes aqueuses à l’interface tampon/huile (à gauche) et à l’interface agarose hydrogel/huile (à droite). Étape 5: Des gouttelettes aqueuses individuelles sont pipetées dans les puits de la chambre en PMMA pour former une bicouche lipidique au contact des deux monocouches lipidiques. Étape 6 : La formation des membranes DIB est validée par microscopie à contraste de modulation de Hofmann. Étape 7 : Les images de zones sélectionnées des membranes DIB avec des canaux ioniques insérés sont acquises par microscopie TIRF. Vert : agarose à 0,75 %; jaune : agarose à 2,5 % contenant des ions Ca2+ ; magenta: phase lipidique / huileuse; bleu foncé : tampon aqueux de gouttelettes contenant un colorant et des protéines sensibles au Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figure 3 : Installation expérimentale. (A) Représentation schématique d’une membrane DIB dans un puits en PMMA. La bicouche repose sur un film d’agarose ultramince à 0,75 % pour permettre l’imagerie TIRF du flux Ca 2+ à travers un canal ionique au fil du temps à l’aide d’un colorant de fluorescence sensible au Ca2+ (Fluo-8) en trans. (B) Le flux Ca2+ est contrôlé exclusivement par la pression osmotique de cis à trans. Cela permet à la fois de déterminer la position dans la membrane et l’état ouvert-fermé du canal. Le canal montré ici est le canal conducteur de protéines TOM-CC de N. crassa mitochondria30. (C) Trajectoire d’un seul canal TOM-CC. Vert : canal mobile; jaune : canal immobile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figure 4 : Imagerie TOM-CC et OmpF dans les membranes DIB. (A) Membrane DIB imagée par microscopie de contraste à modulation Hoffmann montrant la zone de contact bicouche entre l’hydrogel et la gouttelette. (B) Membrane DIB brisée imagée comme en (A). Flèche, bord de la chambre en PMMA. (C) Membrane DIB imagée par microscopie TIRF sans canaux protéiques. (D) Membrane DIB avec TOM-CC reconstitué, imagée par microscopie TIRF. Les carrés blancs marquent les taches d’intensité élevée (SH), intermédiaire (SI) et faible (SL). (E) L’ajustement du profil d’intensité de fluorescence des trois taches marquées en (A) aux fonctions gaussiennes bidimensionnelles révèle la position des TOM-CC individuels et le flux Ca2+ à travers le canal. F) Membrane DIB avec OmpF reconstitué. (G) Ajustement gaussien de la tache fluorescente marquée en (F). Contrairement au complexe protéique à deux pores à β barils TOM-CC, l’OmpF à β barils à trois pores ne révèle qu’un seul état de perméabilité. Taille des pixels, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figure 5 : L’activité du canal est en corrélation avec la mobilité latérale du TOM-CC. (A) La trace d’amplitude fluorescente (en haut) et la trajectoire correspondante (en bas) de TOM-CC indiquent que l’activité du canal ouvert-fermé de TOM-CC est en corrélation avec la mobilité de la membrane latérale du complexe. La trajectoire affiche trois états de perméabilité. Vert : état entièrement ouvert ; jaune: état de perméabilité intermédiaire; rouge : état du canal fermé ; étoile rouge: TOM-CC à l’état intermédiaire oscille autour de sa position moyenne d’environ ±60 nm. Les précisions de position37 basées sur les signaux de fluorescence dans les états complètement ouverts et intermédiaires vont entre 5 nm et 10 nm. (B) Trace d’amplitude fluorescente (en haut) et trajectoire correspondante (en bas) de l’OmpF. L’OmpF ne révèle qu’un seul niveau d’intensité, qu’il soit en mouvement ou piégé. Les segments de trajectoire correspondant aux périodes de temps des molécules piégées sont marqués en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tampon </td>
			<td colspan="3">Concentrations de réactifs</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (p/v) de n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM), 10 % (v/v) de glycérol, 300 mM de NaCl et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (p/v) DDM, 10 % (v/v) glycérol, 1 M d’imidazole et 1 mM de PMSF</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1 % (p/v) DDM, 2 % (v/v) diméthylsulfoxyde (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1 % (p/v) DDM, 1 M KCl, 2 % (v/v) diméthylsulfoxyde (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Dégazer et passer à travers un filtre de 0,22 μm avant utilisation.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Solutions tampons pour l’isolation TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tampon </td>
			<td colspan="3">Concentrations de réactifs</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1 % (p/v) tryptone, 1 % (p/v) NaCl et 0,5 % (p/v) extrait de levure</td>
			<td>1100 mL</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2, et ~750 unités DNAse et 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS), 2 mM β-mercaptoéthanol et 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2 % (p/v) SDS, 500 mM NaCl et 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5 % (p/v) de polyoxyéthylène octyle (POE octyle), 1 mM EDTA et 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Stériliser avant utilisation.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Solutions tampons pour l’isolation OmpF.

