Name: single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Wir danken Beate Nitschke für ihre Hilfe bei der Proteinzubereitung und Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) und Maximilan Ulbrich (Freiburg) für aufschlussreiche Gespräche. Diese Arbeit wurde durch das Stuttgarter Forschungszentrum Systembiologie (SRCSB) und ein Stipendium der Baden Württemberg Stiftung (BiofMO-6 bis SN) unterstützt.

Wir erklären keine Interessenkonflikte.

Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine Einführung in die Verwendung von DIB-Membranen zur Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Lateralionenkanalbewegung und Kanalfunktion mittels Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie. Um die bestmöglichen Daten zu erhalten, ist die Herstellung stabiler DIB-Membranen mit möglichst vielen gut getrennten Kanälen entscheidend, um Zeitreihen einzelner Partikel zu erhalten, die zufriedenstellend analysiert werden können.
Zu den kritischen Parametern, die optimiert werden müssen, gehören die Wahl des Lipids, die Lipidkonzentration in der Ölphase sowie die Protein- und Detergenzienkonzentrationen in den wässrigen Tröpfchen. Die verwendeten Lipide sind insofern ungewöhnlich, als sie bei tiefen Temperaturen keinen eindeutigen Phasenübergang zeigen. DPhPC ist ein häufig verwendetes Lipid zur Herstellung stabiler Membransysteme40. Prinzipiell kann jedes Lipid für diese Anwendung geeignet sein, das seine flüssige Umgebung bei niedrigen Temperaturen aufrechterhält. Außerdem sollte das Lipid nicht oxidationsempfindlich sein. Die Waschmittelkonzentration in den Tröpfchen sollte so gering wie möglich sein, um einen Blasenbruch der Membran zu vermeiden. Stabile Membranen und gute Proteineinbauraten werden in der Regel bei Detergenzienkonzentrationen unterhalb der kritischen Mizellenkonzentration (cmc) erreicht, da das Membranprotein nicht ausfällt.
Wenn die DIB-Membranen bestimmte Detergenzien21,41 nicht tolerieren oder wenn sich die Proteine nicht aus einer schwachen Detergenzienlösung in die DIB-Membranen integrieren, können die Proteinkanäle zunächst zu kleinen unilamellären Lipidvesikeln (SUVs) rekonstituiert werden, die dann von der Tröpfchenseite mit den DIB-Membranen fusioniert werden, wie für E. coli MscL 42 erfolgreich gezeigt wurde . Manchmal bilden sich DIB-Membranen nicht, weil die Lipidkonzentration in der Ölphase zu niedrig ist. Um zu verhindern, dass DIB-Membranen platzen, sollte man sich auch darüber im Klaren sein, dass der osmotische Druck zwischen dem Hydrogel und dem Tröpfchen exakt ausgeglichen sein muss, ohne denCa2+-Fluss von cis zu trans übermäßig zu beeinflussen. Optimierte Agarosedicke und Maschenweite scheinen entscheidend zu sein, um die Diffusion von Membranproteinen zu beobachten. Ein Austrocknen der Agaroseschicht sollte vermieden werden. Die Dicke kann mittels Rasterkraftmikroskopie17 bestimmt werden. Durch Variation der Agarosekonzentration, des Volumens und der Rotationsgeschwindigkeit während der Schleuderbeschichtung können die Maschenweite und Dicke des Hydrogels optimiert werden. Beachten Sie jedoch, dass die Dicke der Hydrogelschicht den Bildkontrast beeinflusst. Um Membranproteine in DIBs einzufangen, kann das Agarose-Hydrogel durch kundenspezifisch synthetisierte, unvernetzte, Ni-NTA-modifizierte, niedrigschmelzende Agarose ersetzt werden, um sie über einen His-Tageinzufangen 17. Ein zu hoher Fluoreszenzhintergrund wird häufig durch einen Bruch der DIB-Membranen verursacht. Dies ist insbesondere bei Multi-Well-Kammern ein Problem, da der Ca2+-empfindliche Farbstoff in das Hydrogel diffundiert. In diesem Fall sollten benachbarte Brunnen vermieden werden. Die Fluoreszenzbleiche des Ca2+-sensitiven Farbstoffs über der Membran sollte kein signifikanter limitierender Faktor sein, da sie durch unangeregte Farbstoffe im Großteil des Tröpfchens (Abbildung 3A) außerhalb des TIRF-evaneszenten Feldes ausgetauscht wird. Die Lokalisationsgenauigkeit für das Protein ergibt sich aus der Genauigkeit der Anpassung der Spots und der Pixelgröße.
Schwache Fluoreszenzsignale können durch einen niedrigen Ca2+-Fluss durch den Kanal verursacht werden. Mögliche Gründe sind: (i) ungenaue TIRF-Einstellungen (z.B. Laserintensität), (ii) der osmotische Ca 2+-Druck über der Membran oder (iii) die intrinsische Ca2+-Permeabilität der Kanäle ist zu gering. Um das erste Problem zu lösen, müssen die Laserintensität, der TIRF-Winkel und die Kameraverstärkung optimiert werden. Die beiden letztgenannten Probleme können durch das Anlegen eines elektrischen Potentials über die Membran 2,43 überwunden werden. Das Anlegen externer Spannungen kann das Ergebnis jedoch verfälschen, da elektrische Effekte die Kanalöffnung von ligandengesteuerten oder mechanosensitiven Ionenkanälen beeinflussen können, die eigentlich nicht spannungsgesteuert sind. Beispiele für solche Kanäle sind die mitochondriale Proteintranslokase TOM-CC27 und ihre kanalbildende Untereinheit Tom40 26,44,45,46. Schließlich ist anzumerken, dass es schwierig ist, Membranproteine in einer bestimmten Ausrichtung in DIB-Membranen einzufügen, um eine gewünschte Funktionalität zu erreichen, und dass quantitative Studien selten sind47,48. In einigen Fällen ist die Ausrichtung der integrierten Proteine zufällig. Dies ist ein ernstzunehmendes Problem für die Untersuchung von Membranproteinen, da bestimmte Membranproteine nur auf einer Seite der Membran aktiviert werden.
Die TIRF-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung von Einzelmolekülereignissen in planar gelagerten Membranen49. Beispiele hierfür sind die Assemblierung und Faltungswegaufklärung von Kanalproteinen wie α-Hämolysin50, Perfringolysin O51 und OmpG52. Diese Studien beinhalteten FRET als zusätzliche Technik. Darüber hinaus wurde zuvor die Aktivierung des mechanosensitiven Ionenkanals MscL durch mechanische Stimulation von geträgerten DIB-Doppelschichten42 unter Verwendung von Strommessungen untersucht. Basierend auf dieser Arbeit könnten zukünftige Studien die hier beschriebene Plattform mit Einzelmolekül-FRET-Experimenten kombinieren, um mechanosensitive Kanäle auf Einzelmolekülebene auf optische Weise zu adressieren17. Die Injektion von Puffer in das Tröpfchen, die Dehnung der inneren DIB-Monoschicht oder die gezielte Bindung einzelner Kanäle an das darunterliegende Hydrogel können verwendet werden, um nicht nur den physikalischen Mechanismus mechanisch aktivierter Kanäle, die auf Membranspannung und/oder -krümmung reagieren, wie für MscL und MscS, die zweiporige Domäne K+-Kanäle, TREK-1, weiter zu untersuchen. TREK-2 und TRAAK und PIEZO (zur Übersicht siehe53), aber auch lokale Bindung an das zelluläre Zytoskelett, wie für den berührungsempfindlichen Ionenkanal NOMPC54,55 gezeigt wurde.

Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie die Korrelation zwischen Membranmobilität und Ionenkanalpermeabilität von Membranproteinen in polymergestützten Droplet-Interface Bilayer (DIB)-Membranen untersucht werden kann 1,2,3.
Die vorliegende Technik ergänzt eine beeindruckende Reihe fortschrittlicher optischer und oberflächenanalytischer Werkzeuge, wie z. B. die Einzelpartikelverfolgung 4,5, die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie6,7 und die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie 8,9,10. Diese liefern wertvolle Einblicke in die dynamische Zusammensetzung und Struktur von Membranen, die membranbasierte Reaktionen beeinflussen11,12,13. Während die Bewegung und laterale Diffusion von Proteinen von der lokalen Dichte der Proteine in der Membran abhängt, können einzelne Proteinmoleküle auch in Lipid Rafts14 und durch Protein-Protein-Wechselwirkungen15,16 gefangen werden. Abhängig von den Proteindomänen, die aus der Membran in die extrazelluläre Umgebung oder das Zytosol ragen, kann die Proteinmobilität von hochmobil bis völlig unbeweglich variieren. Aufgrund der Komplexität der Membran und ihrer peripheren Strukturen ist es jedoch oft schwierig, das Zusammenspiel zwischen der Natur der lateralen Beweglichkeit und der Proteinfunktion zu entschlüsseln17.
DIB-Membranen haben sich als effiziente Plattform für biophysikalische Einzelmolekülanalysen von Membranproteinen erwiesen 18,19,20,21,22. Sie entstehen durch Selbstorganisation von Lipiden durch den Kontakt von wässrigen Tröpfchen mit hydrogelgestützten Substraten in einer Lipid/Öl-Phase. Ähnlich wie die üblicherweise verwendeten geträgerten Lipiddoppelschichten (SLBs)1,23,24,25 ermöglichen DIBs eine lokale Abstimmung der lateralen Beweglichkeit durch temporäre oder permanente Bindung von Proteinen an die Polymermatrix, wenn sie mit geeigneten Liganden funktionalisiertwerden 17. Letzteres kann als Modellsystem für biochemische Prozesse in Zellmembranen mit heterogener Proteinverteilung dienen10.
Der hier beschriebene experimentelle Ansatz beruht auf der Fluoreszenz von Ca 2+-sensitiven Farbstoffen, um den Ca 2+-Ionenfluss durch einzelne Kanäle in unmittelbarer Nähe der Membran 2,22 mittels TIRF-Mikroskopie zu messen. Dieser optische Ansatz begrenzt die Beleuchtung der Probe auf einen Abstand nahe der Membran, was aufgrund der physikalischen Eigenschaften des evaneszenten Anregungslichts zu einer deutlichen Reduzierung des Fluoreszenzhintergrunds führt. Letzteres ist eine Voraussetzung, wenn eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung für die Detektion einzelner Moleküle erforderlich ist. Im Gegensatz zu klassischen elektrophysiologischen Methoden26,27 sind keine Membranspannungen erforderlich, um den Ionenfluss durch einzelne Kanäle zu untersuchen. Darüber hinaus erfordert die Methode keine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Molekülen, die die laterale Bewegung der Kanäle in der Membran stören könnten.
Die Methode eignet sich besonders für die Untersuchung von Proteinkanälen, die in die Membran eingebettet sind, auf Einzelmolekülebene, ohne die klassische Elektrophysiologie zu verwenden. Mit Hilfe des mitochondrialen proteinleitenden Kanals TOM-CC von Neurospora crassa28,29,30 und OmpF, der die Diffusion kleiner hydrophiler Moleküle durch die äußere Membran von Escherichia coli17,31 unterstützt, zeigen wir, wie die Membranmobilitäten und Kanalaktivitäten der beiden Proteine untersucht und korreliert werden können. Wir vermuten, dass dieser Ansatz, obwohl er für TOM-CC und OmpF optimiert ist, leicht auf andere Proteinkanäle angewendet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01991</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective N.A. 0.25</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRL00102</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser, 100 mW&#160;&#160;</td>
			<td>Visitron</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;kta pure&#160;&#160;</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Protein purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay kit, Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelax 100 resin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>143-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MC1024452500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>87735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIB chamber&#160;</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>PMMA chamber for DIB membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital power meter and energy console</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>Laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>4720.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope to assess DIB membrane formation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8042.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera iXon Ultra 897</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor Ti70</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-8, CalciFluorTM</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-362561</td>
			<td>Ca2+-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French press cell disruption homogenizer</td>
			<td>Igneus</td>
			<td>Igneus 40000 psi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP filter</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>4878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1870.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 10 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X033.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X049.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 500 mL</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EY49.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Minitube&#160;</td>
			<td>HT200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>9205.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadcane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His Trap HP 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29051021</td>
			<td>Ni-NTA column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.04716.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLM spin coater&#160;</td>
			<td>Schaefer Tec</td>
			<td>SCV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List medical L/M-3P-A vertical pipette puller</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>57761-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 Stereomicroscope</td>
			<td>Wild</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab&#160;</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2022a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFil pipette tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoliter 2010 injector&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Nanoliter 2010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose, non-crosslinked</td>
			<td>Cube Biotech</td>
			<td>124115393</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-octyl-polyoxyethylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>6367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode sensor&#160; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>Sensor for laser power meter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronics</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative ultracentrifuge Optima</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td>
			<td>AHF</td>
			<td></td>
			<td>Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resource Q 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17117701</td>
			<td>Anion exchange column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil AR 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super LoLux camera</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>Stereomicrosope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>Gerhardt</td>
			<td>THL 500/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-E Fluorescence microscope&#160;&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8952.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath&#160;</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>RK 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>MD 4C NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White light source for epifluorescence illumination (100 W)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBF72655</td>
			<td>TIRF microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of lateral mobility and ion channel activity in lipid bilayers using total internal reflection fluorescence (tirf) microscopy