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Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie TIRF pour suivre les canaux ioniques individuels et déterminer leur activité dans les membranes lipidiques soutenues, définissant ainsi l’interaction entre le mouvement de la membrane latérale et la fonction des canaux. Il décrit comment préparer les membranes, enregistrer les données et analyser les résultats.

Imagerie à molécule unique de la mobilité latérale et de l’activité des canaux ioniques dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Les canaux ioniques ne sont pas statiques dans les membranes biologiques. Nous présentons ici une approche optique à molécule unique pour démêler le lien entre la diffusion de la membrane latérale et la fonction du canal ionique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes est que le marquage fluorescent des protéines qui pourraient interférer avec leur mouvement latéral et leur fonction n’est pas nécessaire.La méthode peut être appliquée à n’importe quel canal protéique membranaire où la diffusion libre ou restreinte est importante pour l’organisation et la fonction. Pour commencer, transférez 380 microlitres de la solution mère DPhPC dans un flacon en verre et superposez la solution mère lipidique avec de l’argon ou de l’azote gazeux pour empêcher l’oxydation des lipides. Utilisez le débit de gaz le plus faible possible pour éviter l’évaporation du solvant organique dans lequel les lipides sont dissous ou les éclaboussures des pulvérisations de solvant du flacon.Sécher l’échantillon lipidique sous un jet d’azote et retirer le solvant organique restant de l’échantillon lipidique sous vide à l’aide d’une pompe à vide sans huile pendant la nuit. Dissoudre le film lipidique dans une solution d’huile de silicone hexadécane en ajoutant des volumes égaux d’hexadécane et d’huile de silicone à l’aide d’une pipette d’un millilitre à une concentration lipidique finale de 9,5 milligrammes par millilitre. Placez quelques lamelles de couverture en verre dans un porte-lamelles en acier inoxydable et nettoyez-les dans un bécher en verre pendant environ 10 minutes avec de l’acétone dans un nettoyeur à ultrasons.Rincez les lamelles de couverture avec de l’eau double désionisée et séchez-les sous un jet d’azote. De plus, nettoyez et hydrophylisez une lamelle de couverture dans un nettoyant au plasma avec de l’oxygène pendant cinq minutes. Montez un couvercle traité au plasma sur un enrobage et enduisez le couvercle d’un film d’agarose d’une épaisseur inférieure au micromètre en ajoutant lentement 140 microlitres d’agarose chauffée à bas point de fusion à 0,75% avec une pipette de 200 microlitres à 3 000 tr / min pendant 30 secondes.Fixez immédiatement la lamelle de couverture enduite d’essorage avec la fine couche d’hydrogel d’agarose à la face inférieure de la chambre en PMMA. Assurez-vous que l’hydrogel d’agarose pointe vers le haut. Fixez les bords de la lamelle de couverture au dispositif micro-usiné en PMMA avec du ruban adhésif transparent et placez l’appareil sur une plaque chauffante chauffée à 35 degrés Celsius.Versez soigneusement 200 microlitres de solution d’agarose à 2,5% dans l’entrée de la chambre sans créer de bulles d’air. Couvrir immédiatement les puits de la chambre en PMMA avec environ 60 microlitres de la solution d’huile lipidique pour initier la formation de monocouche lipidique à l’interface de l’huile d’agarose afin d’éviter la déshydratation de l’agarose enrobée d’essorage dans les puits de la chambre en PMMA. Placez l’appareil sur une plaque chauffante à 35 degrés Celsius pendant environ deux heures.Placez environ 20 microlitres de solution d’huile de silicone hexadécane lipidique dans chacun des nombreux puits microfabriqués dans une chambre d’incubation de gouttelettes. Préparez une aiguille en verre microcapillaire avec un diamètre d’ouverture de pointe d’environ 20 micromètres à l’aide d’un extracteur de micropipette vertical ou horizontal. Remplissez l’aiguille avec environ cinq microlitres de solution d’injection aqueuse contenant 8,8 millimolaires HEPES, sept micromolaires d’un colorant fluorescent, Fluo-8, 400 micromolaires EDTA, 1,32 molaire de chlorure de potassium et 30 nanomolaires TOM core complex ou bien 20 nanomolaires OMPF.Montez l’aiguille avec la solution d’injection aqueuse sur un nanoinjecteur piézo-entraîné et injectez 100 à 200 nanolitres de gouttelettes aqueuses dans les puits de la chambre d’incubation de gouttelettes remplie de solution d’huile de silicone hexadécane lipidique à l’aide du nanoinjecteur. Permettre la formation d’une monocouche lipidique à l’interface gouttelette d’huile pendant environ deux heures en maintenant les chambres d’incubation en PMMA et en gouttelettes sur une plaque chauffante chauffée à 35 degrés Celsius. Transférez manuellement les gouttelettes aqueuses individuelles des puits de la chambre d’incubation des gouttelettes dans les puits de