Hochauflösende bildgebende Verfahren haben gezeigt, dass viele Ionenkanäle nicht statisch sind, sondern hochdynamischen Prozessen unterliegen, darunter die vorübergehende Assoziation von porenbildenden und Hilfsuntereinheiten, laterale Diffusion und Clusterbildung mit anderen Proteinen. Der Zusammenhang zwischen lateraler Diffusion und Funktion ist jedoch nur unzureichend verstanden. Um dieses Problem anzugehen, beschreiben wir, wie die laterale Beweglichkeit und Aktivität einzelner Kanäle in geträgerten Lipidmembranen mit Hilfe der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) überwacht und korreliert werden kann. Die Membranen werden auf einem ultradünnen Hydrogel-Substrat unter Verwendung der Droplet-Interface-Doppelschicht-Technik (DIB) hergestellt. Im Vergleich zu anderen Arten von Modellmembranen haben diese Membranen den Vorteil, dass sie mechanisch robust sind und sich für hochempfindliche Analysetechniken eignen. Dieses Protokoll misst den Ca 2+-Ionenfluss durch einzelne Kanäle, indem die Fluoreszenzemission eines Ca2+-empfindlichen Farbstoffs in unmittelbarer Nähe der Membran beobachtet wird. Im Gegensatz zu klassischen Einzelmolekül-Tracking-Ansätzen werden keine fluoreszierenden Fusionsproteine oder Markierungen benötigt, die die laterale Bewegung und Funktion in der Membran stören können. Mögliche Änderungen des Ionenflusses, die mit Konformationsänderungen des Proteins einhergehen, sind nur auf die laterale Bewegung des Proteins in der Membran zurückzuführen. Repräsentative Ergebnisse werden mit dem mitochondrialen Proteintranslokationskanal TOM-CC und dem bakteriellen Kanal OmpF gezeigt. Im Gegensatz zu OmpF ist das Gating von TOM-CC sehr empfindlich gegenüber molekularem Einschluss und der Natur der lateralen Diffusion. Daher sind unterstützte Droplet-Interface-Doppelschichten ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Verbindung zwischen lateraler Diffusion und der Funktion von Ionenkanälen zu charakterisieren.

Die elektrodenfreie optische Einkanalaufzeichnung in Echtzeit zeigt das Zusammenspiel zwischen lateraler Proteinbewegung und der Funktion einzelner Ionenkanäle in DIB-Membranen. Die Rekonstitution des mitochondrialen TOM-Core-Komplexes (Abbildung 1A) in eine DIB-Membran (Abbildung 4D) zeigt eine starke zeitliche Korrelation zwischen lateraler Mobilität und Ionenpermeabilität (Abbildung 5A). Die TOM-CC-Anspritzung scheint empfindlich auf die Art der seitlichen Bewegung17 zu reagieren. Bewegte Kanäle zeigen durch ihre Poren einen Ca2+-Fluss und hohe Fluoreszenzpunktintensitäten. Eingeschlossene, sich nicht bewegende Moleküle weisen niedrige und mittlere Fluoreszenzintensitäten auf. Für die allgemeine Proteinimportpore der Mitochondrien TOM-CC zeigte dieser Einzelmolekülansatz eine starke zeitliche Korrelation zwischen lateraler Mobilität und Ionenpermeabilität, was darauf hindeutet, dass der TOM-CC-Kanal mechanosensitive Eigenschaften besitzt17. Ein seitlicher Stopp frei beweglicher TOM-CC-Moleküle geht mit einem teilweisen oder vollständigen Verschluss des TOM-CC-Kanals einher. Die Abbildung von DIB-Membranen mit OmpF (Abbildung 1E und Abbildung 4F), das fast vollständig in die Membran eingebettet ist, zeigt keine Stop-and-Go-Effekte (Abbildung 5B). Zufällige Stopps von OmpF sind nicht mit einer Änderung der Intensität und damit mit dem Schließen seiner Poren verbunden. Anhand der Fluoreszenzsignale38 kann die Positionsgenauigkeit der einzelnen Kanäle im Bereich zwischen 5 und 10 nm abgeschätzt werden. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Genauigkeit nicht erreicht werden kann, wenn die Kanäle aufgrund der beweglichen Verankerung mit dem Agarose-Hydrogel leicht wackeln, wie dies beispielsweise für die TOM-CC-Moleküle in einem Zwischenzustand mit einer mittleren Verschiebung von 120 nm gezeigt wird (Abbildung 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Abbildung 1: Isolierung von TOM-CC. (A) Kryo-EM-Struktur von N. crassa TOM-CC30,39. Mitochondrien eines N. crassa-Stammes, der ein Tom22 mit einem 6xHis-Tag enthielt, wurden in DDM solubilisiert und einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie (B) und Anionenaustauschchromatographie (C) unterzogen. (D) SDS-SEITE des isolierten TOM-CC. (E) Kristallstruktur (PDB, 1OPF) und (F) SDS-PAGE von gereinigtem E. coli OmpF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm der PMMA-Kammerbaugruppe. Schritt 1: Ein Glasdeckglas wird mit einem Agarose-Hydrogel geschleudert. Schritt 2: Das spinbeschichtete Deckglas wird in einer speziell angefertigten PMMA-Mikroskopiekammer montiert. Schritt 3: Zusätzliche niedrigschmelzende Agarose wird auf einer 35 °C heißen Heizplatte in die Einlassöffnung der PMMA-Kammer gegeben. Schritt 4: Lipid-Monoschichten werden um wässrige Tröpfchen an einer Puffer/Öl-Grenzfläche (links) und an der Agarose-Hydrogel/Öl-Grenzfläche (rechts) gebildet. Schritt 5: Einzelne wässrige Tröpfchen werden in die Vertiefungen der PMMA-Kammer pipettiert, um bei Kontakt der beiden Lipidmonoschichten eine Lipiddoppelschicht zu bilden. Schritt 6: Die Bildung der DIB-Membranen wird mittels Hofmann-Modulationskontrastmikroskopie validiert. Schritt 7: Bilder ausgewählter Bereiche der DIB-Membranen mit eingefügten Ionenkanälen werden mittels TIRF-Mikroskopie aufgenommen. Grün: 0,75% Agarose; gelb: 2,5 % Agarose mit Ca2+ Ionen; Magenta: Lipid-/Ölphase; dunkelblau: wässriger Tröpfchenpuffer, der Ca2+-empfindlichen Farbstoff und Protein enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Abbildung 3: Versuchsaufbau. (A) Schematische Darstellung einer DIB-Membran in einer PMMA-Well. Die Doppelschicht ruht auf einem ultradünnen 0,75%igen Agarosefilm, um die TIRF-Bildgebung des Ca 2+-Flusses durch einen Ionenkanal im Laufe der Zeit unter Verwendung eines Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs (Fluo-8) in trans zu ermöglichen. (B) Der Ca2+-Fluss wird ausschließlich durch den osmotischen Druck von cis nach trans gesteuert, was