la chambre en PMMA à l’aide d’une pipette microlitre à canal unique avec une pointe en polypropylène jetable de 10 microlitres.Laissez les gouttelettes couler sur les monocouches lipidiques aux interfaces hydrogel-huile pour former une bicouche lipidique entre les gouttelettes et l’hydrogel d’agarose. Montez la chambre en PMMA avec les membranes bicouches ou DIB d’interface gouttelettes sur le porte-échantillon d’un microscope à lumière inversée et évaluez la formation de la membrane à l’aide d’un objectif de contraste de modulation de Hoffman 10x. Si des membranes DIB se sont formées, montez la chambre en PMMA sur le porte-échantillon d’un microscope TIRF équipé d’une source de lumière conventionnelle pour l’éclairage par épifluorescence, d’un laser de 488 nanomètres et d’une caméra CCD multiplicatrice d’électrons rétroéclairée pour atteindre une taille de pixel d’environ 0,16 micromètre.Focalisez le bord d’une membrane DIB avec un objectif de grossissement 10x sous éclairage par épifluorescence avec une source lumineuse de haute intensité à l’aide d’un jeu de filtres GFP. Focalisez finement le même bord de la membrane DIB à fort grossissement avec un objectif TIRF d’huile apochromatique 100x NA 1.49, encore une fois sous éclairage par épifluorescence avec une source lumineuse de haute intensité à l’aide d’un ensemble de filtres GFP. Modifiez le réglage du filtre GFP par le jeu de filtres TIRF quadribande, allumez le laser 488 nanomètres et réglez l’intensité du laser sur l’objectif de l’objectif.Pour visualiser des canaux ioniques uniques, réglez l’angle TIRF et le gain de la caméra CCD EM de sorte que les canaux ioniques ouverts dans la membrane DIB apparaissent comme des taches fluorescentes à contraste élevé sur un fond sombre et que le rapport signal / arrière-plan atteigne un maximum. S’assurer que les taches correspondant au flux d’ions calcium à travers des canaux ioniques simples restent nettes et ont une forme ronde avec une intensité élevée au centre et diminuant progressivement vers la périphérie. Vérifiez que les taches fluorescentes sont nettes pour s’assurer que les canaux ioniques se sont reconstitués dans les membranes DIB et se déplacent latéralement dans le plan de la membrane.Enfin, enregistrez une série d’images membranaires qui permettent un suivi approprié de la position et la surveillance de l’état ouvert-fermé des canaux ioniques individuels. Pour déterminer le type de mobilité latérale et l’état de l’activité des canaux, acquérir des trajectoires suffisamment longues et bien échantillonnées. La structure Cryo EM de Neurospora crassa TOM-CC est montrée ici.Les mitochondries d’une coloration de N.crassa contenant un TOM 22 avec une étiquette 6-His ont été solubilisées dans DDM et soumises à une chromatographie d’affinité au nickel NTA et à une chromatographie par échange d’anions. Les FDS-PAGE de la structure cristalline TOM-CC isolée et les FDS-PAGE d’E. coli purifié OMPF utilisés pour la comparaison sont présentés ici. La trace d’amplitude fluorescente dans la trajectoire correspondante de TOM-CC indique que l’activité du canal ouvert-fermé de TOM-CC est en corrélation avec la mobilité de la membrane latérale du complexe.La trace d’amplitude affiche trois états de perméabilité : l’état d’ouverture complète correspondant aux canaux mobiles, l’état de perméabilité intermédiaire et l’état de canal fermé correspondant aux canaux non mobiles. TOM-CC à l’état intermédiaire oscille autour de sa position moyenne d’environ plus / moins 60 nanomètres. La trace d’amplitude fluorescente dans la trajectoire correspondante de l’OMPF est représentée ici.Le FPMO ne révèle qu’un seul niveau d’intensité par rapport au TOM-CC, qu’il soit en mouvement ou piégé. Les segments de trajectoire correspondant aux périodes de temps des molécules piégées sont marqués en gris. Une chose importante à noter est que cette méthode analyse les protéines à membrane unique dans un environnement membranaire intact.La dynamique des protéines membranaires restera un horizon pour les études scientifiques dans un avenir prévisible. Nous nous attendons à ce que notre méthode contribue de manière significative à ce domaine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Sans tensioactifs ultrarapide Reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques à l’aide de fusogène complémentaire chargée protéoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Recherche

Biochimie

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Microgravimétrie dissipatif pour étudier la dynamique de la liaison des phospholipides Binding Protein annexine A2 de bicouches lipidiques solide soutenu par utilisant un résonateur à Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

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Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

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Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...