sowohl die Bestimmung der Position in der Membran als auch des offen-geschlossenen Zustands des Kanals ermöglicht. Bei dem hier gezeigten Kanal handelt es sich um den proteinleitenden Kanal TOM-CC der Mitochondrien von N. crassa 30. (C) Trajektorie eines einzelnen TOM-CC-Kanals. Grün: sich bewegender Kanal; Gelb: nicht beweglicher Kanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Abbildung 4: Bildgebung von TOM-CC und OmpF in DIB-Membranen . (A) DIB-Membran, aufgenommen mittels Hoffmann-Modulationskontrastmikroskopie, die die Doppelschicht-Kontaktfläche zwischen dem Hydrogel und dem Tröpfchen zeigt. (B) Gebrochene DIB-Membran abgebildet wie in (A). Pfeil, Rand der PMMA-Kammer. (C) DIB-Membran, abgebildet mittels TIRF-Mikroskopie ohne Proteinkanäle. (D) DIB-Membran mit rekonstituiertem TOM-CC, abgebildet mittels TIRF-Mikroskopie. Die weißen Quadrate markieren Flecken mit hoher (SH), mittlerer (SI) und niedriger (SL) Intensität. (E) Die Anpassung des Fluoreszenzintensitätsprofils der drei in (A) markierten Punkte an zweidimensionale Gaußsche Funktionen zeigt die Position einzelner TOM-CCs und des Ca2+ -Flusses durch den Kanal. (F) DIB-Membran mit rekonstituiertem OmpF. (G) Gaußsche Anpassung des in (F) markierten Fluoreszenzflecks. Im Gegensatz zum zweiporigen β-Barrel-Proteinkomplex TOM-CC weist das dreiporige β-Barrel-OmpF nur einen Permeabilitätszustand auf. Pixelgröße: 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Abbildung 5: Die Kanalaktivität korreliert mit der lateralen Beweglichkeit von TOM-CC. (A) Die Fluoreszenzamplitudenspur (oben) und die entsprechende Trajektorie (unten) von TOM-CC deuten darauf hin, dass die Aktivität des offen-geschlossenen Kanals von TOM-CC mit der lateralen Membranmobilität des Komplexes korreliert. Die Trajektorie weist drei Permeabilitätszustände auf. Grün: vollständig geöffneter Zustand; gelb: mittlerer Permeabilitätszustand; rot: Zustand des geschlossenen Kanals; roter Stern: TOM-CC wackelt im Zwischenzustand um etwa ±60 nm um seine mittlere Position. Die Positionsgenauigkeiten37, bezogen auf die Fluoreszenzsignale im vollständig geöffneten und mittleren Zustand, liegen im Bereich zwischen 5 nm und 10 nm. (B) Fluoreszenzamplitudenspur (oben) und entsprechende Trajektorie (unten) von OmpF. OmpF zeigt nur eine Intensitätsstufe an, unabhängig davon, ob sie in Bewegung oder gefangen ist. Die Trajektoriensegmente, die den Zeitperioden der gefangenen Moleküle entsprechen, sind grau markiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Puffer </td>
			<td colspan="3">Konzentrationen der Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 10 % (v/v) Glycerin, 300 mM NaCl und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (w/v) DDM, 10 % (v/v) Glycerin, 1 M Imidazol und 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1 % (w/v) DDM, 2 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1 % (w/v) DDM, 1 M KCl, 2 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Vor Gebrauch entgasen und durch einen 0,22 μm Filter leiten.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Pufferlösungen für die TOM-CC-Isolierung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Puffer </td>
			<td colspan="3">Konzentrationen der Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>PFUND*</td>
			<td colspan="3">1 % (w/v) Trypton, 1 % (w/v) NaCl und 0,5 % (w/v) Hefeextrakt</td>
			<td>1100 ml</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2 und ~750 Einheiten DNAse und 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 2 mM β-Mercaptoethanol und 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2 % (w/v) SDS, 500 mM NaCl und 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5 % (w/v) Octylpolyoxyethylen (Octyl POE), 1 mM EDTA und 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Vor Gebrauch sterilisieren.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Pufferlösungen für die OmpF-Isolierung.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video at J

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy Video (Video) | JoVE

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Ionenkanäle sind in biologischen Membranen nicht statisch. In dieser Arbeit stellen wir einen optischen Einzelmolekül-Ansatz vor, um die Verbindung zwischen lateraler Membrandiffusion und Ionenkanalfunktion zu entschlüsseln. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden besteht darin, dass eine Fluoreszenzmarkierung von Proteinen, die ihre laterale Bewegung und Funktion beeinträchtigen könnten, nicht erforderlich ist.Die Methode kann auf jeden Membranproteinkanal angewendet werden, bei dem freie oder eingeschränkte Diffusion für Organisation und Funktion wichtig ist. Füllen Sie zunächst 380 Mikroliter der DPhPC-Stammlösung in eine Glasdurchstechflasche und überlagern Sie die Lipidlösung mit Argon oder Stickstoffgas, um eine Lipidoxidation zu verhindern. Verwenden Sie einen möglichst geringen Gasstrom, um ein Verdampfen des organischen Lösungsmittels, in dem die Lipide gelöst sind, oder ein Spritzen der Lösungsmittelsprays aus der Durchstechflasche zu vermeiden.Trocknen Sie die Lipidprobe unter einem Stickstoffstrom und entfernen Sie das verbleibende organische Lösungsmittel unter Vakuum mit einer ölfreien Vakuumpumpe über Nacht. Lösen Sie den Lipidfilm in einer Hexadecan-Silikonöllösung auf, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette gleiche Mengen Hexadecan- und Silikonöl zu einer endgültigen Lipidkonzentration von 9,5 Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Legen Sie einige Glasdeckgläser in einen Deckglashalter aus Edelstahl und reinigen Sie sie in einem Glasbecher ca. 10 Minuten lang mit Aceton in einem Ultraschallreiniger.Spülen Sie die Deckgläser mit doppelt deionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrahl. Reinigen und hydrophylieren Sie außerdem ein Deckglas fünf Minuten lang in einem Plasmareiniger mit Sauerstoff. Montieren Sie ein plasmabehandeltes Deckglas auf einem Spin Coater und beschichten Sie das Deckglas mit einem Submikrometer dicken Agarosefilm, indem Sie langsam 140 Mikroliter erhitzte 0,75 % niedrigschmelzende Agarose mit einer 200-Mikroliter-Pipette bei 3.000 U/min für 30 Sekunden hinzufügen.Befestigen Sie das schleuderbeschichtete Deckglas mit der dünnen Schicht des Agarose-Hydrogels sofort an der Unterseite der PMMA-Kammer. Achten Sie darauf, dass das Agarose-Hydrogel nach oben zeigt. Befestigen Sie die Kanten des Deckglases mit transparentem Klebeband an der mikrobearbeiteten PMMA-Vorrichtung und legen Sie das Gerät auf eine auf 35 Grad Celsius erhitzte Heizplatte.Gießen Sie vorsichtig 200 Mikroliter 2,5%ige Agaroselösung in den Einlass der Kammer, ohne Luftblasen zu erzeugen. Decken Sie die Vertiefungen der PMMA-Kammer sofort mit etwa 60 Mikrolitern der Lipidöllösung ab, um die Bildung von Lipid-Monolagen an der Agaroseöl-Grenzfläche einzuleiten und ein Austrocknen der spinbeschichteten Agarose in den Vertiefungen der PMMA-Kammer zu vermeiden. Stellen Sie das Gerät für etwa zwei Stunden auf eine Kochplatte bei 35 Grad Celsius.Geben Sie etwa 20 Mikroliter Lipid-Hexadecan-Silikonöllösung in jede der mehreren mikrofabrizierten Vertiefungen in einer Tröpfchen-Inkubationskammer. Eine Mikrokapillarglasnadel mit einem Spitzenöffnungsdurchmesser von ca. 20 Mikrometern wird mit einem vertikalen oder horizontalen Mikropipettenzieher präpariert. Füllen Sie die Nadel mit etwa fünf Mikrolitern wässriger Injektionslösung, die 8,8 millimolare HEPES, sieben Mikromolare eines Fluoreszenzfarbstoffs, Fluo-8, 400 mikromolare EDTA, 1,32 molaren Kaliumchlorid- und 30 nanomolaren TOM-Kernkomplex oder alternativ 20 nanomolare OMPF enthält.Montieren Sie die Nadel mit der wässrigen Injektionslösung auf einen piezogetriebenen Nanoinjektor und injizieren Sie mit dem Nanoinjektor 100 bis 200 Nanoliter wässrige Tröpfchen in die Vertiefungen in der mit Lipidhexadecan-Silikonöllösung gefüllten Tröpfcheninkubationskammer. Lassen Sie die Bildung einer Lipidmonoschicht an der Grenzfläche des Tröpfchenöls etwa zwei Stunden lang zu, indem Sie die PMMA- und Tröpfcheninkubationskammern auf einer auf 35 Grad Celsius erhitzten Heizplatte warten. Übertragen Sie einzelne wässrige Tröpfchen manuell aus den Vertiefungen der Tröpfcheninkubationskammer in die Vertiefungen der PMMA-Kammer mit einer Einkanal-Mikroliterpipette mit einer 10-Mikroliter-Einwegspitze aus Polypropylen.Lassen Sie die Tröpfchen auf die Lipidmonoschichten an den Hydrogel-Öl-Grenzflächen sinken, um eine Lipiddoppelschicht zwischen den Tröpfchen und dem Agarose-Hydrogel zu bilden. Montieren Sie die PMMA-Kammer mit der Tröpfchenschnittstellendoppelschicht oder DIB-Membranen auf dem Probenhalter eines Inverslichtmikroskops und beurteilen Sie die Membranbildung mit einem 10-fachen Hoffman-Modulationskontrastobjektiv. Wenn sich DIB-Membranen gebildet haben, montieren Sie die PMMA-Kammer auf dem Probenhalter eines TIRF-Mikroskops, das mit einer konventionellen Lichtquelle für die Epifluoreszenzbeleuchtung, einem 488-Nanometer-Laser und einer rückwärtig belichteten Elektronenmultiplizierungs-CCD-Kamera ausgestattet ist, um eine Pixelgröße von etwa 0,16 Mikrometern zu erreichen.Fokussieren Sie den Rand einer DIB-Membran mit einem Objektiv mit 10-facher Vergrößerung unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einer hochintensiven Lichtquelle unter Verwendung eines GFP-Filtersets. Fokussieren Sie den gleichen Rand der DIB-Membran bei hoher Vergrößerung mit einem 100-fachen NA 1,49 apochromatischen Öl-TIRF-Objektiv, ebenfalls unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einer hochintensiven Lichtquelle unter Verwendung eines GFP-Filtersets. Ändern Sie die Filtereinstellung von GFP auf das Quadband-TIRF-Filterset, schalten Sie den 488-Nanometer-Laser ein und stellen Sie die Intensität des Lasers auf der Objektivlinse ein.Um einzelne Ionenkanäle sichtbar zu machen, stellen Sie den TIRF-Winkel und die Verstärkung der EM-CCD-Kamera so ein, dass die offenen Ionenkanäle in der DIB-Membran als kontrastreiche Fluoreszenzflecken auf dunklem Hintergrund erscheinen und das Signal-Hintergrund-Verhältnis ein Maximum erreicht. Stellen Sie sicher, dass die Flecken, die dem Kalziumionenfluss durch einzelne Ionenkanäle entsprechen, scharf bleiben und eine runde Form mit hoher Intensität in der Mitte haben, die zur Peripherie hin allmählich abnimmt. Überprüfen Sie, ob die fluoreszierenden Punkte scharf sind, um sicherzustellen, dass sich die Ionenkanäle in den DIB-Membranen rekonstituiert haben und sich seitlich in der Membranebene bewegen.Zeichnen Sie schließlich eine Reihe von Membranbildern auf, die eine ordnungsgemäße Verfolgung der Position und die Überwachung des offen-geschlossenen Zustands der einzelnen Ionenkanäle ermöglichen. Um die Art der lateralen Beweglichkeit und den Zustand der Kanalaktivität zu bestimmen, erfassen Sie ausreichend lange und gut abgetastete Trajektorien. Die Kryo-EM-Struktur von Neurospora crassa TOM-CC ist hier dargestellt.Mitochondrien aus einer N.crassa-Färbung, die ein TOM 22 mit einem 6-His-Tag enthielt, wurden in DDM solubilisiert und einer Nickel-NTA-Affinitätschromatographie und Anionenaustauschchromatographie unterzogen. Die SDS-PAGE der isolierten TOM-CC-Kristallstruktur und die SDS-PAGE des gereinigten E.coli OMPF, die zum Vergleich verwendet werden, sind hier dargestellt. Die fluoreszierende Amplitudenspur in der entsprechenden Trajektorie von TOM-CC deutet darauf hin, dass die Aktivität des offen-geschlossenen Kanals von TOM-CC mit der lateralen Membranbeweglichkeit des Komplexes korreliert.Die Amplitudenkurve zeigt drei Permeabilitätszustände an: vollständig geöffneter Zustand, der bewegten Kanälen entspricht, mittlerer Permeabilitätszustand, und geschlossener Kanalzustand, der nicht beweglichen Kanälen entspricht. TOM-CC wackelt im Zwischenzustand um etwa plus/minus 60 Nanometer um seine mittlere Position. Die Fluoreszenzamplitudenspur in der entsprechenden Trajektorie von OMPF sind hier dargestellt.OMPF zeigt im Vergleich zu TOM-CC nur eine Intensitätsstufe an, unabhängig davon, ob es sich in Bewegung oder gefangen befindet. Die Trajektoriensegmente, die den Zeitperioden der gefangenen Moleküle entsprechen, sind grau markiert. Wichtig ist, dass bei dieser Methode einzelne Membranproteine in einer intakten Membranumgebung analysiert werden.Die Dynamik von Membranproteinen wird auf absehbare Zeit ein Horizont für wissenschaftliche Untersuchungen bleiben. Wir erwarten, dass unsere Methode einen wesentlichen Beitrag zu diesem Bereich leisten wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes. Video (Video) | JoVE

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Forschung

Biochemie

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers Video (Video) | JoVE

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator Video (Video) | JoVE

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy Video (Video) | JoVE

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules Video (Video) | JoVE

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation Video (Video) | JoVE

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip Video (Video) | JoVE

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking Video (Video) | JoVE

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH Video (Video) | JoVE

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis Video (Video) | JoVE

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...